煙草鐮刀菌根腐病病原菌的鑒定及其對5種殺菌劑的敏感性分析

劉利佳，李芳芳，何 雷，彭玉富，丁永樂，孫聚濤

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省煙草公司，河南 鄭州 450000；3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000)

煙草鐮刀菌根腐病是一種嚴重的土傳病害，在全國各煙區(qū)的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，據(jù)田艷艷等[1]調(diào)查結(jié)果顯示，河南地區(qū)煙田發(fā)病率達到30%，對煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴重的影響[2]。因此，開展煙草鐮刀菌根腐病的防治研究具有重要意義。

煙草鐮刀菌根腐病病原菌的種類存在地域差異[2-3]。桑維鈞等[4]研究發(fā)現(xiàn)，貴州省煙草鐮刀菌根腐病的主要致病菌是茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌。陳高航[5]在湖北恩施研究發(fā)現(xiàn)，煙草鐮刀菌根腐病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌。田艷艷等[1]等研究表明，河南地區(qū)煙草鐮刀菌根腐病的主要病原菌為尖孢鐮刀菌。目前，對煙草鐮刀菌根腐病的防治以化學(xué)農(nóng)藥為主，一般采用衛(wèi)福、惡霉靈、甲霜靈和克菌丹等藥劑進行防治[6-8]。陳琳[6]測定了衛(wèi)福、惡霜靈及五硝基苯胺對尖孢鐮刀菌的抑制率，發(fā)現(xiàn)這3種藥劑不能有效防治尖孢鐮刀菌。陳志敏[7]對5種防治藥劑的試驗發(fā)現(xiàn)，5種殺菌劑對煙草鐮刀菌根腐病菌的毒力存在差異，世高和瑞毒脫對該病菌有較好的抑制效果，復(fù)配后相對防效最高為79.7%，而三唑酮和甲霜靈錳鋅對煙草鐮刀菌根腐病菌的抑制效果較差。陳長卿等[8]研究了克菌丹對煙草鐮刀菌根腐病的防治效果，發(fā)現(xiàn)克菌丹的相對防效僅為46.75%，其抑菌效果顯著低于精甲·惡霉靈。由于煙草鐮刀菌根腐病病原菌寄主范圍廣、致病能力強且易變異，常用的化學(xué)藥劑防治效果不佳。針對當(dāng)前防治煙草鐮刀菌根腐病的有效化學(xué)藥劑較少和常用藥劑防治效果不理想的現(xiàn)狀，對煙草鐮刀菌根腐病原菌進行分類鑒定并篩選高效抑制病原菌的殺菌劑具有重要意義。因此，對前期從河南省襄城縣煙草鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根部分離出的菌株NC-11進行鑒定，并比較5種殺菌劑對其菌絲生長的抑制率及抑制中濃度，篩選出毒力最強的殺菌劑進行田間驗證，為生產(chǎn)上防治煙草鐮刀菌根腐病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株NC-11是2019年由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種實驗室從河南省襄城縣煙草鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根部分離出的菌株。

供試藥劑：供試殺菌劑共5種，分別是金雷、亮盾、適樂時、國光健致、增威贏綠+易保。其中金雷、亮盾、適樂時有效成分及劑型分別為68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑(WG)、62.5 g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑(FSC)和25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑（FSC），均由瑞士先正達作物保護有限公司生產(chǎn)；國光健致有效成分及劑型為30%精甲·惡霉靈水劑(AS)，由陜西先農(nóng)生物科技有限公司生產(chǎn)；增威贏綠+易保有效成分及劑型為10%氟噻唑吡乙酮可分散油懸劑(OD)+68.75%惡酮·錳鋅水分散粒劑(WG)，由美國杜邦公司生產(chǎn)[9-10]。

供試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）、康乃馨葉片培養(yǎng)基（CLA）。

1.2 供試菌株NC-11的形態(tài)學(xué)鑒定、分子鑒定及致病力鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將保存的菌株NC-11在直徑90 mm的PDA培養(yǎng)基上活化，置于28℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7 d，觀察其菌落形態(tài)。用無菌牙簽挑取菌絲制成玻片，在10×40倍顯微鏡下觀察NC-11的菌絲。取直徑為5 mm的打孔器，經(jīng)灼燒消毒后，沿菌落邊緣均勻打制新鮮菌餅，在無菌操作臺中分別接種至滅菌的PDB培養(yǎng)液和CLA培養(yǎng)液中，每150 mL培養(yǎng)液接種5個新鮮菌餅。封口后置于25℃、150 r/min的搖床上搖培3～5 d，以PDB培養(yǎng)液搖培后可得到以小型分生孢子為主的小型分生孢子培養(yǎng)液，以CLA培養(yǎng)液搖培后可得到以大型分生孢子為主的大型分生孢子培養(yǎng)液。用移液槍分別吸取20μL孢子培養(yǎng)液制成玻片，觀察小型分生孢子形態(tài)和大型分生孢子形態(tài)[11-13]。

