雞滑液囊支原體河南株的分離鑒定與生物學(xué)特性研究

徐引弟，焦文強(qiáng)，王治方，李海利，張青嫻，朱文豪，王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是引起雞和火雞傳染性滑膜炎（Avain infection synovitis）的病原。傳染性滑膜炎臨床上以關(guān)節(jié)腫大、滑液囊和腱鞘發(fā)炎為特征。雞一旦感染滑液囊支原體，持續(xù)排毒，極難根除，給世界家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。

OLSON等[4]于1954年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)傳染性滑膜炎，隨后在世界各國(guó)均有報(bào)道[5-6]。近年來(lái)，雞傳染性滑膜炎的危害逐步加重，導(dǎo)致中國(guó)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)百萬(wàn)只雞死亡[7-16]。寧夏雞滑液囊支原體抗體陽(yáng)性率為67.18%，最高達(dá)89.67%[10]。川西地區(qū)陽(yáng)性檢出率為41.33%，場(chǎng)陽(yáng)性率為73.33%[11]。廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等10個(gè)省份不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)均有發(fā)生，平均感染率為8.89%，平均死亡率為2.16%[12]。廣西3個(gè)公司10個(gè)商品肉雞場(chǎng)MS抗體群體陽(yáng)性率為100%，群內(nèi)個(gè)體陽(yáng)性率均高于80%；病原群體陽(yáng)性率為100%，群內(nèi)個(gè)體陽(yáng)性率分別為15.4%、17.0%和21.0%[13]。華北、華中、華南、東北、西北、華東地區(qū)11個(gè)省份的發(fā)病率為5.75%～25.77%，血清陽(yáng)性率為30.23%～54.67%，病原菌分離率為37.1%[14]。江蘇部分地區(qū)雞場(chǎng)雞群血清陽(yáng)性率最高達(dá)82.4%，最低為38.9%，總體平均陽(yáng)性率為57.7%[15]。然而，滑膜炎的分布多為區(qū)域性，很少發(fā)生大規(guī)模的暴發(fā)。除氣囊炎和滑膜炎外，由滑膜炎引起的蛋殼頂端異常(EAA)和產(chǎn)蛋下降綜合征在世界各地都有發(fā)生，因此，人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)滑膜炎流行情況的了解，特別是其亞臨床感染。許多免疫抑制病原體可與雞滑液囊支原體相互作用，導(dǎo)致宿主發(fā)生嚴(yán)重疾病。雞滑液囊支原體亞臨床感染，可與禽流感病毒(AIV)H9、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞新城疫病毒(NDV)或傳染性法氏囊病病毒(IBDV)混合感染引起更嚴(yán)重的呼吸道或系統(tǒng)性疾病。

目前，該病在國(guó)內(nèi)無(wú)疫苗防控，且治療效果差。國(guó)外有弱毒疫苗MS-H株，由于效果及疫苗苛刻的保存條件等原因限制了使用。因此，篩選具有安全、免疫原性好的疫苗株防治該病十分迫切[17]。有關(guān)河南省雞滑液囊支原體病的發(fā)病率和流行病學(xué)研究報(bào)道較少，為此，從河南省規(guī)?；u場(chǎng)采集病死雞進(jìn)行雞滑液囊支原體的分離鑒定，并對(duì)某蛋雞場(chǎng)發(fā)生關(guān)節(jié)腫大跛行的產(chǎn)蛋雞關(guān)節(jié)中分離出的1株雞滑液囊支原體進(jìn)一步研究，旨在為河南省雞傳染性滑膜炎的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料來(lái)源與毒株

2017—2019年，河南省部分規(guī)?；u場(chǎng)發(fā)生跗關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)發(fā)熱腫脹、跛行、爪墊增厚，呼吸啰音，精神不振、羽毛蓬亂、極度消瘦、產(chǎn)蛋下降、慢性零星死亡等病例，剖檢并采集腱鞘炎、滑膜炎、骨關(guān)節(jié)炎、氣囊炎、心包炎等癥狀病死雞的肺臟、心包積液、關(guān)節(jié)液等病料共159份。陽(yáng)性對(duì)照毒株CVCC385株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑

PPLO肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉均購(gòu)自美國(guó)BD公司；MEM、葡萄糖、酚紅、精氨酸購(gòu)自北京索萊寶公司；馬血清購(gòu)自Hyclone公司；青霉素購(gòu)自華北制藥集團(tuán)公司；2×TaqPCR Mix、柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；F5881氫氧化鋁佐劑購(gòu)自Sigma公司。

PPLO液體培養(yǎng)基的制備：PPLO肉湯粉10.5 g，葡萄糖2.5 g，酵母粉2.5 g，溶于430 mL超純水中，制成PPLO基礎(chǔ)培養(yǎng)基，115℃滅菌15 min，冷卻后加MEM 5 mL、馬血清50 mL、8萬(wàn)U青霉素5 mL、過(guò)濾除菌的10%精氨酸10 mL和1%酚紅500μL；PPLO固體培養(yǎng)基的制備：每430 mL PPLO液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加瓊脂粉7.5 g，115℃滅菌15 min，冷卻至50℃左右加入MEM 5 mL、馬血清50 mL、8萬(wàn)U青霉素5 mL、10%精氨酸10 mL，混勻后傾倒平皿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雞滑液囊支原體的分離培養(yǎng)

無(wú)菌抽取病變關(guān)節(jié)液，加入2 mL的滅菌PBS緩沖液，混勻，5 000 r/min低速離心5 min后，取上清液，0.45μm濾膜過(guò)濾，加入至PPLO液體培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，取1 mL轉(zhuǎn)接10 mL PPLO液體培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，傳代后液體顏色若由紅色變?yōu)辄S色，取100μL涂布PPLO固體培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。在4倍的低倍顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，取培養(yǎng)基變黃的培養(yǎng)物固定，進(jìn)行吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4 雞滑液囊支原體的鑒定

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中雞滑液囊支原體16S rRNA基 因 設(shè) 計(jì) 引 物，上 游 引 物P1：5′-CTGGCTGTGTGCCTAATACA-3′，下 游 引 物P2：5′-TAAATACAATAGCCCAAGGC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段1 580 bp。由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4.2 PCR鑒定 將疑似單菌落純化，接種PPLO固體培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，洗脫收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取DNA，用P1、P2擴(kuò)增進(jìn)行PCR鑒定。同時(shí)，設(shè)置雞滑液囊支原體標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC385）為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將其中分離自河南許昌某蛋雞場(chǎng)關(guān)節(jié)的雞滑液囊支原體命名為HNMsy1，采用DNAStar軟件將其序列與GenBank中登錄序列比對(duì)，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，GenBank中登錄序列信息如表1所示。

表1 16Sr RNA基因參考序列Tab.1 16Sr RNA gene reference sequence

1.5 毒力試驗(yàn)

對(duì)試驗(yàn)組10只45日齡健康雞接種HNMsy1，每只爪墊部接種0.5 mL，對(duì)照組10只雞接種PPLO液體培養(yǎng)基，連續(xù)觀察30 d。

1.6 免疫原性試驗(yàn)

將雞滑液囊支原體菌株HNMsy1菌液調(diào)整為108cfu/mL，加0.2%的甲醛，37℃攪拌滅活12 h，加入和疫苗原液等體積的佐劑，攪勻乳化制成油乳劑滅活疫苗。選取45日齡健康雞20只對(duì)疫苗組10只頸部皮下注射該疫苗0.5 mL，對(duì)照組注射0.5 mL滅菌生理鹽水。30 d后爪墊注射HNMsy1 0.5 mL進(jìn)行攻毒，觀察30 d，之后對(duì)所有雞進(jìn)行剖檢，進(jìn)行雞滑液囊支原體分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞滑液囊支原體的分離培養(yǎng)

