中和表位串聯(lián)的PCV2b病毒樣顆粒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定

任春曉，馮 華，張 騰，3，蔣 敏，4，劉運(yùn)超，金前躍，張改平

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712000；4.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001）

豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（Porcine circovirus associated disease，PCVAD）是由豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）引起的一類疾病的總稱，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道疾病綜 合 征（PRDC）等[1-2]。PCV2分 為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g、PCV2h等8個(gè)亞型，其中，PCV2b是誘發(fā)PCVAD的主要PCV2基因亞型，感染豬在臨床上通常出現(xiàn)厭食、發(fā)育遲緩、呼吸困難、精神沉郁、淋巴結(jié)腫大等癥狀，死亡率可達(dá)40%左右，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

PCV2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一類單鏈無(wú)囊膜環(huán)狀DNA病毒[4-5]。PCV2基因組長(zhǎng)度在1 767～1 768 bp，包含11個(gè)開放閱讀框（ORF1—11），其中，ORF1和ORF2是最主要的開放閱讀框[6]。ORF1編碼2個(gè)復(fù)制酶蛋白R(shí)ep（Rep′），ORF2編碼PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白Cap[7]。Cap蛋白包含了主要抗原中和表位，是PCV2主要的免疫蛋白[8]，且與PCV1的Cap蛋白沒有抗原交叉反應(yīng)，能夠在體外自組裝成病毒樣顆粒（VLP）[9]，通常作為PCV2疫苗研制的首選蛋白。目前，已經(jīng)在Cap蛋白上鑒定出多個(gè)抗原表位[10]，如77NDFLPPG831、69STIDYFQPNNKR180、195HVGLGTAF202、226LKDPPLNP233、138YDPYVNY144等。其 中，表位226LKDPPLNP233能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在PCV2亞單位疫苗研制中提供了新的研究方向。

PCV2亞單位疫苗能夠明顯降低病毒血癥的發(fā)生率,減輕PCV2感染對(duì)淋巴組織的損傷[11]，然而通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備得到的蛋白質(zhì)純化過程較為復(fù)雜，純化得率較低，且免疫原性差，蛋白質(zhì)顆粒形態(tài)不夠完善，而相比大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，避免了外源蛋白在大腸桿菌中易形成包涵體的弊端，使重組蛋白具有與病毒天然蛋白相似的結(jié)構(gòu)和活性，更有利于病毒樣顆粒的形成[12]。因此，研制基于真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白亞單位疫苗，成為了開發(fā)PCV2疫苗的首選，進(jìn)一步提高PCV2亞單位疫苗免疫原性及保護(hù)性成為疫苗研發(fā)中亟待解決的問題。研究表明，將中和表位連接在Cap蛋白的C端能有效誘導(dǎo)針對(duì)Cap蛋白與該中和表位的特異免疫反應(yīng)[13]。鑒于此，構(gòu)建C端重復(fù)串聯(lián)中和表位226LKDPPLNP233的Cap蛋白，在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，純化后進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其免疫原性，以期為研制高效新型的PCV2亞單位疫苗提供參考。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、載體與主要試劑

DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、sf21細(xì)胞及pFastBacTMⅠ載體均保存于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；DL2000 DNA Marker、Primer Max DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ均采購(gòu)于TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒采購(gòu)于OMEGA公司；彩虹180蛋白質(zhì)Marker、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、ECL顯色液試劑盒及AEC底物顯色試劑盒均采購(gòu)于Solarbio公司；PCV2抗體檢測(cè)ELISA試劑盒采購(gòu)于無(wú)錫優(yōu)聯(lián)生物科技有限公司；PCV2單克隆抗體、PCV2毒株、PCV2基因組DNA、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗保存于本實(shí)驗(yàn)室；PCV2亞單位疫苗采購(gòu)于勃林格殷格翰公司。