1.2.2 分子鑒定 采用試劑盒Solarbio Fungi Genomic DNA Extraction Kit提取供試菌株NC-11的DNA。以提取的DNA為模板，用鑒定鐮刀菌的引物EF-1(3′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-5′)和EF-2（3′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-5′）進行PCR擴增。引物由河南尚亞生物技術(shù)有限公司合成。Marker為DL2000 DNA Marker,擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離。目的片段經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收純化，并由河南尚亞生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 致病力鑒定 選取長勢一致的4～5葉期健康煙草幼苗（中煙100），將煙草植株根部用無菌剪刀剪去根尖制造傷口，然后將煙草植株根部在孢子濃度為1×106個/mL的NC-11孢子懸浮液中浸泡10 min，使其根部充分接觸鐮刀菌孢子，而后將煙草幼苗移栽進經(jīng)高溫滅菌過的無菌基質(zhì)中培養(yǎng)30 d，以清水作為對照。30 d后將根部基質(zhì)洗凈，觀察供試菌株NC-11的致病力。

1.3 菌株NC-11對殺菌劑的敏感性測試

1.3.1 制備菌餅 將保存的菌株NC-11在PDA培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)5～7 d。取直徑為5 mm的打孔器，經(jīng)灼燒消毒后，在菌落邊緣均勻打制新鮮菌餅，備用。

1.3.2 生長速率測定 配制培養(yǎng)基時，將培養(yǎng)基濃度定容至標(biāo)準培養(yǎng)基濃度的90%，再分別將5種供試殺菌劑用無菌水稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度（表1）的10倍母液。在無菌操作臺中，待培養(yǎng)基冷卻至50～60℃時，分別將殺菌劑母液與培養(yǎng)基以1∶9的比例輕輕混合均勻，配制成含不同質(zhì)量濃度藥劑的培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中制備平板，平板冷卻后即為藥劑培養(yǎng)基。將制備的菌餅分別接種于不同質(zhì)量濃度的含藥平板的中心，28℃培養(yǎng)5 d，以十字交叉法測量各菌落直徑。每種殺菌劑每個質(zhì)量濃度（有效成分，下同）重復(fù)3次。采用SPSS統(tǒng)計軟件分析并求得殺菌劑對NC-11菌絲生長的抑制率及毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)、有效抑制中濃度（EC50）[11]。抑制率按照以下公式計算：

表1 藥劑培養(yǎng)基有效質(zhì)量濃度Tab.1 Effective mass concentration of pharmaceutical medium

抑制率=(對照菌落增長直徑-處理的菌落增長直徑)/對照菌落增長直徑×100%。

以設(shè)定的質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)（x），抑制率概率值為縱坐標(biāo)（y），求得毒力回歸方程y=a+bx。

1.4 煙草鐮刀菌根腐病的田間防效試驗

根據(jù)1.3.2的測定結(jié)果，選擇抑菌效果最好的殺菌劑進行田間防效驗證。試驗設(shè)置在河南省許昌市襄城縣，選擇采集分離菌株NC-11的病田進行煙草鐮刀菌根腐病的田間防效試驗，該田2019年鐮刀菌根腐病發(fā)病較為嚴重且發(fā)病程度均勻。試驗田塊面積為2 668 m2，其中1 334 m2為不施用殺菌劑的對照組，另1 334 m2為施用殺菌劑的試驗組，煙株行距為1.2 m、株距為0.5 m。2020年4月15日將煙苗移栽至大田，試驗組分別于移栽后7、14、21 d用62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC以62.50 mg/L（有效成分質(zhì)量濃度，下同）進行灌根，每棵煙株每次灌根1 L，對照組同期用等量清水灌根，并分別于移栽后7 d（施藥前）和首次施藥后16、31、46、57、77 d調(diào)查試驗組和對照組的發(fā)病率及病情指數(shù)。調(diào)查采用五點取樣法，每個點調(diào)查10株煙株，病情指數(shù)分級參考邱睿等[14]的分級標(biāo)準。利用Excel進行數(shù)據(jù)分析，計算其發(fā)病率、病情指數(shù)、病情指數(shù)增長率和相對防效[13-14]。公式如下：

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總調(diào)查株數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑（各病級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100%；

