基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的福建野鴉椿果三萜抗肝纖維化的藥效機(jī)制研究

蔣佩佳，洪譯，譚洋，周峰，肖錦仁*，裴剛，2*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 40208；2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化與功能工程技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 40208）

肝纖維化（liver fibrosis）是肝臟對(duì)各種病因所致慢性肝損傷的過度修復(fù)反應(yīng)，是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）在肝內(nèi)的過度沉積，導(dǎo)致的肝臟結(jié)構(gòu)改變和肝功能喪失[1]。據(jù)報(bào)道，肝纖維化的發(fā)病率和病死率在全世界范圍內(nèi)居高不下，并呈逐年增高的趨勢(shì)[1]。在醫(yī)學(xué)上肝纖維化被認(rèn)為是可逆性病變，因此，有效控制肝纖維化環(huán)節(jié)對(duì)預(yù)防肝硬化及肝癌的發(fā)生有重要的意義[2-3]。

福建野鴉椿果（Euscaphis fukienensisHsu.）為省沽油科野鴉椿屬福建野鴉椿的成熟果實(shí)，在我國(guó)南方大部分地區(qū)都可采集，主要分布于福建，常作為園林綠化植物大面積種植，資源十分豐富[4]。在我國(guó)南方地區(qū)，福建野鴉椿果的水提物經(jīng)常被用來治療肝炎和肝纖維化[5-6]，但是其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚未明確。本課題組前期從福建野鴉椿果中分離得到了多個(gè)化合物[3，7]，其中齊墩果酸、熊果酸等三萜類成分有大量關(guān)于抗肝纖維化的活性報(bào)道[8-15]，推測(cè)三萜可能是其抗肝纖維化的有效成分。因此本實(shí)驗(yàn)研究福建野鴉椿果三萜類（EFT）化合物對(duì)肝纖維化小鼠的影響。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和經(jīng)典藥理學(xué)等多學(xué)科理論，提供了一種多角度分析藥物干預(yù)疾病作用靶點(diǎn)及機(jī)制的系統(tǒng)方法[16-17]。故本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，對(duì)EFT 抗肝纖維化的藥效機(jī)制進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，為該藥物抗肝纖維化藥效和機(jī)制的研究提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A，上海一恒科技有限公司）；超聲波清洗器（SB25-12D，寧波心芝科技股份有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-501A）、循環(huán)水式真空泵（SHZ-D）（鞏義市予華有限責(zé)任公司）；電子分析天平（AY220，日本SHIMADZU）；超級(jí)生化分析儀（日本日立）；超級(jí)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國(guó)Thermo）。

1.2 試藥

福建野鴉椿果于2016年采集于福建省三明市，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為省沽油科野鴉椿屬福建野鴉椿的成熟果實(shí)。陽離子交換樹脂、大孔吸附樹脂D101（長(zhǎng)沙承禹化工有限公司）；有機(jī)試劑（EtOH、CHCl3等，AR，天津恒興試劑有限公司）；蒸餾水為自制；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：C052-a）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：B014）、白蛋白（ALB）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：C008-a）、總膽紅素（TBIL）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：C004-g）（中國(guó)長(zhǎng)春匯利生物技術(shù)有限公司）；血清透明質(zhì)酸（HA）定量評(píng)估試劑盒（批號(hào)：CSB-E04805h）、層粘連蛋白（LN）定量評(píng)估試劑盒（批號(hào)：CSB-E04644h）（美國(guó)CUSABIO）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明小鼠（14.0 ～18.0 g），雌雄各半[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（湘）2011-0005]。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證編號(hào)：SYXK（湘）2013-0003]。

1.4 數(shù)據(jù)庫及軟件

通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt（https：//www.uniprot.org/），有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp），HPO 數(shù)據(jù)庫（https：//hpo.jax.org/），藥物銀行數(shù)據(jù)庫DRUGBANK（https：//www.drugbank.ca/），在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（https：//omim.org/），蛋白質(zhì)互作平臺(tái)STRING V 11.0（https：//string-db.org/），生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/），網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.7.2（http：//cytoscape.org/）。

2 方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 EFT 的制備 取干燥福建野鴉椿果1000 g，粉碎，加2000 mL 95%乙醇加熱回流提取60 min，提取3 次，合并提取液，回收乙醇，得濃縮液。將濃縮液過大孔樹脂D-101 色譜柱（柱體積約2000 mL），水洗后依次用50%和70%乙醇梯度洗脫，收集70%乙醇的洗脫部分，減壓回收溶劑，蒸至浸膏，得EFT 14.0 g，于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量EFT 溶解，參照楊潔等[18]的方法，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定EFT 中三萜的含量。

