向日葵抗列當(dāng)基因Or5的抗性遺傳及分子標(biāo)記篩選

張曼 孫墨可 田娟 董玉迪 賈云峰 李慧英 牛慶杰

摘要 以向日葵高感列當(dāng)E的自交系09110-21264162A為母本，與抗病自交系J-09R進(jìn)行雜交構(gòu)建F2群體，分析了向日葵抗列當(dāng)E的抗性遺傳規(guī)律，并且采用SSR技術(shù)在親本和F2代群體中篩選與抗列當(dāng)基 因Or5連 鎖的分子標(biāo)記。結(jié)果表明：F2群體的抗感比符合3∶1的分離規(guī)律，篩選出與抗列當(dāng)基因 Or5 連鎖的1個分子標(biāo)記ORS1036。經(jīng)F2分離群體驗證，該標(biāo)記的表型鑒定結(jié)果與分子檢測結(jié)果的一致性為94%。將該標(biāo)記對84份自交系進(jìn)行篩選，獲得了15份可能攜帶 Or5 基因的抗列當(dāng)資源，為抗性育種提供寶貴資源。

關(guān)鍵詞 向日葵;抗列當(dāng);SSR分子標(biāo)記

中圖分類號 S 565.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）14-0089-04

Abstract The study was carried out by crossbreeding between sunflower broomrape E susceptible inbred line 09110-21264162A and the resistant inbred line J-09R as parents to construct the F2 population.The parents，F(xiàn)1 and F2 generations were inculated with broomrape and the inheritance of resistance to the plant was analyzed according to the results of phenotype observation.The linked marker was screened with two parents and a F2 population by SSR technology.The results revealed that the identification result of the individual plant of the F2 population was in line with the antiinfection ratio of 1R：3S.The Molecular Marker，ORS1036，which was linked to ?Or5， was screened from F2 population and the parents by SSR technique.The results of phenotypic identification was 94% consistent with the molecular detection.This marker ORS1036 was used to screen 84 inbred lines and 15 materials which contained the marker were obtained，which could provide valuable resources for resistance breeding.

Key words Sunflower;Broomrape resistance gene;SSR marker

基金項目 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系和吉林省科學(xué)技術(shù)廳重點科技研發(fā)項目（20180201070NY）。

作者簡介 張曼（1987—），女，河北辛集人，助理研究員，在讀博士，從事分子育種研究。*通信作者，研究員，從事向日葵育種研究。

收稿日期 2020-11-27

向日葵列當(dāng)（ Orobanche cumana） 是1年生全寄生性雜草，依靠短須狀假根寄生在向日葵根系上存活，被列當(dāng)寄生后的向日葵植株莖稈低矮細(xì)弱，向日葵產(chǎn)量和品質(zhì)明顯降低[1-4]。

危害向日葵的列當(dāng)群體中有很多生理小種，已鑒定出編號為A～H的8個向日葵列當(dāng)小種[5-6]。在我國D小種出現(xiàn)的頻率最高，是我國向日葵列當(dāng)?shù)膬?yōu)勢生理小種。E小種主要分布于新疆和內(nèi)蒙古的不同區(qū)域[7]。

在世界范圍內(nèi)，列當(dāng)?shù)姆莱恢币詠矶际且淮箅y題。目前在生產(chǎn)上防御和控制向日葵列當(dāng)最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法就是推廣培育向日葵抗列當(dāng)品種。國內(nèi)外向日葵育種家通過室內(nèi)盆栽鑒定、田間病圃鑒定等方法已篩選得到一些向日葵抗列當(dāng)資源，成功培育出部分抗列當(dāng)品種。但是通過常規(guī)育種方法篩選的過程費力，很難針對性地培育出具體抗生理小種的向日葵品種，且育種時間長，人力成本較大，選擇效率較低[8]。分子標(biāo)記輔助選擇育種隨著植物分子生物技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運而生，為育種家在親本和后代篩選中提供了新的技術(shù)和方法。列當(dāng)抗性一般認(rèn)為是由單顯性基因控制。數(shù)量性狀基因座定位分析表明，列當(dāng)抗性受位于向日葵連鎖群LG3的主要基因 Or5 影響[9-11]，還受其他4個QTL的輕微影響。另外一些學(xué)者通過組織學(xué)和基因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，減少列當(dāng)種子萌發(fā)的刺激物或者快速拔除病株體能夠有效抗列當(dāng)小種，認(rèn)為抗小種E是由多基因組成，因此在實際工作中，應(yīng)根據(jù)具體的組合進(jìn)行抗性遺傳的相關(guān)分析。

