鹽酸左氧氟沙星緩釋片的制備及藥物釋放影響因素的考察

鄭紅，宋立倩，房東陽（樂普制藥科技有限公司，浙江 臺州 318000）

左氧氟沙星（Levo）是第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，它是氧氟沙星的L型-光學活性異構(gòu)體，Levo 的抑菌活性是外旋體的2 倍，是其右旋體的8 ～128 倍[1]。與氧氟沙星相比，Levo 對需氧的革蘭氏陽性球菌抑菌活性更強，對非典型病原體作用更強，且口服后吸收速度快，在全身組織均有分布，具有較高的生物利用度，作用更加長效，用藥安全性高[2]。其作用機制是通過抑制細菌DNA 旋轉(zhuǎn)酶的活性，阻止細菌DNA 的合成和復制而導致細菌死亡[3]。Levo 適用于敏感菌感染，對較深部位的感染療效更好。在臨床上，Levo 主要用于治療呼吸、泌尿、生殖系統(tǒng)及皮膚軟組織等輕至重度感染[4]。目前，國內(nèi)市場上市的Levo 制劑主要有注射劑、片劑和膠囊劑，暫無市售的緩控釋制劑。另外，Levo 是一種濃度依賴性抗菌藥物[5]，其對各類細菌的最低抑菌濃度（MIC）值均較低[6]，革蘭氏陽性菌的MIC在0.06 ～64 mg·L－1，革蘭氏陰性菌的MIC在0.05 ～16 mg·L－1。

緩釋制劑相比普通制劑，可以有效控制藥物釋放，更長時間維持Levo 的有效濃度，延長藥物與細菌的接觸時間，更好的發(fā)揮藥效；并明顯減少每日服藥次數(shù)，增強患者的順應性；而普通制劑因不能控制藥物釋放在釋藥過程中容易產(chǎn)生較大的血藥濃度波動—— “峰谷”效應，引起患者的不良反應，嚴重者甚至可能死亡[7]。因此，將Levo 制備成緩釋片可以使血藥濃度更加平穩(wěn)，增強Levo 在臨床使用中的耐受性、安全性及順應性。

因此，本實驗選擇鹽酸左氧氟沙星（Levo-HCl）為模型藥物，以羥丙甲基纖維素（HPMC）、乙基纖維素（EC）、微晶纖維素（MCC）、乳糖（Lac）為主要輔料，制備Levo-HCl 緩釋片。在臨床，根據(jù)患者的體質(zhì)，成人患者的Levo-HCl片每日用量在300 ～600 mg，因此本文擬制備劑量為300 mg 的Levo-HCl 緩釋片。

1 材料

1.1 儀器

FB7015 分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；TDP 型單沖壓片機（上海天翔健臺制藥機械有限公司）；RC-8DS 型藥物溶出度測定儀（天津市國銘醫(yī)藥設備有限公司）；UV-9100 型紫外-可見分光光度計（上海元析分析儀器公司）；LC-100 高效液相色譜儀（輝世儀器設備有限公司）。

1.2 試藥

環(huán)丙沙星對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：99%，批號：130451-201904）；鹽酸左氧氟沙星原料藥（質(zhì)量分數(shù)：99.8%，鄭州艾克姆有限公司）；鹽酸左氧氟沙星片（廣東彼迪藥業(yè)有限公司同，規(guī)格：100 mg/片，批號：20180512）；Levo-HCl 緩釋片（自制）；HPMC、EC（上海卡樂康公司）；MCC（鄭州艾克姆有限公司）；Lac（天津市大茂試劑廠）；硬脂酸鎂（天津市大茂試劑廠）。

2 方法

2.1 Levo-HCl 釋放度測定

按照《中國藥典》2020年版通則0931 第一法釋放度測定法，取6 片自制Levo-HCl 緩釋片，溶出溫度控制為（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，溶出介質(zhì)為900 mL 鹽酸溶液。在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 分別取溶液5 mL，并即時補充恒溫溶出介質(zhì)5 mL，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液稀釋適當倍數(shù)，利用紫外-可見分光光度法，在294 nm 的波長處測定樣品吸光度，計算釋放度。

2.2 Levo-HCl 緩釋片的制備

按處方量稱取Levo-HCl（過100 目篩）、HPMC（過80 目篩）、EC（過80 目篩）、MCC（過80 目篩）、Lac（過80 目篩）并充分混合30 min，加入黏合劑（60%乙醇水溶液）適量，制備軟材，過20 目篩，所制成的濕顆粒于40℃烘箱中干燥2 h，過20 目篩整粒，再加入硬脂酸鎂適量，充分混合30 min。分別稱取500 mg 混合物料進行壓片，得到片劑，調(diào)整片劑的硬度在6 ～8 kg，片重為490 ～500 mg。

