蘋果Md LAC基因家族成員的鑒定與序列分析

楊 陽，劉媛媛

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

漆酶（Laccase,LAC）是多銅氧化酶較大的亞家族之一，能結(jié)合多個(gè)銅離子。LAC具有廣泛的底物，如氧化雙酚、氨基或甲氧基取代的單酚、芳香二胺和羥胺組分等[1-3]。典型的LAC含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:N端和C端以及雙核銅離子中心位點(diǎn)（CuA和CuB）。其中，CuA位點(diǎn)的氨基酸保守性較CuB位點(diǎn)強(qiáng)[4]，可以結(jié)合4個(gè)銅離子。LAC普遍存在于細(xì)菌[5]、真菌[6]和動植物[7]中。在不同的物種中，LAC發(fā)揮不同的功能，如參與傷口愈合和木質(zhì)素生物合成[8-11]，提高植物對酚酸類物質(zhì)的抗性[12-14]及對黃萎病的抗性[15]。

蘋果是世界范圍內(nèi)廣泛種植的園藝作物，在干旱、鹽堿等非生物脅迫下，其產(chǎn)量和品質(zhì)均受到一定的影響。因此，蘋果在各種脅迫下的抗性研究成為熱點(diǎn)。目前，對蘋果基因家族的鑒定研究報(bào)道很多，但未見有蘋果漆酶（MdLAC）基因家族的報(bào)道。為此，對蘋果MdLAC基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、多序列比對、染色體定位和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，為研究蘋果MdLAC基因家族生物功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蘋果Md LAC基因家族成員的鑒定、理化性質(zhì)及染色體定位分析

蘋果基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)均下載于薔薇科基因組網(wǎng)站GDR（http：//www.rosaceae.org）。擬南芥LAC蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)下載于擬南芥網(wǎng)站（TAIR，http://www.arabidopsis.org），梨[16]（Pyrus bretschneideri）、苔 蘚（Physcomitrella patens）LAC蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)下載于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。通過在線軟件Pfam（http://pfam.xfam.org/）下載LAC基因隱馬爾可夫模型（PF07731、PF00394、PF07732），利用HMMER軟件搜索蘋果蛋白質(zhì)組中LAC蛋白序列，利用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de/）軟件網(wǎng)站對初步篩選得到的候選基因家族成員的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定蘋果MdLAC基因家族成員。利用在線軟件ExPASy（https://www.expasy.org/）對蘋果MdLAC基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析，應(yīng)用在線軟件CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，采用在線軟件MapGene2Chromosome 2.0(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)進(jìn)行染色體定位分析。

1.2 蘋果Md LAC基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA軟件和在線工具iTOL（https://itol.embl.de/）對鑒定的MdLAC蛋白序列、18個(gè)AtLAC蛋白序列、45個(gè)PbLAC蛋白序列和4個(gè)PpLAC蛋白序列，采用鄰近法（Bootstrap設(shè)置為1 000），構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 蘋果Md LAC基因家族成員基因結(jié)構(gòu)、保守基序分析

利 用 在 線 軟 件GSDS（https://itol.embl.de/）分 析MdLAC基因結(jié)構(gòu)，采用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/)和TBtools軟件分析保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 蘋果Md LAC氨基酸序列比對

利用DNAMAN軟件對蘋果MdLAC蛋白序列進(jìn)行氨基酸多序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果Md LAC基因家族成員的鑒定及染色體定位分析

通過HMMER和SMART軟件篩選，在蘋果中共鑒定到77個(gè)MdLAC基因家族成員，根據(jù)在染色體的位置將其命名為MdLAC1—MdLAC77（表1）。對蘋果MdLAC基因家族成員進(jìn)行氨基酸序列長度、分子質(zhì)量及等電點(diǎn)預(yù)測分析，結(jié)果表明，77個(gè)MdLAC蛋白氨基酸序列長度在323～611，分子質(zhì)量大小在36.29～67.87 ku，等電點(diǎn)（pI）在4.65～9.92，多數(shù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)大于7，說明該基因家族成員大多數(shù)為堿性蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位分析表明，大部分MdLAC蛋白定位在細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)，少量定位在外膜上，表明MdLAC蛋白家族成員在不同的微環(huán)境下功能不同[17]。有的蛋白質(zhì)定位不止在1個(gè)位置，也進(jìn)一步說明了這些蛋白質(zhì)可能具有多重功能。與前人對大白菜LAC蛋白相關(guān)功能的報(bào)道，定位在胞外的LAC主要參與木質(zhì)素合成和細(xì)胞壁的形成，而定位在細(xì)胞質(zhì)的LAC主要參與大白菜芝麻狀斑點(diǎn)病的發(fā)生過程[18]。