PPLO液體培養(yǎng)基發(fā)黃后接種PPLO固體培養(yǎng)基，3～10 d后，肉眼可見(jiàn)極為細(xì)小、光滑、致密的小菌落，半凹陷于培養(yǎng)基內(nèi)，在低倍顯微鏡下觀察到菌落形態(tài)為特征性的“煎蛋狀”。挑取變黃的液體培養(yǎng)基經(jīng)吉姆薩染色，油鏡下觀察到菌體形態(tài)為球形、橢圓形、絲狀或螺旋狀（圖1）。

圖1 雞滑液囊支原體菌落和菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of Mycoplasma synoviae colony and bacteria

2.2 雞滑液囊支原體的鑒定

從圖2可以看出，擴(kuò)增出預(yù)期1 580 bp大小相同片段。經(jīng)測(cè)序與雞滑液囊支原體標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC385）同源性均在99%以上，與GenBank中雞滑液囊支原體的16SrRNA的同源性均在99%以上，而與其他支原體的同源性均在94%以下，證明所分離的菌株均為雞滑液囊支原體。從159份病料中共分離出25株雞滑液囊支原體，分離率達(dá)15.7%。

圖2 雞滑液囊支原體的PCR鑒定Fig.2 PCR amplification of Mycoplasma synoviae

其中1株分離自許昌某蛋雞場(chǎng)的病雞關(guān)節(jié)的毒株HNMsy1與雞滑液囊支原體B1164-14-H4、MS-H株、86079-7NS株、NCTC10124株、ATCC25204株、HN01株、53株同源性分別為100.0%、99.8%、99.7%、99.6%、99.6%、99.5%、99.6%、99.6%（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，雞滑液囊支原體依據(jù)16SrRNA基因分為三大群，HNMsy1與CVCC385、B1393-14-10、B1394-14-2、B293-15-7-241、HN01、B2777-15A-7-2親緣關(guān)系最近；在同一分支里，與53株最遠(yuǎn)（圖4）。

圖3 HNMsy1 16Sr RNA基因同源性分析Fig.3 Sequence homology analysis of 16Sr RNA gene of HNMsy1 strain

圖4 HNMsy1 16Sr RNA基因進(jìn)化分析Fig.4 Phylogentic analysis of 16Sr RNA gene of HNMsy1 strain

2.3 毒力試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組雞12 d后表現(xiàn)出臨床癥狀：精神不振、產(chǎn)蛋異常、跛行、生長(zhǎng)、跗關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)腫脹，共死亡2只。對(duì)照組體溫、精神、飲食、產(chǎn)蛋等正常。試驗(yàn)結(jié)束后剖殺所有供試動(dòng)物，采集病料，進(jìn)行雞滑液囊支原體分離。試驗(yàn)組剖檢發(fā)現(xiàn)，雞只消瘦，胸骨下有囊腫，腫脹關(guān)節(jié)有黏液性、纖維素性分泌物，氣囊渾濁，心包滲出（圖5）。對(duì)照組剖檢，均無(wú)明顯的病理變化，均未分離到雞滑液支原體；試驗(yàn)組均分離到雞滑液囊支原體，PCR鑒定為雞滑液囊支原體。

圖5 HNMsy1攻毒后雞剖檢變化Fig.5 Necropsy changes of chickens after challenge with HNMsy1

2.4 免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

攻毒后，對(duì)照組雞從第2天開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)精神不振、消瘦、關(guān)節(jié)腫大、羽毛蓬亂等臨床癥狀，全部發(fā)病，共死亡2只。剖檢發(fā)現(xiàn)，極度消瘦，胸骨下有囊腫，腫脹關(guān)節(jié)和腳墊有黏液性、纖維素性分泌物。疫苗組的10只雞均沒(méi)有出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化。從關(guān)節(jié)分離雞滑液囊支原體，對(duì)照組均能分離到雞滑液囊支原體，疫苗組全部未分離出雞滑液囊支原體。說(shuō)明HNMsy1具有很好的保護(hù)效果，攻毒保護(hù)率為100%。