病情指數(shù)增長率=（基數(shù)病情指數(shù)-施藥后病情指數(shù)）/基數(shù)病情指數(shù)×100%；

相對防效=（對照區(qū)病情指數(shù)增長率-處理區(qū)病情指數(shù)增長率）/對照區(qū)病情指數(shù)增長率×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株NC-11的形態(tài)學(xué)鑒定、EF序列測定及致病力鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 供試菌株NC-11在PDA培養(yǎng)基上菌絲擴展速度較快，通常3～7 d布滿培養(yǎng)皿表面，菌落表面干燥，質(zhì)地緊密，呈棉絮狀或絨毛狀，表面隆起或有氣生菌絲，邊緣呈波狀或卷曲。菌落不透明，菌絲白色，隨菌落擴展，菌落背面會產(chǎn)生紅、紫、黃色等色素沉積在培養(yǎng)基上。小型分生孢子為卵圓形或橢圓形，多數(shù)為單細胞，少數(shù)為雙細胞結(jié)構(gòu)，大小為(5～12)μm×(2.5～3.5)μm；大型分生孢子為鐮刀形，具3～5個隔膜，壁薄，呈紡錘形至錐狀，兩段尖，頂端有鉤狀結(jié)構(gòu)，大小為(27～60)μm×(3～5)μm；厚垣孢子壁表光滑，間生或頂生（圖1）。根據(jù)Booth關(guān)于鐮刀菌屬的分類標(biāo)準[13,15]，NC-11符合尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）的形態(tài)特征。

圖1 供試菌株NC-11的形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphological identification of the tested strain NC-11

2.1.2 分子鑒定結(jié)果 以NC-11的DNA為模板，采用引物EF-1、EF-2擴增的PCR片段的電泳圖譜（圖2）顯示，擴增出的片段大約700 bp。對擴增產(chǎn)物測序后，包含引物在內(nèi)的片段長度為708 bp。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的尖孢鐮刀菌BLAST比對發(fā)現(xiàn)，NC-11與芝麻尖孢鐮刀菌（MN417202.1Fusarium oxysporium，中國）相似度較高。用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）發(fā)現(xiàn)，NC-11與Fusarium oxysporium菌株MN417202.1聚為一支。

圖2 EF引物擴增的供試菌株NC-11產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis pattern of the tested strain NC-11 amplified by EF primer

圖3 供試菌株NC-11的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the tested strain NC-11

2.1.3 致病力鑒定結(jié)果 從圖4可以看出，煙株接種供試菌株NC-11后生長受到明顯抑制。煙株底腳葉變黃，植株矮化，并長出大量須根，根系發(fā)黃，根尖出現(xiàn)濕腐癥狀，整體呈鐮刀菌根腐病發(fā)病特征。從根部發(fā)病部位可分離到與NC-11性狀一致的培養(yǎng)物。說明所分離的菌株NC-11確能引起煙草鐮刀菌根腐病。綜合NC-11的形態(tài)學(xué)鑒定、分子鑒定及致病性鑒定結(jié)果，可以判定NC-11是煙草鐮刀菌根腐病的病原菌尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporium）。

圖4 對照及接種供試菌株NC-11的煙株形態(tài)對比Fig.4 Morphological comparison of tobacco between control and inoculation of the tested strain NC-11

2.2 不同殺菌劑對煙草鐮刀菌根腐病菌NC-11菌絲生長的抑制效果

由表2可見，5種供試殺菌劑對NC-11的菌絲生長均有不同程度的抑制作用，其抑制率隨質(zhì)量濃度增加呈增加趨勢。其中，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC不同質(zhì)量濃度處理菌落直徑均差異顯著，且均較CK顯著降低(P＜0.05)；68%精甲霜·錳鋅WG和62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC不同質(zhì)量濃度處理抑制率差異顯著。對比5種殺菌劑不同質(zhì)量濃度對NC-11的抑菌率，結(jié)果表明，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC的抑菌效果最好，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.10 mg/L時，其抑制率達到46.64%，當(dāng)質(zhì)量濃度為500.00 mg/L時，抑制率達到97.27%，各質(zhì)量濃度之間差異顯著；其次為30%精甲·惡霉靈AS、25 g/L咯菌腈FSC，質(zhì)量濃度為500.00 mg/L時抑制率分別可達63.21%、61.90%；68%精甲霜·錳鋅WG的抑菌效果較差，質(zhì)量濃度為500.00 mg/L時抑制率為56.50%，1 000.00 mg/L時抑制率才達到66.53%；10%氟噻唑吡乙酮OD+68.75%惡酮·錳鋅WG復(fù)配使用后，質(zhì)量濃度為1.00 mg/L時抑制率為18.45%。

表2 不同殺菌劑對NC-11菌絲生長抑制率及方差分析Tab.2 Inhibition rate of different fungicides on NC-11 mycelium growth and variance analysis