1.2 目的基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)過對(duì)河南株P(guān)CV2b（GenBank:AY969004.1）cap基因序列的分析，分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物cap-F和cap-R、cap-F和capE2-R（表1），對(duì)cap及其C端重復(fù)串聯(lián)2個(gè)中和表位226LKDPPLNP233的嵌合cap（capE2）基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)。利用T4 DNA連接酶分別將得到的cap和capE2基因構(gòu)建至pFastBacTMⅠ載體的BamHⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間，分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑選陽(yáng)性菌落以相應(yīng)引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，獲得重組質(zhì)粒。再將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性重組菌送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，并將構(gòu)建好的陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別命名為pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 The primer sequences for PCR amplification

1.3 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定

將重組質(zhì)粒pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2分別轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的sf21細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代，收集重組桿狀病毒再次接入生長(zhǎng)狀況良好的sf21細(xì)胞，振蕩培養(yǎng)72 h后，1 000 r/min離心15 min，收集細(xì)胞；以1×PBS溶液重懸細(xì)胞后，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，收集裂解液，對(duì)表達(dá)的重組蛋白Cap、CapE2進(jìn)行初步SDS-PAGE鑒定。裂解液經(jīng)10 000×g超速離心2 h使目的蛋白沉淀，將得到的蛋白質(zhì)重懸液置于30%～60%的蔗糖溶液中，再次超速離心，用取樣針緩慢吸取目的蛋白，通過SDS-PAGE、Western blot（PCV2單克隆抗體為一抗）進(jìn)行鑒定并測(cè)定濃度。

1.4 PCV2b病毒樣顆粒動(dòng)態(tài)光散射鑒定及透射電鏡觀察

通過動(dòng)態(tài)光散射及透射電鏡對(duì)純化得到的Cap、CapE2蛋白分別進(jìn)行分析，以評(píng)估其水化半徑和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。各取出適量純化的重組蛋白，分別滴于碳膜銅網(wǎng)上，室溫靜置90 s，用濾紙緩緩吸去碳膜上的液體，晾置30 s后，以pH值為7.0、1%的磷鎢酸染液染色1 min，用濾紙緩慢吸去膜上多余染液，避風(fēng)干燥后于透射電鏡下觀察。

1.5 動(dòng)物免疫試驗(yàn)及抗體效價(jià)測(cè)定

將采購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的16只6～8周齡的Balb/c雌性小鼠隨機(jī)分為4組，分別以10μg的Cap、CapE2對(duì)其進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫，每間隔14 d免疫一次，共免疫3次，并設(shè)置勃林格殷格翰公司的PCV2亞單位商品疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照、PBS作為陰性對(duì)照；分別于首次免疫后14、28、42 d對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行斷尾采血，將收集到的樣品置于37℃靜置2 h后離心分離血清。

利用江蘇無(wú)錫優(yōu)聯(lián)PCV2抗體檢測(cè)ELISA試劑盒檢測(cè)所采集血清中的抗體效價(jià)，將待檢血清40倍稀釋后與陰、陽(yáng)性對(duì)照分別加入酶標(biāo)板中，與包被的抗原在37℃孵育30 min，每孔加入200μL洗滌液沖洗5次，甩干多余液體；每孔加入100μL酶標(biāo)二抗，37℃靜置30 min，棄去孔中液體，洗滌液沖洗5次，甩干多余液體；再加入試劑盒中顯色液，避光顯色10 min，隨即加入終止液，并于酶標(biāo)儀上以630 nm的波長(zhǎng)對(duì)樣品OD值進(jìn)行讀數(shù)。

1.6 血清中和抗體效價(jià)測(cè)定

第2次加強(qiáng)免疫后，收集血清樣品進(jìn)行中和試驗(yàn)。將待檢血清進(jìn)行2倍系列稀釋，分別與200 TCID50的PCV2b病毒液等量均勻混合，并同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性血清和陰性血清為對(duì)照組，于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后，將混合液緩慢加入提前鋪有單層PK15細(xì)胞的96孔板中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，于倒置顯微鏡下通過IPMA檢測(cè)細(xì)胞染色情況。中和抗體效價(jià)通過計(jì)算完全抑制病毒感染的血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體pFastBacTMⅠ-cap和pFastBacTMⅠ-capE2的鑒定