表1 蘋果Md LAC基因家族成員信息Tab.1 The information of Md LAC family members in apple

續(xù)表1 蘋果Md LAC基因家族成員信息Tab.1（Continued）The information of Md LAC family members in apple

續(xù)表1 蘋果Md LAC基因家族成員信息Tab.1（Continued）The information of Md LAC family members in apple

從圖1可以看出，MdLAC基因家族成員不均勻地分布在蘋果18條染色體上，其中，Chr08、Chr09、Chr14和Chr17上只有1個(gè)基因分布，分別是MdLAC43、MdLAC44、MdLAC67和MdLAC77；Chr06和Chr16上各有2個(gè)基因，分別為MdLAC32、MdLAC33和MdLAC75、MdLAC76；Chr11上分布MdLAC50—MdLAC59，為18條染色體上分布最多的，占全部MdLAC基因的13%；Chr03上分布6個(gè)基因（MdLAC13—MdLAC18），位于染色體的上端，同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在Chr11；有6個(gè)MdLAC基因（MdLAC4—MdLAC9）定位在Chr01上，位于染色體的末端；此外，有8個(gè)MdLAC基因（MdLAC34—MdLAC41）定位在Chr07的末端。

圖1 蘋果Md LAC基因家族成員染色體定位Fig.1 Chromosome location of Md LAC gene family members in apple

2.2 蘋果Md LAC基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將鑒定到的77個(gè)蘋果MdLAC蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并根據(jù)擬南芥AtLAC基因功能對其進(jìn)行分組（圖2）。從 圖2可 以 看 出，MdLAC34、MdLAC49、MdLAC77等30個(gè)MdLAC基因和擬南芥AtLAC6、AtLAC8聚為一支。AtLAC8會影響植物開花時(shí)間[19]，AtLAC6在生物脅迫下表達(dá)量會下調(diào)[20]，推測這支MdLAC基因可能與植物開花時(shí)間和生物脅迫有關(guān)。MdLAC3、MdLAC12、MdLAC74與 擬 南 芥AtLAC15、AtLAC16聚為一支。擬南芥AtLAC15主要負(fù)責(zé)類黃酮物質(zhì)的合成[21]，據(jù)此推測，該支中的蘋果MdLAC74、MdLAC1、MdLAC12等MdLAC基因同樣具有合成類黃酮的作用。擬南芥AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17基因在影響細(xì)胞壁木質(zhì)化和調(diào)控木質(zhì)素單體上有重要作用[22]，推測該支中的蘋果MdLAC基因具有類似的功能。AtLAC5、AtLAC13基因?qū)BA信號途徑有響應(yīng)[23]，由此推測，蘋果MdLAC23、MdLAC76、MdLAC62、MdLAC63、MdLAC24、MdLAC25、MdLAC15、MdLAC53、MdLAC52、MdLAC38、MdLAC5、MdLAC6、MdLAC39基因可能通過響應(yīng)ABA信號途徑增強(qiáng)蘋果對非生物脅迫下的逆境抗性。

圖2 蘋果Md LAC基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Md LAC gene family members in apple

2.3 蘋果Md LAC基因結(jié)構(gòu)、保守基序分析

從圖3可以看出，MdLAC基因的UTR個(gè)數(shù)最多不多于2個(gè)，部分MdLAC（MdLAC3、7、30、33、35、36、53、61、63、71、76）基因無UTR，所有基因的CDS個(gè)數(shù)在2～10個(gè)，其中，24個(gè)MdLAC基因具有6個(gè)CDS，19個(gè)MdLAC基因具有5個(gè)CDS，只有MdLAC59基因具有10個(gè)CDS，4個(gè)MdLAC基因（MdLAC7、13、51、62）有2個(gè)CDS，其他MdLAC分別含有3、5、7、8、9個(gè)CDS。