2.3 不同殺菌劑對煙草鐮刀菌根腐病菌NC-11的EC 50比較

供試殺菌劑對煙草鐮刀菌根腐病菌NC-11的EC50存在較為明顯的差異（表3），表明各藥劑對該病菌的抑菌效果存在差異。其中，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC抑菌效果最好，EC50最小，僅為0.186 2 mg/L，毒力最強。對NC-11毒力較強的還有10%氟噻唑吡乙酮OD+68.75%惡酮·錳鋅WG、30%精甲·惡霉靈AS、25 g/L咯菌腈FSC，其EC50分別為25.628 9、61.078 5、91.017 6 mg/L，抑菌效果較好。68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑的抑菌效果最差，EC50為203.152 2 mg/L。

表3 不同殺菌劑對煙草鐮刀菌根腐病菌的抑菌效果Tab.3 Bacteriostatic effect of different fungicides on tobacco Fusarium root rot

2.4 62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC對煙草鐮刀菌根腐病的大田防效

62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC對煙草鐮刀菌根腐病的大田防效見表4，未經(jīng)62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC灌根處理的對照組田塊煙株煙草鐮刀菌根腐病的自然發(fā)病率整體均高于試驗組田塊。煙草生長至團棵期（首次施藥后16 d）時，煙株鐮刀菌根腐病的發(fā)病情況較輕，試驗組的病情指數(shù)為4.40，略低于對照組（4.67），此時相對防效為40.00%；首次施藥后31、46 d，煙株進入旺長期，試驗組較對照組發(fā)病率出現(xiàn)明顯降低，對照組發(fā)病率達到16.38%、20.67%，試驗組發(fā)病率僅11.33%、11.96%，首次施藥后46 d相對防效達72.69%；首次施藥后57、77 d時，煙株進入成熟期，對照組自然發(fā)病率達到22.33%、24.13%，而經(jīng)62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC灌根處理的試驗組發(fā)病率僅12.45%、14.00%，較對照組明顯降低，但此時相對防效為69.08%、66.90%。

表4 62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC對煙草鐮刀菌根腐病的大田施藥防治效果Tab.4 Field control effect of metalaxyl-M·fludioxonil 62.5 g/L FSC on Fusarium root rot of tobacco

3 結(jié)論與討論

本研究對從河南省襄城縣煙草鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根部分離出的菌株NC-11進行形態(tài)學(xué)及致病性鑒定，結(jié)果表明，NC-11符合尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporium)的特征[12-16]，采用EF引物進行分子鑒定，結(jié)果表明，該病原菌是尖孢鐮刀菌。

通過5種殺菌劑對NC-11菌株的毒力測定得出供試殺菌劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值，結(jié)果表明，供試殺菌劑中，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC對煙草鐮刀菌根腐病菌NC-11的抑制效果最好，其EC50較低（0.186 2 mg/L），且隨著質(zhì)量濃度的提高，對NC-11生長抑制作用增強，最高抑菌率達97.27%。其余4種殺菌劑的抑菌效果由高到低依次為10%氟噻唑吡乙酮OD+68.75%惡酮·錳鋅WG、30%精甲·惡霉靈AS、25 g/L咯菌腈FSC、68%精甲霜·錳鋅WG。62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC之所以抑菌率較高，是因為該藥劑是由精甲霜靈和咯菌腈復(fù)配而成的殺菌劑，其中精甲霜靈的主要作用機制是通過抑制rRNA的合成而抑制病原菌在寄主體內(nèi)發(fā)展。30%精甲·惡霉靈AS和68%精甲霜·錳鋅WG同樣有精甲霜靈的作用，但抑菌效果不佳，其原因可能與病原菌的抗藥性提高有關(guān)[17-18]。而62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC由于精甲霜靈復(fù)配咯菌腈后，可能提高了尖孢鐮刀菌菌株對藥劑的敏感性[17-22]。

田間驗證結(jié)果表明，精甲·咯菌腈FSC以質(zhì)量濃度62.50 mg/L在移栽后進行灌根處理，首次施藥46 d后相對防效達72.69%，而后防效逐步降低。首次施藥77 d后相對防效為66.90%。這是因為尖孢鐮刀菌致病能力受溫濕度等因素影響較大，在河南省襄城縣，烤煙生長進入煙葉成熟期時（7月下旬到8月上旬）正值高溫高濕季節(jié)，有利于煙草鐮刀菌根腐病菌的侵染，故造成62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC對該病的防治效果有所降低。因此在實際應(yīng)用中，應(yīng)在7月上中旬補施藥劑，以防止煙株生長后期鐮刀菌根腐病的發(fā)生和發(fā)展。