利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ將目的片段構(gòu)建到pFastBacTMⅠ載體上，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)獲得的陽(yáng)性重組菌進(jìn)行PCR鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），在預(yù)期目的片段大小處出現(xiàn)明顯的條帶，pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2擴(kuò)增條帶大小分別為714、750 bp。將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液送上海生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定，結(jié)果與預(yù)期序列吻合。

圖1 重組載體p FastBac TMⅠ-cap、p FastBac TMⅠ-capE2 PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of recombinant vectors pFastBacTMⅠ-cap，p FastBac TMⅠ-capE2

2.2 重組蛋白Cap和Cap E2的表達(dá)、純化及鑒定

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2轉(zhuǎn)染sf21細(xì)胞，傳至第4代后，培養(yǎng)至72 h收集細(xì)胞，對(duì)sf21細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示，在28 ku處出現(xiàn)清晰明顯的條帶，與預(yù)期重組蛋白的大小一致，證明重組蛋白成功表達(dá)。裂解液進(jìn)一步經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，得到純度較高的重組蛋白Cap、CapE2（圖2）。

圖2重組蛋白Cap、Cap E2的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysisof Cap，Cap E2 recombinant proteins

以PCV2單克隆抗體為一抗對(duì)目的蛋白分別進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示，目的蛋白在28 ku處均產(chǎn)生特異反應(yīng)條帶（圖3），表明純化后的蛋白質(zhì)均能與PCV2單克隆抗體反應(yīng)良好。

圖3 重組蛋白Cap、Cap E2的Western blot鑒定Fig.3 Identification of Cap，Cap E2 recombinant proteins by Western blot

2.3 PCV2b VLP的形態(tài)鑒定

將附著有目的蛋白的銅網(wǎng)置透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Cap、CapE2均形成了直徑約17 nm的病毒樣顆粒（圖4）。動(dòng)態(tài)光散射分析顯示，目的蛋白Cap、CapE2均形成了顆粒狀物質(zhì)，直徑分布在17 nm左右（圖5）。

圖4 重組蛋白Cap、Cap E2 VLP形態(tài)觀察Fig.4 VLPmorphology of Cap and CapE2 recombinant proteins

圖5 重組蛋白Cap、Cap E2動(dòng)態(tài)光散射分析Fig.5 Dynamic light scattering analysis of Cap and Cap E2 recombinant proteins

2.4 重組蛋白Cap、Cap E2免疫血清ELISA抗體效價(jià)測(cè)定

分別以Cap、CapE2、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照免疫小鼠后，收集免疫血清，以ELISA方法測(cè)定血清中的抗體水平。如圖6所示，相比PBS組，其余免疫組在首免后均能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，在2次加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著提高，并持續(xù)至3免后第14天。雖然第2次免疫重組蛋白后血清抗體水平略低于疫苗組，但目的蛋白（Cap、CapE2）組抗體水平在第3次免疫后均超過疫苗組，其中，CapE2抗體水平顯著高于Cap（P＜0.05）和疫苗組（P＜0.01），并保持了較好的增長(zhǎng)趨勢(shì)。

圖6 重組蛋白Cap、Cap E2免疫血清抗體效價(jià)檢測(cè)Fig.6 Antibody detection of Cap and Cap E2 recombinant proteins immunized serums

2.5 重組蛋白Cap、Cap E2免疫血清中和抗體效價(jià)測(cè)定

對(duì)2次加強(qiáng)免疫后第14天采集的小鼠血清與PCV2病毒進(jìn)行中和抗體效價(jià)測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。試驗(yàn)組均具有較高的中和效價(jià)；而Cap組（P＜0.01）與CapE2組（P＜0.01）血清中的PCV2中和抗體水平均顯著優(yōu)于疫苗組，CapE2組血清中和效價(jià)高達(dá)1∶29。

圖7重組蛋白Cap、Cap E2免疫血清中和抗體測(cè)定Fig.7 Neutralizing antibody determination of Cap and Cap E2 recombinant proteins immunized serums