2.3 單因素考察

2.3.1 不同種類的HPMC 對藥物釋放的影響其他組分不變時，按表1中F1、F2、F3 處方進行稱量，考察不同種類的HPMC（HPMC K4M、HPMC K15M、HPMC K100M）對片劑中藥物釋放的影響。

2.3.2 不同用量的HPMC 對藥物釋放的影響 其他組分不變時，按表1中F1、F4、F5 處方進行稱量，考察不同用量的HPMC（含量分別是5%、15%、25%）對片劑中藥物釋放的影響。

2.3.3 不同用量的EC 對藥物釋放的影響 其他組分不變時，按表1中F4、F6、F7、F8 處方進行稱量，考察不同用量的EC（含量分別是0%、5%、10%、15%）對片劑中藥物釋放的影響。

2.3.4 不同比例的MCC 與Lac 對藥物釋放的影響 其他組分不變時，按表1中F7、F9、F10處方進行稱量，考察不同比例的MCC 與Lac（MCC 與Lac 比例分別是2∶1、1∶1、1∶2）對片劑中藥物釋放的影響。

表1 鹽酸左氧氟沙星緩釋片處方(%)Tab 1 Formulation of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets (%)

2.4 正交設計法優(yōu)化處方工藝

在單因素考察的基礎上，將影響Levo-HCl緩釋片釋放行為的關鍵因素，利用正交實驗表[8]，以自制緩釋片與一級動力學釋放行為擬合的相關系數(shù)（r2）（n＝6）作為評價指標，評價處方的優(yōu)劣。

2.5 最優(yōu)處方重現(xiàn)性考察

按照最優(yōu)處方工藝制備3 批Levo-HCl 緩釋片，對片劑的外觀、機械性質(zhì)分別進行測定；按照“2.1”項下方法測定片劑中藥物的體外釋放度，并將釋放度與一級動力學的相關系數(shù)作為評價指標，采用相似因子?2法對3 批自制制劑進行批間相似性評價，以考察處方、工藝的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.6 Beagle 犬體內(nèi)藥物動力學研究

2.6.1 樣品的采集 采用雙周期交叉給藥的實驗方案，將8 只健康Beagle 犬作為受試的實驗動物。禁食12 h 后給藥，隨機分為兩組，空腹抽取空白血4 mL。其中參比制劑為市售普通片，每次給藥3 片（每片100 mg，以C18H20FN3O4計）；受試制劑為自制緩釋片，每次給藥一片（每片300 mg，以C18H20FN3O4計），均用50 mL 溫開水送服。服藥4 h 后統(tǒng)一給食并自由飲水，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、16、24 h 于前肢靜脈取血3 mL 置肝素抗凝管內(nèi)，3500 r·min－1離心15 min。取上層血漿，將樣品放置于－20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 血漿樣品的處理與測定 用1.5 mL 離心管精密稱取空白血漿0.45 mL，精密加入質(zhì)量濃度 為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μg·mL－1的Levo-HCl 溶液（精密稱取Levo-HCl適量，將樣品倒于100 mL 棕色量瓶中，用HCl溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得）50 μL。加入環(huán)丙沙星內(nèi)標溶液（精密稱取環(huán)丙沙星對照品約30 mg，將樣品倒于50 mL 棕色量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻即得）50 μL，渦旋混勻后加入5%的高氯酸0.5 mL，渦旋1 min，離心2 次，轉(zhuǎn)速為12 000 r·min－1，每次10 min，取上清液20 μL，進樣測定，記錄樣品的色譜圖和峰面積[9]。質(zhì)量濃度C為橫坐標，主藥與內(nèi)標的峰面積比S為縱坐標，線性擬合得回歸方程S＝0.0586C＋0.0021，r2＝0.9908，線性范圍為0.25 ～32.0 μg·mL－1。以S/N＝10 計算，定量限為40 μg·mL－1。

用1.5 mL 離心管精密稱取含藥血漿0.5 mL，按“2.6.2”項下方法操作，記錄樣品的色譜圖，計算各時間點的血藥濃度，并用DAS 2.0 軟件程序計算藥動學參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 HPMC 種類對藥物釋放的影響

選擇不同種類的HPMC 制備片劑，其累計釋放情況見圖1。

圖1 HPMC 種類對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 1 Effect of types of HPMC on drug release（n ＝6）