圖3 蘋果Md LAC基因家族成員基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Gene structure analysis of Md LAC gene family members in apple

為了進(jìn)一步闡明MdLAC基因家族的結(jié)構(gòu)特征，對蘋果MdLAC基因家族成員的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在基因進(jìn)化上,MdLAC基因進(jìn)化結(jié)果與其Motif組成和位置分布較為一致（圖4）。MdLAC基因中，Motif 1最為保守，共由41個(gè)氨基酸位點(diǎn)組成，在第2、11、19、28、32位為保守氨基酸位點(diǎn)，對應(yīng)殘基分別為天冬酰胺、蘇氨酸、色氨酸、天冬酰胺和色氨酸。

圖4 蘋果Md LAC基因家族Motif結(jié)構(gòu)（A）、基因進(jìn)化（B）及Motif組成（C）分析Fig.4 Analysis of Motif structure（A），gene evolution（B）and Motif composition（C）of Md LAC gene family in apple

77個(gè)MdLAC基因中，Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 6、Motif 8、Motif 9、Motif 10相對保守，其中，Motif 4一般位于最前端，Motif 9一般位于末端，MdLAC75明顯缺失Motif 6、Motif 7、Motif 1、Motif 9、Motif 3和Motif 10，而MdLAC48只含有Motif 8、Motif 5和Motif 1，MdLAC71雖然含有大多數(shù)Motif，但Motif位置與其他MdLAC位置不同。

2.4 蘋果Md LAC氨基酸序列比對

從圖5可以看出，蘋果MdLAC含有LAC保守結(jié)構(gòu)域，且位置相對一致，氨基酸序列差異不大，共有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)，分別為G、P、W。

圖5蘋果Md LAC氨基酸序列比對Fig.5 Comparison of amino acid sequences of Md LAC in apple

3 結(jié)論與討論

LAC以基因家族的形式存在于植物中，且成員眾多，功能具有多樣性[7]。目前，已在多種植物中對LAC基因家族成員進(jìn)行鑒定，如大白菜[18]中15個(gè)、狗尾草[24]中52個(gè)、龍眼[25]中42個(gè)等。陸地棉中，過表達(dá)GhLAC15基因會增加木質(zhì)素的合成，提高植株的抗病性[26]。在擬南芥中，BARROS等[3]和POURCEL等[27]研究證明，AtLAC15具有雙重功能，可以催化類黃酮和單甘醇的聚合。LIU等[28]研究水稻LAC時(shí)發(fā)現(xiàn)，OsLAC10和木質(zhì)素生物合成及非生物脅迫響應(yīng)均有關(guān)。研究表明，在高等植物中，LAC基因的表達(dá)除受環(huán)境等影響外，還會受到轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的調(diào)控[29]。LU等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在不同組織部位中PtLAC的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用有關(guān)。

本研究對蘋果MdLAC基因家族進(jìn)行鑒定，共得到77個(gè)家族成員，編碼的氨基酸序列長度在323～611，部分MdLAC蛋白定位在細(xì)胞外，屬于分泌蛋白；其他MdLAC蛋白在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)膜和外膜上也有定位。將蘋果MdLAC基因、梨PbLAC基因、擬南芥AtLAC基因和苔蘚PpLAC基因共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時(shí)將蘋果MdLAC基因家族成員進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)，其中一支包括4個(gè) 苔 蘚PpLAC基 因（PpLAC1、PpLAC2、PpLAC3、PpLAC4），這4個(gè)基因的存在證明蘋果基因組中保留了古老的基因重復(fù)，但LAC基因的普遍性和多樣化應(yīng)該發(fā)生在苔蘚-裸子植物分化之后[31]。

近年來，蘋果在各種脅迫下相關(guān)的抗性基因陸續(xù)被鑒定[32-35]。本研究利用生物信息學(xué)方法對蘋果MdLAC基因家族成員進(jìn)行鑒定及多序列分析，以期為后續(xù)蘋果MdLAC基因的功能研究提供思路,為提高蘋果抗性研究提供方向。