一種氨肽酶N抑制劑抑酶活性檢測(cè)試劑盒的開發(fā)

周奕婷，徐鑫悅，宋吉亮，李玉天，葛彬彬，王森森，房春燕，王學(xué)?。H坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東濰坊 261053）

氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）是半靜息態(tài)肝癌干細(xì)胞的生物標(biāo)志物[1]，增強(qiáng)APN 表達(dá)能促進(jìn)肝癌干細(xì)胞存活。普通肝癌細(xì)胞單用化療藥氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）處理，APN上調(diào)，隨之產(chǎn)生耐藥性，合用APN 抑制劑烏苯美司（ubenimex）能明顯增強(qiáng)5-FU、順鉑、阿霉素的細(xì)胞毒作用，減少肝癌腫瘤干細(xì)胞球形成[2-3]，提示靶向抑制APN 對(duì)于肝癌耐藥可能具有良好的治療效果。另外，APN 在腫瘤轉(zhuǎn)移方面也發(fā)揮著重要作用[4]，因此該蛋白是一個(gè)很好的抗腫瘤治療靶點(diǎn)[5]。

目前已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室從事小分子氨肽酶N 抑制劑的合成[6-8]，因此檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)氨肽酶N 的抑酶活性是必不可少的步驟。而原有的氨肽酶N 抑制劑抑酶活性檢測(cè)試劑盒的酶源是從豬腎小體中提取的氨肽酶，已有文獻(xiàn)表明，使用該試劑盒測(cè)定化合物抑酶活性不能準(zhǔn)確反映對(duì)人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。同時(shí)該試劑盒價(jià)格昂貴（Sigma，L6007），使用成本較高。因此本課題組開發(fā)了一種全新的方法，以人源的氨肽酶N 作為酶源，用于測(cè)定化合物的抑酶活性。我們從多種腫瘤細(xì)胞勻漿篩選到人白血病K562 細(xì)胞勻漿對(duì)APN 底物的催化能力最弱，使用該細(xì)胞以慢病毒過表達(dá)APN，并篩選到單克隆細(xì)胞株（K562-APN），以該細(xì)胞勻漿作為酶源用于化合物抑酶活性評(píng)價(jià)[10]。本文主要對(duì)該試劑盒的精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該試劑盒能否用于氨肽酶N 抑制劑的抑酶活性測(cè)定。

1 儀器與試藥

多功能讀板機(jī)SpectraMax M5（Molecular Devices），超聲細(xì)胞破碎儀（南京寧凱儀器有限公司），DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），HH-2 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司），離心機(jī)（Eppendorf）。L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺（Sigma，L9125），K562 細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)），烏苯美司（Sigma），Hyclone 1640 液體培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司），Excell 新生牛血清（上海依科賽生物制品有限公司）。

2 方法

2.1 精密度測(cè)定

以人白血病K562-APN 細(xì)胞勻漿為酶源，L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺為底物，測(cè)定烏苯美司對(duì)氨肽酶N 抑制作用的IC50。重復(fù)測(cè)定3 次，用變異系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。向96 孔板中分別加入90 μL 氨肽酶N 溶液和不同濃度梯度的烏苯美司溶液（25、50、100、200、400 μmol·L－1），37℃孵育5 min 后，加入10 μL 底物溶液。設(shè)置100%組（只加酶和底物），用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足體積至140 μL。37℃孵育1 h，用多功能讀板機(jī)測(cè)定405 nm 處的吸光度值，通過酶活力變化評(píng)價(jià)烏苯美司對(duì)氨肽酶N 的抑制作用，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算變異系數(shù)。

抑制率＝（OD100%組－OD抑制劑組）/OD100%組×100%

2.2 準(zhǔn)確度測(cè)定

在96 孔板中加入10 μL 底物，再分別加入0、20、40、60、80、100 μL 氨肽酶N，測(cè)量讀取吸光度。以氨肽酶N 加入量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，通過線性方程計(jì)算出氨肽酶N 加入量為10、30、50、70、90 μL 時(shí)的理論值。再另外加入10 μL 底物，分別加入10、30、50、70、90 μL氨肽酶N，孵育后，讀取吸光度，重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，測(cè)得的吸光度為實(shí)際值，計(jì)算準(zhǔn)確度。

2.3 穩(wěn)定性測(cè)定

取四管氨肽酶N，置于－20℃冰箱，分別反復(fù)凍融0、10、20、30 次，凍融后加入底物，37℃孵育后測(cè)定吸光度，重復(fù)進(jìn)行3 次，取平均值，用U＝[△A/（0.01t）]×D計(jì)算酶活力。

U為酶活力；△A為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；D為稀釋倍數(shù)，即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù)。

2.4 線性范圍測(cè)定

在96 孔板中加入10 μL 底物，再分別加入0、20、40、60、80、100、120 μL 氨肽酶N，用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足體積至120 μL，加入底物37℃孵育后，測(cè)定405 nm 處的吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2.5 Km 值測(cè)定

將10 μL 不同濃度的底物和10 μL 氨肽酶N 加入96 孔板，使底物的工作濃度分別為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mmol·L－1，37℃恒溫孵育5 min。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組不含氨肽酶N，用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足體積至100 μL，設(shè)置多功能讀板機(jī)孵育溫度為37 ℃，每分鐘測(cè)一次吸光度，共測(cè)15 min，即15 組數(shù)據(jù)。根據(jù)Lineweaver-Burk 公式計(jì)算：

1/V＝Km/Vm·1/[S]＋1/Vm

1/V為酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)；Km為米氏常數(shù)；1/[S]為底物濃度的倒數(shù)；Vm為最大反應(yīng)速度。