由圖1可見，不同種類的HPMC 對藥物釋放速度的影響十分顯著，不同種類的HPMC 對于片劑的緩釋效果排名如下：HPMC K100M ＞HPMC K15M ＞HPMC K4M。這是因為不同型號的HPMC 黏度不同，隨著HPMC 黏度的增大，吸水后形成的凝膠層強度增大，凝膠層的骨架溶蝕速率減慢，藥物釋放速度明顯下降，實驗結(jié)果與相關文獻報道的結(jié)果一致[10]。另外，在釋放的初期（前2 h），3 種緩釋材料所呈現(xiàn)的釋放曲線行為極為相似，推測與藥物溶解度較大與沒有充足的時間形成凝膠骨架有關。另外，片劑在2 h時釋放大于50%，推測產(chǎn)生“突釋”現(xiàn)象與藥物具有良好的溶解度有關。綜合考慮，選擇在處方中加入HPMC K100M 作為緩釋材料。

3.2 不同用量的HPMC K100M 對藥物釋放的影響

選擇不同用量的HPMC K100M 制備片劑，其累計釋放結(jié)果見圖2。由圖2可見，不同用量的HPMC K100M 對于藥物釋放速率有明顯的影響，HPMC K100M 用量越多，片劑吸水后形成的凝膠層越厚，強度越大，骨架的溶蝕速率越慢，藥物釋放速度越慢。當HPMC 含量為5%時，藥物在8 h 釋放超過90%，藥物釋放過快；當HPMC 含量為25%時，藥物在12 h 時釋放80%，藥物釋放不完全，而且后期釋放速度明顯下降，藥物無法完全釋放。綜合考慮，選擇在處方中加入15%的HPMC K100M。

圖2 不同HPMC K100M 含量對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 2 Effect of different amounts of HPMC K100M on the drug release（n ＝6）

3.3 不同用量的EC 對藥物的釋放的影響

選擇不同用量的EC 制備片劑，其累計釋放結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同用量的EC 對于藥物釋放有顯著的影響。EC 在處方中的作用是減少孔道形成。當不加EC 時，藥物釋放的最快，隨著EC 的用量增多，由HPMC K100M 形成的凝膠層的孔道變少，藥物的釋放減緩。當EC 含量為10%和15%時，片劑的溶出曲線相似，證明EC 超過10%時，對于片劑的釋放影響極小。綜合考慮，在處方中EC 的含量為10%。

圖3 不同EC 含量對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 3 Effect of different amounts of EC on the drug release（n ＝6）

3.4 不同比例的MCC 與Lac 對藥物釋放的影響

選擇不同比例的MCC 與Lac 制備片劑，其累計釋放結(jié)果見圖4。由圖4可知，MCC 與Lac在處方中起到填充劑的作用，MCC 與Lac 比例的改變對于片劑的釋放影響不大，僅有細微差距。綜合考慮，選擇填充劑MCC 與Lac 的比例為1∶1。

圖4 不同MCC 與Lac 比例對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 4 Effect of different ratio of MCC∶Lac on the drug release（n＝6）

3.5 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素考察結(jié)果，HPMC 種類和用量、EC 用量對釋放影響較大。最終選擇HPMC K100M 用量（A）、EC 用量（B）兩個關鍵因素進行正交實驗設計，按照正交設計表進行實驗（見表2），進行兩因素三水平正交實驗，結(jié)果見表3。

表2 鹽酸左氧氟沙星緩釋片正交實驗因素水平表Tab 2 Factor and level of orthogonal experimental for levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets

表3 正交實驗分析結(jié)果(n ＝6)Tab 3 Orthogonal experimental design (n ＝6)

通過極差分析結(jié)果可知，兩種因素對體外藥物累計釋放的影響大小排序為：A ＞B，主要是因為HPMC K100M 是一種水溶性材料并且黏度較大，是緩釋片形成凝膠骨架的主要材料，HPMC K100M 的用量直接決定著凝膠層的厚度與強度，控制藥物的釋放。而EC 是一種不溶于水的材料，對于片劑起到調(diào)節(jié)釋放的作用，主要通過控制擴散路徑的多少、大小進而改變藥物的釋放速率，EC 的用量對于藥物的釋放具有一定的影響。通過直觀分析法對實驗結(jié)果進行處理，得到最優(yōu)處方組成為A2B3，即HPMC K100M 的處方用量為15%，EC 的處方用量為10%。

3.6 最優(yōu)處方、工藝重現(xiàn)性考察

基于正交設計實驗得到的最優(yōu)化處方為Levo-HCl 60%，HPMC K100M 15%，EC 10%，MCC 7.5%，Lac 7.5%。以最優(yōu)處方為基礎，制備3 批Levo-HCl 緩釋片，所制備的片劑外觀光澤，表面規(guī)整，機械性能（包括硬度、脆碎度）符合藥典規(guī)定，片劑的含量差異性較小，符合固體制劑相關要求。