2.1.2 動(dòng)物造模及給藥處理 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，參照文獻(xiàn)方法誘導(dǎo)肝纖維化的生成進(jìn)行[5-6]。具體操作如下：除空白組外，其余各組小鼠腹腔皮下注射40% 四氯化碳（CCl4）溶液（溶于花生油）0.1 mL/10 g，每5日干預(yù)一次，共6周，首次干預(yù)劑量加倍?？瞻捉M于相同時(shí)間點(diǎn)，采用相同給藥方式注射等劑量花生油。

造模結(jié)束后，空白組和模型組中的小鼠按照體重，每日灌胃生理鹽水0.1 mL·10 g－1。陽性組每日灌胃秋水仙堿0.1 mg·kg－1。EFT 組每日灌胃EFT 5.12 mg·10 g－1。每只小鼠的給藥體積為0.2 mL/10 g，共給藥6 周。最后一次給藥后，各組小鼠禁食不禁水24 h，眼眶取血分離血清，用于肝功能指標(biāo)和纖維化因子的檢測(cè)。取血后將小鼠頸部脫臼處死，沿腹部正中線剪開小鼠腹部，取出肝臟，用于病理切片的檢測(cè)。

2.1.3 肝組織病理學(xué)觀察 肝組織經(jīng)10%甲醛固定，蠟塊包埋，切成4 μm 厚的切片，HE 染色，100 倍光學(xué)顯微鏡下DMR ＋Q550 圖像分析儀觀察肝纖維化形成情況。

2.1.4 肝功能及纖維化生化指標(biāo)的檢測(cè) 在室溫下凝結(jié)20 min 后，將血液離心10 min（3000 r·min－1），并收集上清液。檢測(cè)ALT、AST、ALB 和TBIL 水平。用ELISA 法檢測(cè)血清HA 和LN。將含有40 μL 稀釋劑的10 μL 樣品添加到平板中，振動(dòng)30 s，37℃孵育30 min，用洗液洗滌5 次，添加100 μL 酶標(biāo)記液，重復(fù)孵育和洗滌操作，添加發(fā)光底物，并按說明書通過超級(jí)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)，各項(xiàng)指標(biāo)多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）并繼以最小顯著差（LSD-t）檢驗(yàn)比較組間差異，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

2.2.1 藥物和疾病靶點(diǎn)的篩選 查閱野鴉椿屬相關(guān)文獻(xiàn)[7]，以目前福建野鴉椿果中分離并鑒定結(jié)構(gòu)的三萜化合物為對(duì)象，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫中獲取這些成分的SMILE 式。將三萜活性成分的SMILE 式輸入SWISS 數(shù)據(jù)庫中獲取其作用靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行去重整合[16-17，19]。經(jīng)過去重整合后，將靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫，獲得其相應(yīng)靶點(diǎn)的人源的靶點(diǎn)基因名稱及其ID。在HPO、DRUGBANK、OMIM 數(shù)據(jù)庫中，以“l(fā)iver fibrosis”和“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞對(duì)肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索[20]。

2.2.2 交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 將EFT 成分、藥物靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，選定物種為人，進(jìn)行蛋白互作分析。將蛋白互作分析結(jié)果（tsv 格式）導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用軟件自帶的Tools 分析功能，分析得到度值（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC），將DC ≥2 倍中位數(shù)、BC和CC ≥1 倍中位數(shù)的靶點(diǎn)作為重要靶點(diǎn)[19，21]。

2.2.3 生物過程與通路分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫中輸入“2.2.2”項(xiàng)所得的重要靶點(diǎn)，選定物種為人，進(jìn)行基因本體論（GO）分析和KEGG 通路富集分析[20，22]。設(shè)定閾值P＜0.05，收集P值前列的生物過程和通路，通過GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行繪圖后，然后進(jìn)行解析說明[21]。

3 結(jié)果

3.1 EFT 對(duì)小鼠肝纖維化的影響

經(jīng)檢測(cè)，EFT 含量為（98.15±1.30）%。如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠的血清ALT、AST、TBIL 顯著升高，ALB 顯著降低，說明CCl4導(dǎo)致了肝功能的損傷。同時(shí)，血清中的纖維化因子HA 和LN 含量均顯著升高，表明模型組小鼠組織中出現(xiàn)了纖維化改變。肝組織病理變化如圖1，空白組可見正常的肝組織結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞排列整齊規(guī)則。模型組肝細(xì)胞高或中度濁腫變性，形成大小不等橢圓形肝細(xì)胞結(jié)締組織構(gòu)成假小葉，結(jié)節(jié)周圍纖維組織沉積增生，顯示出明顯的纖維化特征，表明造模成功。

