包載姜黃素的羧甲基化白及多糖-殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合膜對(duì)大鼠口腔潰瘍的治療作用研究

王玉蓉，巨佳，王濟(jì)，趙慧雯，林瑤，黃靜，薛曉娟，馮斌，成黎霏*（.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 藥劑科，西安70032；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 72046）

口腔潰瘍屬于中醫(yī)中口瘍、口瘡的范疇[1]，是一種常發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，通常具有自發(fā)性和復(fù)發(fā)性[2]?？谇粷儠?huì)導(dǎo)致疼痛，嚴(yán)重影響患者飲食和說話，降低患者的生活質(zhì)量[3-4]。

姜黃素（curcumin，Cur）是從姜科植物姜黃的干燥根莖中提取的主要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗病毒、抗感染等藥理活性，且不良反應(yīng)少[5]。近幾年有研究表明Cur 對(duì)口腔疾病牙周炎[6]和口腔潰瘍[7]等有顯著效果。但因其幾乎不溶于水，生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用。

本課題組前期采用生物可降解性的白及多糖（Bletilla striatapolysaccharide，BSP）和殼聚糖（chitosan，CS）為原材料，通過醚化法[8]對(duì)BSP進(jìn)行羧甲基化改性，改性后的BSP 與帶正電的CS 通過靜電作用[9]形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，制備了用于治療口腔潰瘍的載有Cur 的羧甲基化白及多糖-殼聚糖（CMBSP-CS）聚電解質(zhì)復(fù)合膜。

本研究采用冰醋酸灼傷化學(xué)方法[10]建立大鼠口腔潰瘍模型，通過HE 染色法考察前期制備的包載Cur 的CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜[11]對(duì)大鼠口腔潰瘍愈合的影響，通過ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清和組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的變化，以期明確CMBSP-CS 對(duì)大鼠口腔潰瘍的治療作用及其可能的作用機(jī)制，為該制劑的應(yīng)用研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量（200±20）g [第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）2012-0007]。

1.2 試藥

包載Cur 的CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜[實(shí)驗(yàn)室自制，平均厚度為（74.0±2.0）μm，載藥量為95.41%，體外累積釋放度可達(dá)93.78%]，空白膜（實(shí)驗(yàn)室自制）；大鼠TNF-αELISA 試劑盒（F18960）、IL-6 ELISA 試劑盒（F1887）、IL-1βELISA 試劑盒（F1917）、BCA 試劑盒（W1117）（上海西唐生物科技有限公司）；山羊封閉血清（中杉金橋）；Triton（Sigma 公司）；NP-40 裂解液、P0413F（上海碧云天）；醋酸（批號(hào)：190522，富宇精細(xì)化工）；生理鹽水（批號(hào)：190506，山東科倫）；水為純化水（實(shí)驗(yàn)室自制）；水合氯醛、多聚甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器

DW-86L386－80℃超低溫冰箱（海爾）；Leica RM2125RTS 石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡）；AX-84 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）；DENLEY DRAGON Wellscan MK3 酶標(biāo)儀、Wellwash 4 MK2洗板機(jī)（芬蘭Thermo）；PYX-DHS，4002×500數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；TGL-168、11-07 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；20 ～200 μL 移液槍（Thermo labsystems）；XW-80A 漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；DHG-9023A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；0.1 ～50 mL 連續(xù)分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group）；高通量組織研磨器（寧波新芝）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

將72 只雄性大鼠放在晝夜交替、溫濕度分別為（24±2）℃和40%～60%的房間適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后稱重，隨機(jī)分成正常組、模型組、空白膜組和藥膜組，每組18 只。模型組、空白膜組和藥膜組用 10%水合氯醛溶液按照0.3 mL/100 g腹腔注射給藥用于麻醉，將直徑為 5 mm 的脫脂棉球塞入內(nèi)徑為0.5 cm 的移液槍槍頭中，用50 μL 50%醋酸溶液浸潤(rùn)后垂直緊貼于大鼠下唇口腔黏膜表面處，持續(xù)按壓 60 s 后移除棉球并用 5 mL 生理鹽水連續(xù)沖洗，以此建立大鼠口腔潰瘍模型。正常組則使用生理鹽水代替，其余操作不變。造模 24 h 后，觀察大鼠造模區(qū)局部黏膜的情況，如果形成約為0.5 cm 的潰瘍，且周圍有充血、紅腫和假膜則表明潰瘍成功形成[12-13]。