3 結(jié)果

3.1 精密度

重復(fù)測(cè)定3 次烏苯美司對(duì)APN 酶活的抑制率，測(cè)得IC50的均值為77.41，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32。變異系數(shù)CV為4.29%（＜15%），說(shuō)明3 組數(shù)據(jù)間變化小，試劑盒的重現(xiàn)性良好。

3.2 準(zhǔn)確度

以測(cè)得的實(shí)際吸光度與理論吸光度做差。殘差分別為△A1＝0.0102， △A2＝0.0037，△A3＝0.0122，△A4＝0.011，△A5＝0.0023。殘差均值△A＝0.0079，殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0045，標(biāo)準(zhǔn)化殘差δ*＝殘差的均值/殘差的標(biāo)準(zhǔn)差＝1.747，δ*遵從標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布N（0，1）。實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化殘差落在（－2，2）區(qū)間以內(nèi)，可在95%置信度將其判為正常實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，參與回歸直線擬合。以上數(shù)據(jù)表明，該試劑盒的準(zhǔn)確度好，能保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠性。

3.3 穩(wěn)定性

對(duì)試劑盒所用酶源的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，取四管氨肽酶N 于－20℃冰箱，分別反復(fù)凍融0、10、20、30 次后測(cè)定酶活性，重復(fù)測(cè)定3 次。在反復(fù)凍融5 次后酶活力開始有所下降，反復(fù)凍融30 次后酶活力下降了28.1%，且在凍融20 ～30次后酶活力趨于穩(wěn)定，說(shuō)明酶源的穩(wěn)定性良好。結(jié)果見圖1。

圖1 氨肽酶N 反復(fù)凍融對(duì)酶活力的影響Fig 1 Effect of repeated freezing and thawing on the enzyme activity of aminopeptidase N

3.4 線性范圍

以“2.4”項(xiàng)下測(cè)得的吸光度作圖，線性擬合后所得回歸方程Y＝0.0026X＋0.0285，R2＝0.9827。結(jié)果表明氨肽酶N 加入量在0 ～120 μL表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)，見圖2。

圖2 酶法測(cè)定氨肽酶N 的線性范圍Fig 2 Enzymatic determination of the linearity of aminopeptidase N

3.5 米氏常數(shù)Km

Km是酶促反應(yīng)最大速度一半時(shí)底物的濃度，Km越小說(shuō)明酶與底物的親和力越大。為了進(jìn)一步確認(rèn)該試劑盒提供的酶源與底物的親和力，本研究采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法測(cè)定該酶的Km值。通過檢測(cè)405 nm 處不同底物濃度孔每分鐘的吸光度值，計(jì)算每個(gè)濃度的反應(yīng)速率，見圖3。以底物濃度的倒數(shù)1/[S]作為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)作圖，線性擬合所得直線與橫坐標(biāo)1/[S]交點(diǎn)為－1/Km，見圖4。商品化試劑盒的Km為0.295 mmol·L－1，而該試劑盒的Km值為0.121 mmol·L－1，表明該試劑盒提供的酶與底物的親和力更大。

圖3 不同濃度底物的反應(yīng)速率Fig 3 Reaction rate of different concentrations of substrate

圖4 氨肽酶N 對(duì)L-Leu-P-nitroanilide 的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Fig 4 Kinetic constants of aminopeptidase N on L-Leu-P-nitroanilide

4 討論

由于當(dāng)前商品化的氨肽酶N 抑酶活性測(cè)定試劑盒價(jià)格昂貴，且所用酶源是從豬腎小體中提取，因此所測(cè)數(shù)據(jù)不能準(zhǔn)確反應(yīng)化合物對(duì)人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。

本文對(duì)課題組開發(fā)的試劑盒的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明變異系數(shù)CV＝4.29%符合CV＜15%的要求，說(shuō)明該試劑盒具有良好的精確度，能保證后續(xù)開展實(shí)驗(yàn)的合理可靠性[11]。在準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)化殘差δ*＝1.747，δ*遵從標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布N（0，1），落在（－2，2）區(qū)間以內(nèi)，在95%置信度內(nèi)是正常試驗(yàn)點(diǎn)，說(shuō)明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠[12-13]。酶作為一種生物催化劑，能夠以較少的量進(jìn)行快速有效的反應(yīng)，同時(shí)其反應(yīng)有最適溫度及pH，因此酶的保藏溫度都是低溫保藏。而在長(zhǎng)時(shí)間的使用過程中常會(huì)進(jìn)行反復(fù)凍融，加之沉降作用，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)酶促效率的降低，本研究結(jié)果表明，氨肽酶N 于－20℃冰箱和室溫反復(fù)凍融5 次后酶活力開始下降，凍融20 ～30 次后酶活力趨于穩(wěn)定，酶活力反復(fù)凍融30 次后下降28.1%，穩(wěn)定性良好。驗(yàn)證試劑盒的生物參考區(qū)間的結(jié)果表明，當(dāng)?shù)孜餅?0 μL，氨肽酶N ≤120 μL 時(shí)測(cè)定的結(jié)果是可靠的。Km結(jié)果表明該試劑盒提供的酶與底物的親和力更大，能更準(zhǔn)確反映化合物對(duì)人源氨肽酶N 的抑酶活性。

以上評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)表明本課題組開發(fā)的試劑盒，能準(zhǔn)確測(cè)定化合物對(duì)人源氨肽酶N 的抑酶活性。同時(shí)K562 細(xì)胞為懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，適合大規(guī)模培養(yǎng)，能夠大量得到酶源，成本低廉。本試劑盒的抑酶活性評(píng)價(jià)方法，已開始在小范圍應(yīng)用，數(shù)據(jù)可靠，反饋良好，具備推廣應(yīng)用及開發(fā)價(jià)值。