圖1 HE 染色顯示肝組織炎癥情況（100×）Fig 1 HE stain for liver tissue inflammation（100×）

表1 EFT 對(duì)肝纖維化小鼠血清ALT，AST，ALB，TBIL，HA 及LN 的影響(Mean±SEM)Tab 1 Effect of EFT on serum ALT，AST，ALB，TBIL，HA and LN levels (Mean±SEM)

與模型組相比，陽性對(duì)照組血清中的肝功能和纖維化因子指標(biāo)均明顯改善；同時(shí)，肝臟病變減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，僅有少量肝細(xì)胞輕度濁腫，纖維間隔變窄，脂肪空泡的形成明顯降低。與模型組相比，EFT 組血清中的肝功能和纖維化因子指標(biāo)均明顯改善；從病理切片結(jié)果可知，與陽性對(duì)照組類似，經(jīng)過EFT 干預(yù)后，小鼠肝臟的病變減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本保持完整，纖維間隔明顯減少，脂肪空泡也有一定程度減少，這表明EFT 對(duì)CCl4所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型有良好的干預(yù)作用。

3.2 EFT 靶點(diǎn)和肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

福建野鴉椿果中的21 個(gè)三萜類化學(xué)成分如表2所示，共得到140 個(gè)化合物作用靶點(diǎn)，肝纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)96 個(gè)。將以上獲得的靶點(diǎn)用來構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)[23]。

表2 EFT 編號(hào)與化合物名稱對(duì)照表Tab 2 Number and compound name of EFT

3.3 EFT 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建福建野鴉椿果三萜類成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2所示，共有161 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1413 條邊，其中黃色代表活性成分，綠色代表作用靶點(diǎn)[24]。從圖中可以明顯看出：每個(gè)EFT 成分均可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)作用靶點(diǎn)同時(shí)與多個(gè)活性成分相關(guān)；從而體現(xiàn)出EFT 類活性成分在發(fā)揮治療作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系特點(diǎn)，并且不同成分可通過相同靶點(diǎn)加強(qiáng)治療作用[25]。

圖2 EFT 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 “Compound-target” network diagram of EFT

3.4 EFT 活性成分-靶點(diǎn)-肝纖維化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過計(jì)算每個(gè)蛋白的拓?fù)湫再|(zhì)尋找福建野鴉椿果治療肝纖維化作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，最后獲得33個(gè)主要節(jié)點(diǎn)，繪制其互作圖[26]。圖3中黃色代表EFT 類有效成分，綠色代表藥物靶點(diǎn)，藍(lán)色代表疾病靶點(diǎn)，紅色代表共同靶點(diǎn)，連線表示靶點(diǎn)之間的相關(guān)性[16，21，25]。

圖3 EFT 抗肝纖維化的成分-靶點(diǎn)-疾病交互網(wǎng)絡(luò)Fig 3 “Compound-target-disease” network diagram of EFT against liver fibrosis

3.5 生物過程與通路分析

從生物過程（biological progress，BP）分析中可以看出與靶點(diǎn)相關(guān)的生物過程（見圖4），涉及DNA 模板轉(zhuǎn)錄、RNA 聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對(duì)過氧化氫的反應(yīng)、I-κB 激酶/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控、Smad 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)等生物過程。

從分子功能（molecular function，MF）分析中可以看出與靶點(diǎn)相關(guān)的分子功能，靶點(diǎn)具備能和DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑，RNA 聚合酶Ⅱ特異性、類固醇激素受體活性、RNA 聚合酶Ⅱ順式調(diào)控區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合、鋅離子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、核心啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、甾體結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、核受體活性等結(jié)合的分子功能。

從細(xì)胞成分（cellular component，CC）分析中可以看出與靶點(diǎn)相關(guān)的細(xì)胞成分，靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞中核染色質(zhì)、核常染色質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器膜等部位[20，23-24]。

通過對(duì)福建野鴉椿果治療肝纖維化的33 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到8 條主要的生物信號(hào)通路，按P值由小到大排序的前列，選取與肝纖維化相關(guān)的6 條通路：叉頭轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路（FoxO signaling pathway）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR signaling pathway）、Toll 樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、胰島素抵抗（insulin resistance）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）、沙門氏菌感染（Salmonellainfection）（見圖5）。