3 結(jié)論與討論

PCV2是引起PCVAD的主要病原體，在臨床上通常導(dǎo)致病豬生長(zhǎng)緩慢、呼吸困難、日漸消瘦等癥狀，病情嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。目前，針對(duì)PCV2的防控手段主要是疫苗接種，在市場(chǎng)上滅活苗和亞單位疫苗占據(jù)了主導(dǎo)地位[15]，但滅活苗成本相對(duì)較高，并且可能因滅活不完全存在潛在毒性的威脅[16]，亞單位疫苗相比滅活苗而言，有著安全高效、節(jié)約成本、產(chǎn)生的免疫刺激顯著等優(yōu)點(diǎn)[17]。研究表明，PCV2 Cap蛋白連接自身或外源中和表位均能有效地刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對(duì)Cap蛋白的抗體[10]。本研究成功表達(dá)了帶有自身中和表位的嵌合Cap蛋白，能夠與PCV2單克隆抗體發(fā)生特異反應(yīng)，體外形成病毒樣顆粒并能夠有效激活體液免疫。

目前，大多數(shù)商用PCV2亞單位疫苗將重組Cap蛋白表達(dá)在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以自組裝成VLP，采用蔗糖密度梯度離心的方法純化后的VLP不含哺乳動(dòng)物細(xì)胞組分，安全性好，因此該系統(tǒng)廣泛用于構(gòu)建VLP[18]。本研究將中和表位226LKDPPLNP233重復(fù)串聯(lián)于PCV2 Cap蛋白C端，利用真核表達(dá)系統(tǒng)以桿狀病毒為載體在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白Cap、CapE2。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，Cap、CapE2重組蛋白在28 ku處均有明顯條帶出現(xiàn)。Western blot鑒定分析，Cap、CapE2重組蛋白經(jīng)純化后在28 ku處均能與PCV2單克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)，證明所得到的目的蛋白均具有良好的免疫原性。

相比大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾[19]，避免了重組蛋白在大腸桿菌中易形成包涵體的弊端，使重組蛋白具有與病毒天然蛋白相似的結(jié)構(gòu)和活性，更有利于VLP的的形成[20]。本研究中，動(dòng)態(tài)光散射和透射電鏡分析結(jié)果表明，目的蛋白Cap、CapE2均形成了直徑在17 nm左右的病毒樣顆粒，證明連接自身中和表位對(duì)Cap形成VLP并無(wú)明顯影響。此外，與在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[21]中得到的PCV2 VLP相比，本研究得到的VLP形態(tài)更完整，大小更均一。

病毒樣顆粒無(wú)病毒核酸，不能自主復(fù)制，卻具有與病毒相同的形態(tài)。因此，在保證安全性的同時(shí)，可通過與病毒相同的途徑刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，結(jié)構(gòu)完善的病毒樣顆粒更能有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[22]。將純化后的重組蛋白進(jìn)行免疫試驗(yàn)。前2次免疫后，CapE2組的免疫效果均優(yōu)于Cap組，在第3次加強(qiáng)免疫后，CapE2組抗體水平顯著高于Cap和疫苗免疫對(duì)照組，并有持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，證明免疫CapE2蛋白后能夠激發(fā)更長(zhǎng)的免疫保護(hù)期。血清抗體檢測(cè)結(jié)果表明，Cap、CapE2蛋白均能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而相比原核表達(dá)的Cap蛋白[23]，本研究表達(dá)的Cap蛋白更為有效，這可能與真核系統(tǒng)表達(dá)出的蛋白質(zhì)形成了具有良好結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒有關(guān)。中和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，相比商業(yè)疫苗，Cap、CapE2蛋白更能夠有效刺激中和抗體產(chǎn)生。

綜上，本研究通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了重復(fù)連接226LKDPPLNP233中和表位的重組Cap蛋白，該蛋白質(zhì)自組裝形成病毒樣顆粒，并在動(dòng)物試驗(yàn)中具有較好的免疫反應(yīng)，且完全中和PCV2病毒的血清抗體稀釋倍數(shù)高達(dá)29，對(duì)PCV2亞單位疫苗的研制具有重要意義。