Tang等[9]采用BSA的方法針對生理小種E的抗性基因 Or5 進(jìn)行了分子標(biāo)記篩選，結(jié)果表明，抗性基因 Or5 位于遺傳圖譜連鎖群Linkage group 3的端粒或近端粒區(qū)域，與標(biāo)記CRT392的遺傳距離為6.2 cM，與ORS1036的遺傳距離為7.5 cM。Imerovski等[12]通過對4份向日葵材料進(jìn)行基因 Or5 的分子標(biāo)記篩選，認(rèn)為ORS1036和ORS1114與該研究的基因型中 Or5 基因沒有密切聯(lián)系，說明不同遺傳背景的材料對分子鑒定具有很大影響。

目前國內(nèi)基于抗列當(dāng)基因 Or5 的分子標(biāo)記的篩選仍處于空白。該研究擬利用抗列當(dāng)E親本和感列當(dāng)E親本配制的雜交組合及F2群體為研究材料，研究在該組合中的抗性遺傳規(guī)律，采用SSR技術(shù)篩選與向日葵 Or5 連鎖的分子標(biāo)記，并且利用獲得的分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源的初步篩選，旨在為今后育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用向日葵感列當(dāng)E自交系09110-21264162A（以下簡稱09110-A）和高抗E自交系J-09R為雙親，配制F2代群體，在白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室進(jìn)行種植管理及抗性鑒定。親本、F2群體及種質(zhì)資源篩選的向日葵自交系，均由吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院向日葵研究所提供。

向日葵列當(dāng)為吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)實驗室保存的經(jīng)鑒定為E類型的生理小種。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料接種及鑒定。

采用列當(dāng)抗性鑒定的常用方法進(jìn)行鑒定。按營養(yǎng)土∶蛭石∶砂子=2∶1∶1的比例配制成培養(yǎng)土，將列當(dāng)種子與土壤混合均勻后，轉(zhuǎn)入播種盆中，種植向日葵材料，誘導(dǎo)列當(dāng)種子對向日葵根系的寄生。溫度20～25 ℃，植株生長期間適時適量澆水，土壤濕度不宜過大，否則不利于列當(dāng)種子對向日葵根系的寄生。

出苗后35 d，小苗長出7～9片真葉，此時列當(dāng)根瘤大量出現(xiàn)。將被測植株從杯中取出，用水沖洗干凈根部，被侵染的向日葵根系上可發(fā)現(xiàn)有“根瘤”狀突起或根狀莖，通過肉眼即可鑒定。鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照牛慶杰等[13]的方法，確定各材料的抗性并分析F2群體的抗/感分離比例。

1.2.2 向日葵DNA提取。

將向日葵幼苗真葉葉片放入研缽中，用液氮迅速研磨成粉末狀，移取至1.5 mL微量離心管中，加入2×CTAB 提取液600 μL，振蕩搖勻，于65 ℃水浴鍋中水浴1 h，期間輕緩顛倒混勻。加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），經(jīng)12 000 r/min離心10 min，吸取上清轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 微量離心管中，加入等體積的氯仿，經(jīng)12 000 r/min離心10 min，重復(fù)1次。加入2倍體積的無水乙醇（在-20 ℃冰箱中預(yù)冷），輕緩顛倒，棄上清，留下沉淀。再用70%乙醇溶液洗滌2遍，自然條件下干燥，加入適量ddH2O溶解。提取的DNA用紫外可見光分光光度計測定濃度，濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL后，置于4 ℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)條件為20 μL體系中含2 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，10 μL 2×PCRmix。

擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 SSR分子標(biāo)記篩選。

根據(jù)向日葵的抗感病情況，分別選取10株抗病和10株感病的單株，分別構(gòu)建抗、感池后，將2個混池和親本一起用于SSR分子標(biāo)記的篩選。所有引物的合成由生工生物工程（上海）股份有限公司承擔(dān)。

1.2.5 標(biāo)記在種質(zhì)資源的初步應(yīng)用。

篩選出來的分子標(biāo)記在56份向日葵自交系中進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，獲得了有價值的種質(zhì)資源。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性遺傳規(guī)律

向日葵高抗自交系J-09R接種列當(dāng)后，沒有“根瘤”狀突起或根狀莖;易感09110-A接種列當(dāng)后，植株生長弱小，表現(xiàn)為高感列當(dāng)材料;以易感自交系09110-A與自交系J-09R為雙親配制F2代群體，對群體的單株進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果F1群體均表現(xiàn)為抗列當(dāng)，F(xiàn)2群體的抗感比率為207∶58，按照 F2 為 3∶1的抗感比率，通過卡平方（ χ2）測驗，χ2 值為 1.369 8，小于 χ20.05 =3.84，說明符合一對顯性基因控制的理論分離比率3∶1（表1）。

2.2 親本間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩查

利用67對SSR在抗、感列當(dāng)親本進(jìn)行多態(tài)性分子標(biāo)記篩查，共獲得15對在親本間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記（圖1）。

2.3 多態(tài)性標(biāo)記在F2群體中的驗證

在F2群體中選取10株高抗單株與10株高感單株，提取 DNA 后，構(gòu)建抗、感混池，利用篩選獲得的親本間具有多態(tài)性的15個SSR分子標(biāo)記進(jìn)行分析，獲得5個可能與抗列當(dāng)基因 Or5 緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記ORS533、ORS57、ORS878、 ORS752、 ORS1036（圖2）。引物序列見表2。進(jìn)一步利用獲得的這5對分子標(biāo)記，對 F2群體中115個單株進(jìn)行進(jìn)一步驗證。由于抗列當(dāng)基

因是顯性基因，如果引物與抗病基因緊密連鎖，純合與雜合抗病株都能擴(kuò)增出與抗性親本相同的條帶，而純合感病植株則擴(kuò)增出與感病親本相同大小的條帶。經(jīng)過分子標(biāo)記ORS1036檢測，F(xiàn)2代群體中有31個純合抗列當(dāng)單株，有58個雜合抗列當(dāng)單株和26個感列當(dāng)單株，部分檢測結(jié)果見圖3。

2.4 F2群體列當(dāng)抗性鑒定結(jié)果

對列當(dāng)抗性親本、感列當(dāng)親本和115個向日葵F2單株人工接種向日葵列當(dāng)生理小種E，進(jìn)行抗病性鑒定。部分F2代群體分子檢測結(jié)果與接種鑒定的結(jié)果比較見表3。經(jīng)過對2種鑒定結(jié)果比較分析，115個向日葵F2植株有7個單株的鑒定結(jié)果不同，由表3可知，編號為1-4、1-3、3-3和3-15植株的人工接種鑒定結(jié)果與分子檢測結(jié)果不同。其他植株的2種方法鑒定結(jié)果一致，在表型中鑒定為抗列當(dāng)?shù)?，分子檢測多表現(xiàn)為雜合帶型。結(jié)合抗列當(dāng)鑒定的試驗結(jié)果，ORS1036的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率為94%，表型鑒定與分子鑒定的相關(guān)系數(shù)為0.60，具有一定的應(yīng)用價值。