4 討論

4.1 EFT 對(duì)小鼠肝纖維化的干預(yù)作用

在前期工作中本課題組用福建野鴉椿果水提物和EFT 做了小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在小鼠最大耐受量下，各器官實(shí)質(zhì)均無明顯損傷。為了將藥物的治療效果最大化，我們提高灌胃量進(jìn)行給藥，開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)在建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型后，通過觀察HE 染色后的病理切片，發(fā)現(xiàn)EFT 能夠明顯抑制CCl4所造成的肝損傷和纖維化病變。血清ALT、AST、ALB 和TBIL的含量是臨床評(píng)估肝功能常用的指標(biāo)。在本次實(shí)驗(yàn)中，EFT 的干預(yù)對(duì)這些指標(biāo)變化的逆轉(zhuǎn)作用顯著。HA、LN 是肝臟纖維組織主要基質(zhì)成分，其血清中的含量可反映肝纖維化嚴(yán)重程度，EFT 的干預(yù)同樣能夠降低其含量。綜上，本研究明確了EFT 對(duì)CCl4所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的干預(yù)作用。

4.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)構(gòu)建EFT 活性成分-靶點(diǎn)-肝纖維化網(wǎng)絡(luò)

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)EFT 作用肝纖維化的機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，野鴉椿屬植物在化學(xué)成分上有著高度的一致性[4]，故本研究篩選出了野鴉椿屬植物中共21 個(gè)三萜成分，構(gòu)建了福建野鴉椿果“三萜活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，共獲得140個(gè)靶點(diǎn)。福建野鴉椿果“活性成分-靶點(diǎn)-肝纖維化”靶點(diǎn)互作圖分析得到33 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，在一定程度上反映出它們之間存在復(fù)雜交錯(cuò)的相互關(guān)系，并非獨(dú)自發(fā)揮作用。GO 分析結(jié)果表明，福建野鴉椿果治療肝纖維化涉及細(xì)胞過程和代謝過程等生物過程，涉及核染色質(zhì)、核常染色質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器膜等細(xì)胞組分，有酶、受體、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)的參與，是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。從KEGG 通路分析中可以看出，福建野鴉椿果治療肝纖維化涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路。

福建野鴉椿果21 種活性成分中熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、坡模酸、常春藤皂苷元連接較多靶點(diǎn)數(shù)。這些成分所連接的140 個(gè)靶點(diǎn)中，PGR、HMGCR、CYP19A1、NR3C1、AR、PPARA、PPARG、PTGS2、MAPK3、TNF、IL-6 等度值較大，是福建野鴉椿果治療肝纖維化的主要作用靶點(diǎn)。其中TNF 和IL-6 度值顯著，更因其炎癥因子的身份而頗受關(guān)注。TNF 和IL-6 是主要由巨噬細(xì)胞主要分泌的一類促炎因子，其產(chǎn)生能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞進(jìn)一步向促炎型轉(zhuǎn)化，損傷肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展[2]。福建野鴉椿果中的熊果酸和齊墩果酸具有抗氧化作用，可通過提高肝損傷后的多種抗氧化酶活性，降低TNF-α、IL-6 等炎性因子水平，阻滯肝纖維化形成[8-11]。鄧?yán)虻萚14]報(bào)道齊墩果酸能抑制TNF-α誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞炎癥因子IL-6及IL-1β的產(chǎn)生。王穎等[13]發(fā)現(xiàn)山楂酸在CCl4誘導(dǎo)的炎癥性肝損傷的模型中能顯著降低肝組織中TNF-α和IL-1β表達(dá)。以上研究表明福建野鴉椿果的抗肝纖維化作用可能與其對(duì)巨噬細(xì)胞的作用有關(guān)。巨噬細(xì)胞是肝內(nèi)最主要的免疫細(xì)胞，具有高度的可塑性和異質(zhì)性，可針對(duì)不同的刺激信號(hào)作出應(yīng)答，在不同微環(huán)境下可分化成表型和功能迥異的不同類型，釋放促炎因子或抗炎因子[27-29]。在肝纖維化啟動(dòng)的早期炎性反應(yīng)期，巨噬細(xì)胞在LPS、IFN-γ等誘導(dǎo)下，主要表現(xiàn)為M1 型，高表達(dá)和分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等，并高表達(dá)CD68、CD40 等表面抗原提呈分子，而抗炎細(xì)胞因子IL-10、IL-22 等的分泌量較低[2，30]。這些促炎因子可迅速作用于肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC），促進(jìn)靜息狀態(tài)的HSC 增殖，并向肌原纖維母細(xì)胞或肌成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，合成并釋放ECM，從而啟動(dòng)肝纖維化[28，31-32]。