2.2 給藥方法

大鼠在給藥前，采用10% 的水合氯醛腹腔麻醉，將空白復(fù)合膜與CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜裁剪為0.5 cm2大小備用，給藥時(shí)貼于大鼠口腔潰瘍患處，輕壓20 s 以保證膜劑與患處貼合緊密。造模成功當(dāng)日開始給藥，每日給藥一次，連續(xù)給藥7 d。正常組與模型組麻醉后不做處理。用藥后2 h 內(nèi)禁食禁水，其余時(shí)間自由進(jìn)食進(jìn)水[12]。

2.3 大體觀察

造模成功后觀察動(dòng)物外觀、精神及一般狀況的變化，肉眼觀察各組潰瘍愈合程度，每日測(cè)量并記錄大鼠體質(zhì)量的變化。

2.4 大鼠潰瘍局部組織和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量測(cè)定

各組于造模成功后第3日和第7日各隨機(jī)選取6 只動(dòng)物眼眶取血后處死。待血液凝固后，4000 r·min－1離心5 min，分離血清，分裝保存于－80℃?zhèn)溆?。藥膜組、空白膜組和模型組切取潰瘍組織黏膜，正常組切取正常黏膜，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗組織以去除殘留血液，將黏膜剪碎后置于 EP 管中稱重后加入NP-40 裂解液，用細(xì)胞超微粉碎機(jī)對(duì)黏膜進(jìn)行充分粉碎。將粉碎得到的組織勻漿置于高速離心機(jī)中4℃、5000 r·min－1離心20 min 后用移液器移取上清液后分裝保存于－80℃冰箱中備用，按 ELISA 試劑盒說明書操作進(jìn)行上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測(cè)定。

2.5 潰瘍組織病理學(xué)觀察

各組于造模成功后第3日與第7日各隨機(jī)選取3 只大鼠處死取得黏膜標(biāo)本后，將黏膜標(biāo)本用生理鹽水沖洗干凈后立即放入 4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，用石蠟對(duì)組織進(jìn)行包埋后，連續(xù)4 μm切片，HE 染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sigma Plot 12.5 軟件作出圖像分析。

3 結(jié)果

3.1 CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜對(duì)口腔潰瘍愈合的作用

3.1.1 大體觀察 對(duì)大鼠精神狀況、毛發(fā)和運(yùn)動(dòng)的觀察采用盲法進(jìn)行，觀察結(jié)果顯示，正常組大鼠反應(yīng)靈敏，背毛光澤，二便和活動(dòng)正常；模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，口唇邊潮濕，流口水，毛發(fā)粗糙分叉，大便偏??；給藥組反應(yīng)靈敏，背毛光澤，活動(dòng)正常。

3.1.2 體質(zhì)量變化 造模第3日，與正常組比較，模型組、藥膜組與空白膜組大鼠體質(zhì)量變化顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，藥膜組體質(zhì)量變化顯著升高（P＜0.05）。說明醋酸處理使大鼠產(chǎn)生疼痛與不適導(dǎo)致了大鼠體質(zhì)量下降，給予一次藥膜能夠減少大鼠的體質(zhì)量下降。

第4日，與模型組相比，藥膜組大鼠體質(zhì)量變化顯著升高（P＜ 0.05），與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，給予兩次藥膜處理能夠使大鼠體質(zhì)量變化恢復(fù)到正常水平。第5日，與模型組相比，空白膜組大鼠體質(zhì)量變化有顯著上升趨勢(shì)，與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

第6 ～8日，各組大鼠體質(zhì)量間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示實(shí)驗(yàn)開始6 d 后口腔潰瘍對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響消失（見圖1）。

3.1.3 創(chuàng)面愈合情況 成功建模后第 3、5、7日分別觀察各組大鼠口腔潰瘍情況（觀察前用純凈水沖洗各組潰瘍處，去除藥膜等殘留物以便觀察）。結(jié)果顯示，正常大鼠各時(shí)間點(diǎn)口腔黏膜表面光滑，無水腫，無充血現(xiàn)象（見圖2A ～C）；建模后第3日，模型組、空白膜組和藥膜組造模區(qū)黏膜水腫，形成黃白色假膜（見圖2D、G、J）。建模后第 5日，空白膜組黃白色假膜變?。ㄒ妶D2H）；藥膜組黃白色假膜已經(jīng)完全脫落，腫脹程度減輕，組織周圍充血減輕（見圖2K）；建模后第7日，模型組黃白色假膜未完全脫落（見圖2F）；空白膜組黃白色假膜完全脫落（見圖2I）；藥膜組有明顯的愈合現(xiàn)象，腫脹現(xiàn)象基本消失，周圍組織充血消失（見圖2L）。結(jié)果表明，藥膜組口腔潰瘍愈合速度最快，說明載藥復(fù)合膜治療能夠明顯加速口腔潰瘍的愈合；其次為空白膜組，說明膜材中的CMBSP-CS 對(duì)口腔潰瘍的愈合有一定的促進(jìn)作用；最后為模型組，驗(yàn)證了口腔潰瘍具有自愈性。

