5個綿羊群體GDF9基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

邵順成，康曉龍，閆背背，張?zhí)炻?，?鵬，鄒詩凡，孟 科，榮 軒，強(qiáng) 浩，馮登偵，李新海

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

生長分化因子9（Growth differentiation factor 9，GDF9）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族卵母細(xì)胞衍生的生長因子。BODENSTEINER等[1]在1999年報道了綿羊GDF9基因的核苷酸序列，包含2個外顯子和1個內(nèi)含子。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（Bone morphogenetic protein 15，BMP15）在卵母細(xì)胞中特異表達(dá)，通過阻止顆粒細(xì)胞凋亡來促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育，對卵泡發(fā)育及動物的排卵率有著重要的調(diào)控作用[2-3]。GDF9和BMP15氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，它們在卵巢中的表達(dá)方式和功能也密切相關(guān)[4-5]。在綿羊中，BMP15和GDF9基因同時純合突變可抑制卵泡的發(fā)育，但若2個基因雜合突變可導(dǎo)致排卵率增加[6]。研究表明，GDF9蛋白以旁分泌的方式影響卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的功能，對卵泡形成和排卵的過程至關(guān)重要，同時還參與排卵[7]。在卵巢中，GDF9基因?qū)︻w粒細(xì)胞的增殖、分化和凋亡起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[8]。研究表明，GDF9基因可作為綿羊多羔性狀的候選分子標(biāo)記[9-11]。目前，對于GDF9基因SNP與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性研究主要集中在GDF9編碼區(qū)，其在綿羊中具有高度的品種特異性[12-13]。關(guān)于GDF9基因?qū)ρ蚍敝承誀畹挠绊懷芯款H多，如TONG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蒙古羊GDF9基因g.46544883A＞G、c.1040T＞C和g.46547859C＞T 3個SNP可能是影響蒙古羊產(chǎn)羔數(shù)的優(yōu)勢位點(diǎn)；BI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，絨山羊GDF9基因的2個錯義突變SNP可影響山羊的產(chǎn)仔數(shù)；WANG等[16]對山羊GDF9基因45個SNP進(jìn)行歸納分析，結(jié)果表明，在多種山羊品種中，3個錯義突變SNP（A240V、Q320P和V397I）和3個同義突變SNP（L61L、N121N和L141L）與山羊的產(chǎn)羔數(shù)具有一定的關(guān)聯(lián)性。同時，GDF9基因在山羊的多個組織中廣泛表達(dá)，如卵巢、下丘腦、垂體、子宮等，但在卵巢中的表達(dá)最高，這也證實(shí)GDF9基因在生殖器官中可能起重要調(diào)控作用[17]。TANG等[18]報道，高產(chǎn)小尾寒羊的卵巢中GDF9基因的表達(dá)水平高于低產(chǎn)小尾寒羊，說明GDF9基因可能在小尾寒羊的產(chǎn)羔性能中發(fā)揮重要調(diào)控作用。趙茜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因可調(diào)控綿羊卵丘細(xì)胞雌二醇、黃體酮等生殖激素的分泌，并影響相關(guān)激素受體基因的相對表達(dá)量?？梢姡瑢DF9基因錯義突變位點(diǎn)展開研究，尋找與產(chǎn)羔數(shù)具有關(guān)聯(lián)性的多態(tài)位點(diǎn)尤為重要。