4.3 EFT 抗肝纖維化作用的相關(guān)信號(hào)通路

KEGG 分析結(jié)果將EFT 抗肝纖維化作用的機(jī)制指向其對(duì)Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號(hào)傳遞的調(diào)控[33]。TLR 是巨噬細(xì)胞所表達(dá)多種模式識(shí)別受體之一，包括TLR2、TLR4、TLR9 等，這些受體可以對(duì)LPS 等病原體成分進(jìn)行識(shí)別，并進(jìn)行炎癥信號(hào)的傳遞。TLR4 是Toll樣家族中的一員，作為重要的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別內(nèi)源性的HMGB1，促進(jìn)TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，從而傳遞炎癥信號(hào)，加重肝損傷[34-35]。當(dāng)TLR4 被抑制之后，下游炎癥因子理論上應(yīng)該會(huì)減少。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，EFT 中熊果酸、齊墩果酸等化合物能夠?qū)LR 信號(hào)通路的傳遞進(jìn)行抑制[28，30]。PPAR 是TLR 信號(hào)傳遞的重要調(diào)控因子，PPARA 與PPARG 同屬于過氧化物酶體增生激活受體家族，其活化對(duì)肝纖維化具有重要的調(diào)節(jié)作用[30，36]。在生理狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞的TLR信號(hào)由于PPAR 的負(fù)調(diào)控而無法向下游傳遞，一系列炎癥基因的表達(dá)處于抑制狀態(tài)[30，37-38]。但在肝損傷過程中PPAR 會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量減少和功能異常，這被認(rèn)為與肝臟炎癥介質(zhì)的釋放和纖維化的進(jìn)展有關(guān)[39]。張揚(yáng)武等[15]發(fā)現(xiàn)熊果酸能夠抑制HSC-T6 細(xì)胞增殖，降低ECM 分泌，該機(jī)制可能與上調(diào)PPAR-γ表達(dá)有關(guān)。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP1）是藥物和疾病共有的作用靶點(diǎn)，對(duì)肝細(xì)胞中脂類代謝和脂類鏈接起重要作用，其活性的改變與肝纖維化、脂肪肝、肝硬化以及肝癌的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[40]。肝型脂肪酸結(jié)合蛋白FABP1主要表達(dá)于肝臟，對(duì)肝細(xì)胞中脂類代謝和脂類鏈接起重要作用，并且FABP1 的活性改變與肝纖維化、脂肪肝、肝硬化以及肝癌的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，血液中FABP1 的濃度可預(yù)測(cè)肝損傷程度，F(xiàn)ABP1 有望成為肝細(xì)胞損傷早期的生物標(biāo)志物，當(dāng)肝臟受到輕微損傷時(shí)，肝小葉中央?yún)^(qū)域的肝細(xì)胞會(huì)迅速響應(yīng)，大量釋放FABP1[41-43]。

叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box protein O，F(xiàn)oxO）中研究最多的是FoxO1 和FoxO3，它們廣泛參與了肝纖維化病變的各個(gè)階段[36]。研究表明，F(xiàn)oxO1和FoxO3 可通過誘導(dǎo)HSC 中p27基因的表達(dá)，使HSC 的細(xì)胞周期阻滯，抑制HSC 增殖[44-45]。此外，這兩個(gè)蛋白能夠抑制抗凋亡因子IL-1β-轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（cellular homolog FLICE-like inhibitory protein，c-flip）的表達(dá)，激活caspase-8 和caspase-3，導(dǎo)致活化的HSC 凋亡[45-46]。機(jī)體中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在正常情況下水平很低，只是維持正常的血管密度和通透性[47]。當(dāng)肝纖維化發(fā)生時(shí)，局部病變組織出現(xiàn)缺氧，HSC 活化，引起VEGF 水平升高，VEGF 的轉(zhuǎn)錄激活最終會(huì)誘導(dǎo)血管生成[36，48]。Jaroszewicz 等[49]提出，VEGF 血清和受體水平反映了肝功能損害的程度。

本實(shí)驗(yàn)明確了EFT 成分的抗肝纖維化活性，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)了福建野鴉椿果發(fā)揮抗肝纖維化作用可能的作用靶點(diǎn)及通路。將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，初步揭示了福建野鴉椿果治療肝纖維化的作用機(jī)制，為其抗肝纖維化機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工作的開展提供借鑒。