圖2 不同處理組大鼠口腔潰瘍發(fā)展過程Fig 2 Development of oral ulcers in rats in different treatment groups

3.2 組織病理學(xué)觀察

由圖3可知，正常組大鼠口腔黏膜上皮完整連續(xù)，無血管充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變（見圖3A、B）。造模成功后第3日，除正常組外，其余各組大鼠黏膜皮層、棘層、基底層均破壞消失，固有層直接暴露，細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，潰瘍部位有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)有少量的紅細(xì)胞外滲（見圖3C、E、G）；第7日，模型組基底細(xì)胞層開始呈現(xiàn)修復(fù)反應(yīng)，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)依舊明顯（見圖3D）；空白膜組有新的肉芽組織產(chǎn)生，但仍有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖3F）；藥膜組潰瘍部位棘層、基底層逐漸修復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，黏膜組織結(jié)構(gòu)趨于完整（見圖3H）。結(jié)果表明，藥膜組口腔潰瘍愈合速度最快，其次為空白膜組，說明載藥復(fù)合膜治療能夠明顯加速口腔潰瘍的愈合，膜材中的CMBSP-CS 對(duì)口腔潰瘍的愈合也有一定的促進(jìn)作用。

圖3 口腔黏膜 HE 染色圖片（100×，n ＝3）Fig 3 HE staining picture of oral mucosa（100×，n ＝3）

3.3 大鼠口腔潰瘍組織和血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的檢測(cè)

由圖4可知，造模成功后第3日，與正常組相比，模型組、空白膜組、藥膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量顯著增加（P＜0.05）造模成功后第7日，與正常組相比，模型組、空白膜組、藥膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量仍顯著增加（P＜0.05），但與第3日比較含量有所下降；與模型組相比，藥膜組與空白膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量顯著下降（P＜0.05），其中藥膜組效果顯著優(yōu)于空白膜組（P＜0.05）。結(jié)果顯示，給予6 次藥膜處理對(duì)大鼠潰瘍組織和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量減少的影響最為顯著，其次為空白膜組，最后是模型組，結(jié)果也表明口腔潰瘍具有自愈性。

圖4 大鼠口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量（± s，n ＝6）Fig 4 Content of TNF-α、IL-1β、IL-6 in rat oral ulcer tissue and serum（± s，n ＝6）

4 討論

本研究以醋酸化學(xué)灼傷建立的創(chuàng)傷性口腔潰瘍大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過大體觀察、創(chuàng)面愈合情況及組織病理學(xué)觀察評(píng)價(jià)CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜與空白膜對(duì)口腔潰瘍的治療作用，研究結(jié)果顯示CMBSP-CS 載藥復(fù)合膜及空白膜對(duì)口腔潰瘍均有一定的治療作用，載藥復(fù)合膜的效果最為明顯，說明空白膜可以協(xié)同Cur 一同起到治療口腔潰瘍的作用，載藥復(fù)合膜是一個(gè)藥輔合一的制劑，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。研究中觀察到CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜能夠減少口腔潰瘍大鼠的體質(zhì)量下降，推測(cè)載藥復(fù)合膜可能產(chǎn)生了一定的鎮(zhèn)痛效果，Cur 是中藥姜黃中的有效成分之一，《中國(guó)藥典》中記載：“姜黃可用于胸脅剌痛，閉經(jīng)，徵瘕，風(fēng)濕肩臂疼痛，跌撲腫痛”。說明可能與Cur 的鎮(zhèn)痛作用有關(guān)；多次給予空白復(fù)合膜能夠使大鼠體質(zhì)量變化恢復(fù)到正常水平，這可能與膜材中CMBSP-CS 的抗炎、抗菌作用及CS 提高免疫力等作用有關(guān)。

本研究還通過大鼠口腔潰瘍組織和血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的檢測(cè)對(duì)CMBSP-CS載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜的口腔潰瘍治療作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，結(jié)果表明CMBSP-CS 載藥聚電解質(zhì)復(fù)合膜可明顯降低口腔潰瘍組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平[14-18]，從而減少炎癥的發(fā)生，但是其分子免疫機(jī)制和對(duì)口腔潰瘍中其他因子的影響尚不清楚。下一步課題組將圍繞其是否具有鎮(zhèn)痛作用及具體的作用機(jī)制繼續(xù)進(jìn)行研究。