綿羊的繁殖性狀在綿羊育種中具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，但這種性狀的遺傳力很低，傳統(tǒng)育種進(jìn)程緩慢，通過分子標(biāo)記輔助選擇來探索和發(fā)現(xiàn)綿羊高繁殖力基因可以有效地提高其繁殖性能[20]。寧夏優(yōu)質(zhì)肉羊新品種（系）培育利用我國灘羊、小尾寒羊種質(zhì)品種，以杜泊羊?yàn)橹鲗?dǎo)品種，運(yùn)用現(xiàn)代分子育種技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合方法，挖掘小尾寒羊和杜泊羊的多胎特色基因，以期培育具備較高繁殖力的肉羊新品種。以杜柏羊、灘羊和小尾寒羊3個群體雜交后開展特色基因的挖掘研究，因群體間的遺傳差異性較大，更容易篩選出差異顯著的目標(biāo)性狀特色基因。鑒于此，以杜泊羊、灘寒羊、雜一代、雜二代和橫交一代5個綿羊群體為研究對象，基于Ensembl數(shù)據(jù)庫中已有的GDF9基因的錯義突變位點(diǎn)，采用Sequenom Mass ARRAY?SNP技術(shù)對5個綿羊群體GDF9基因rs425223128、 rs597009987、 rs415699275 和rs160076408等4個位點(diǎn)進(jìn)行檢測，利用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件對GDF9蛋白的理化性質(zhì)、差異位點(diǎn)突變前后的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)互作等進(jìn)行分析與預(yù)測，以期為研究綿羊GDF9基因的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

共采集5個綿羊群體共768只綿羊的耳組織，其中有產(chǎn)羔數(shù)記錄的599只（表1）。試驗(yàn)羊均為母羊，來自寧夏宇泊科技有限公司。同時記錄各群體母羊的產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

表1 試驗(yàn)羊群信息Tab.1 Test sheep information

1.2 基因組DNA提取

使用組織DNA提取試劑盒對綿羊耳組織樣本DNA進(jìn)行提取，DNA質(zhì)量利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 基因分型

采用Mass ARRAY Assay Design 3.1軟件設(shè)計檢測GDF9基因4個位點(diǎn)的單堿基延伸引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件對綿羊各基因位點(diǎn)的基因型頻率、基因頻率、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC）和有效等位基因數(shù)（Ne）等進(jìn)行計算，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。利用SPSS25.0軟件程序中一般線性模型對5個綿羊群體各基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，其中，產(chǎn)羔數(shù)/產(chǎn)羔次數(shù)為每只羊的平均產(chǎn)羔數(shù)[21]。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 生物信息學(xué)分析

采用ExPASy在線軟件的ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）程序分析綿羊GDF9蛋白的理化性質(zhì)[22]；使用SOPMA工具（http://npsa-prabi.ibcp.fr/npsa_sopma.htmL）分析GDF9蛋白的二級結(jié)構(gòu)；運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)構(gòu)建與綿羊GDF9蛋白相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊GDF9基因4個位點(diǎn)在5個群體中的分型結(jié)果

由圖1可以看出，rs425223128和rs597009987位點(diǎn)均為純合型TT，rs415699275位點(diǎn)為純合型CC，rs160076408位點(diǎn)在5個群體中存在CC、TC、TT等3種基因型。

圖1 綿羊GDF9基因4個位點(diǎn)的分型結(jié)果Fig.1 Typing results of four lociof GDF9 gene in sheep

2.2 GDF9基因在5個綿羊群體中的多態(tài)性分析

rs425223128、rs597009987和rs415699275位點(diǎn)均為純合型，故不進(jìn)行多態(tài)性及關(guān)聯(lián)分析。由表2可知，rs160076408位點(diǎn)在5個群體間均為低度多態(tài)，除了在雜二代群體不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在其他4個群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 綿羊GDF9基因rs160076408位點(diǎn)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析Tab.2 Analysis of population genetic structure of GDF9 gene rs160076408 locus in sheep

2.3 綿羊GDF9基因rs160076408位點(diǎn)與不同群體羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

對GDF9基因rs160076408位點(diǎn)的不同基因型與5個群體的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析（表3），結(jié)果表明，雜一代群體TC基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CC基因型（P＜0.05），說明rs160076408位點(diǎn)適用于雜一代綿羊群體多羔性狀的選育。

表3 綿羊GDF9基因rs160076408位點(diǎn)各基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Association Analysis of litter size and different genotypes at rs160076408 locusof GDF9 gene in sheep

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