3 結(jié)論與討論

本研究采集病料159份，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、鏡檢、PCR鑒定、測(cè)序比對(duì)，分離出雞滑液囊支原體菌株25株，分離率15.7%。對(duì)其中1株蛋雞關(guān)節(jié)分離株HNMsy1進(jìn)行了毒力試驗(yàn)和免疫原性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)毒力較強(qiáng)，免疫原性好。研究結(jié)果為河南省雞滑膜炎的流行病學(xué)調(diào)查、疫苗毒株的篩選、傳染性滑膜炎的診斷和防治提供依據(jù)。

雞滑液囊支原體在不同地區(qū)均感染嚴(yán)重，對(duì)雞群危害巨大，給行業(yè)帶來(lái)的損失難以估算。本研究中，河南省雞滑液囊支原體的分離率達(dá)15.7%，感染率是比較高的，有很多病變典型的雞沒(méi)有分離出雞滑液囊支原體，可能由于用藥過(guò)度，雖然藥物殺滅并清除了雞滑液囊支原體，但對(duì)機(jī)體造成了不可逆損傷，可見(jiàn)明顯的臨床癥狀及病理變化。另外，由于雞滑液囊支原體培養(yǎng)條件苛刻，需要特殊的生長(zhǎng)因子，而且由于混合感染的情況非常普遍，而其他細(xì)菌及支原體類(lèi)微生物的生長(zhǎng)會(huì)干擾和掩蓋雞滑液囊支原體的生長(zhǎng)，與其他致病性或致病力弱的支原體如雞毒支原體、雞支原體、精氨酸支原體等在形態(tài)上很難分辨，只有序列比對(duì)才能確定，導(dǎo)致其極難分離，因此，實(shí)際感染率可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出15.7%，感染情況十分嚴(yán)重，對(duì)河南省的養(yǎng)雞業(yè)造成的損失巨大，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。

16SrRNA是雞滑液囊支原體較為保守的基因，在所有雞滑液囊支原體分離株中同源性都在99%以上，而與其他支原體類(lèi)同源性較低，因此，16SrRNA可以作為鑒定雞滑液囊支原體及區(qū)別其他支原體的靶基因。在對(duì)HNMsy1毒株的序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，由于GenBank中雞滑液囊支原體的16SrRNA的信息較少，特別是國(guó)內(nèi)毒株的信息更少，需要更多毒株特別是國(guó)內(nèi)毒株的生物信息，以待更深入的研究雞滑液囊支原體的來(lái)源及其變異情況。

使用抗生素是治療傳染性滑膜炎的主要手段，而抗生素在肉雞和蛋雞的生產(chǎn)中有明確的限制使用，并且由于抗生素的長(zhǎng)期濫用，使得耐藥性日益嚴(yán)重，在臨床中治療效果非常不理想，藥物殘留嚴(yán)重[1-3,12,16]。疫苗免疫是防控傳染性滑膜炎最有效的措施。國(guó)外使用的主要是雞滑液囊支原體弱毒疫苗（MS-H株），國(guó)內(nèi)還沒(méi)有弱毒疫苗。目前，還沒(méi)有商品化的雞滑液囊支原體滅活疫苗，滅活疫苗和亞單位疫苗都在研究之中[17]。本研究選擇1株分離自發(fā)生典型滑膜炎雞場(chǎng)發(fā)病雞關(guān)節(jié)的毒株HNMsy1對(duì)雞進(jìn)行攻毒，能夠復(fù)制出典型的且較為嚴(yán)重的滑膜炎病例，引起部分雞死亡，說(shuō)明該毒株毒力較強(qiáng)。用該毒株制備的疫苗免疫雞，攻毒后能夠提供有效保護(hù)，且免疫原性較好，可以作為雞滑膜炎疫苗的候選毒株之一進(jìn)一步研究。