2.5 種質(zhì)資源篩選

對84份向日葵材料進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果表明（圖4），共有5個向日葵不育系含有標(biāo)記ORS1036的244 bp條帶（占總不育系的17.24%）;7個向日葵恢復(fù)系含有標(biāo)記，占總恢復(fù)系的35.00%;3個向日葵保持系含有標(biāo)記，占總保持系的37.50%。經(jīng)分子標(biāo)記檢測共得到15份含有該標(biāo)記的種質(zhì)資源。從圖4可以看出，部分材料在ORS1036位點出現(xiàn)了雜合帶型，后期需要對親本材料進(jìn)一步篩選純化。

ORS1036標(biāo)記引物鑒定獲得可能攜帶 Or5 基因的抗列當(dāng)資源，后續(xù)將對這些材料進(jìn)行抗列當(dāng)性鑒定，這些材料將成為今后育種工作中的寶貴資源。

3 討論

用于輔助選擇育種的分子標(biāo)記，一般需要具備3個條件：①分子標(biāo)記與目的基因緊密連鎖;②標(biāo)記需實用性強，重復(fù)性好，且能夠經(jīng)濟(jì)簡便地檢測大量個體;③不同遺傳背景選擇有效。與向日葵抗列當(dāng)基因連鎖緊密的分子標(biāo)記較少，加之育種單位間技術(shù)發(fā)展不平衡，真正開展分子標(biāo)記輔助選擇育種的單位較少。

該研究運用分子標(biāo)記法和遺傳圖譜主要針對生理小種E和F抗性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：小種E的抗性基因 Or5 存在于連鎖群LG3的向日葵遺傳圖譜。然而，有關(guān)顯性基因的抗性機理尚不清楚，盡管它被假設(shè)成一串可識別的抗性基因編碼蛋白質(zhì)，其特點是富含亮氨酸的重復(fù)圖譜（LRR）和一個核苷酸結(jié)點（NBS）氨基點到LRR的位置，通過繪制NBS-LRR位點到 Or5 緊密相連的LG3上表明，有2個來自 H.tuberosus ，該結(jié)論進(jìn)一步證明有關(guān)顯性基因抗性機理的假設(shè)[14]，并作為抗列當(dāng)基因被廣泛應(yīng)用[15]。數(shù)量性狀基因座（QTL）定位分析表明，除主要基因 Or5 外，抗生理小種E還受4個QTL的輕微影響，某些情況下為非小種特性，主要與每株寄主植物上列當(dāng)?shù)臄?shù)量有關(guān);組織學(xué)和基因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，減少列當(dāng)種子萌發(fā)的刺激物或者快速拔除病株體能夠有效抗列當(dāng)小種，證明抗小種E是由多基因組成的。在該試驗中，通過對親本、F1代和F2群體對列當(dāng)E小種的抗性鑒定，F(xiàn)1代植株都抗病，F(xiàn)2代的表現(xiàn)型符合一對顯性等位基因控制的分離比率，符合單基因顯性遺傳規(guī)律，說明抗病性是由顯性單基因控制。

在栽培向日葵中，不同密度和完整度的分子遺傳圖譜已經(jīng)被建立，但具有實際應(yīng)用價值的圖譜仍較少，而且存在標(biāo)記與抗列當(dāng)基因間的遺傳距離過大，選擇準(zhǔn)確性差或標(biāo)記可重復(fù)性差等問題，而且目前尚無基于基因突變的功能標(biāo)記能夠100%準(zhǔn)確預(yù)測所有遺傳背景下的表型。該試驗獲得了與向日葵 Or5 抗列當(dāng)緊密連鎖的分子標(biāo)記 ORS1036，在 F2群體中進(jìn)行了驗證，表型結(jié)果和分子檢測結(jié)果的吻合率為94%，可能是由于ORS1036這個標(biāo)記與 Or5 基因連鎖不是很緊密，有些材料抗病，但是未擴(kuò)增出特異條帶，因此期待能開發(fā)出更加精準(zhǔn)的SSR標(biāo)記或者SNP標(biāo)記，為今后進(jìn)行抗列當(dāng)種質(zhì)創(chuàng)新及新品種選育提供了高效的技術(shù)支持。

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