將3 批自制緩釋片進行體外釋放度實驗，結(jié)果見圖5。采用?2相似因子法對3 批自制制劑進行批間相似性評價，結(jié)果見表4。3 批自制Levo-HCl 緩釋片的體外釋放曲線相似性良好，f2均大于50。3 批自制片在0 ～12 h 內(nèi)藥物呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢，證明所得到的優(yōu)化處方合理可靠，工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

圖5 最優(yōu)處方3 批制劑體外釋放曲線（n ＝6）Fig 5 Release profile of 3 batches of optimized formulation（n ＝6）

表4 最優(yōu)處方3 批制劑體外釋放?2 (n ＝6)Tab 4 ?2 of 3 batches of optimized formulation (n ＝6)

3.7 Levo-HCl 緩釋片在Beagle 犬體內(nèi)藥動學研究

3.7.1 藥動學參數(shù)及計算 將平均血藥濃度（C）對時間（t）作圖，結(jié)果如圖6所示；采用DAS 2.0 藥物動力學軟件對不同時間點的血藥濃度數(shù)據(jù)進行非隔室模型擬合，計算主要藥動學參數(shù)，結(jié)果如表5所示。

圖6 Levo-HCl 緩釋片平均血藥濃度-時間曲線（n ＝8）Fig 6 Mean plasma concentration-time curve of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablet（n ＝8）

表5 Levo-HCl 緩釋片主要藥動學參數(shù)(x ±s，n ＝8)Tab 5 Main pharmacokinetic parameters of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablet (x ±s，n ＝8)

3.7.2 體內(nèi)外實驗相關性評價 生物利用度是考察藥物制劑質(zhì)量是否合格的重要指標之一，但生物利用度的測定要求較高，常需要在人體內(nèi)進行實驗研究，無法作為一般產(chǎn)品的質(zhì)量控制手段。而體外釋放在很大程度上可以反映藥物在體內(nèi)吸收情況，但需證明其合理性，即體外釋放度與生物利用度具有良好的相關性。根據(jù)查閱相關文獻可知[11-12]，可以通過擬合處理體外累計釋放度與體內(nèi)吸收分數(shù)（Fa）得到兩者相關性。

體內(nèi)吸收分數(shù)主要根據(jù)給予某種制劑后測定血藥濃度-時間的數(shù)據(jù)得到（見表6），根據(jù)Wagner-Nelson 方程計算，公式如下：

表6 鹽酸左氧氟沙星緩釋制劑的血藥濃度(x±s，n ＝8)Tab 6 Plasma concentration of levofloxacin hydrochloride sustained-release preparation (x±s，n ＝8)

Fa＝（Ci＋KeAUC0→t）/KeAUC0→∞×100%

其中Ci為t時間下的血藥濃度；Ke為消除速率常數(shù)。

采用表7中自制緩釋片體外釋放百分率（Fr）與Fa進行線性回歸，可得回歸方程為Fa＝1.1106F＋0.1397（R2＝0.9906），結(jié)果表明F與Fa具有良好的相關性，體外釋放度可以在一定程度上反映藥物在體內(nèi)的吸收情況。

表7 鹽酸左氧氟沙星緩釋制劑藥物釋放體內(nèi)外相關性Tab 7 Drug release of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets in vitro and in vivo

3.7.3 相對生物利用度計算 以非隔室模型統(tǒng)計結(jié)果中的AUC0→t數(shù)據(jù)，計算與參比制劑同劑量的Levo-HCl 緩釋片的相對生物利用度（F）。

相對生物利用度計算公式如下[13]：

F＝[AUC0→t（T）/DT]/[AUC0→t（R）/DR]×100%

其中，T、R 分別代表受試片和參比緩釋片。

經(jīng)計算可知，自制Levo-HCl 緩釋片對市售片Beagle 犬體內(nèi)的平均相對生物利用度為91.61%。

4 結(jié)論

本文的模型藥物為Levo-HCl，通過正交設計制備具有良好緩釋能力的凝膠骨架片。采用單因素實驗確定了影響藥物釋放的重要因素，并以自制片與一級動力學釋放行為的相關系數(shù)作為評價指標，采用正交實驗設計對處方工藝進行優(yōu)化，最佳處方組成為Levo-HCl 60%、HPMC K100M 15%、EC 10%、MCC 7.5%、Lac 7.5%。最終自制Levo-HCl 緩釋片在12 h 內(nèi)呈現(xiàn)一級藥動學釋放特征，可降低血藥濃度波動。同時自制片在Beagle 犬的藥動學研究結(jié)果表明，自制Levo-HCl緩釋片與市售普通片相比，具有緩釋效果，相對生物利用度為91.61%。