一株羅非魚源無乳鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

王輝

摘 要：從海南省三亞市崖州區(qū)養(yǎng)殖的羅非魚中分離得到一株優(yōu)勢病原菌，命名為HH-0708.經由16S rDNA序列測定、菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗，HH-0708被鑒定為無乳鏈球菌。HH-0708體外藥敏結果顯示：其對青霉素、頭孢呋辛、多西環(huán)素等11種抗生素高度敏感，而對四環(huán)素、慶大霉素等9種抗生素表現(xiàn)出較強的耐藥性，對鏈霉素、紅霉素等其他5種抗生素，表現(xiàn)為中度敏感。

關鍵詞：羅非魚;無乳鏈球菌;16S rDNA;藥敏試驗;生化實驗

中圖分類號： S943

自1976年起，于水生生物海豚中首次分離到鏈球菌后，鏈球菌類的細菌性疾病便在羅非魚、寶石鱸等水生生物養(yǎng)殖中多次爆發(fā)，造成嚴重的經濟損失[1-3]。因羅非魚具有良好的繁殖能力，肉質鮮美，無肌間刺，具有較高的經濟價值，所以成為我國重要的水產養(yǎng)殖品種[4-5]。但是由于養(yǎng)殖密度的增高，抗生素濫用等問題，鏈球菌等細菌性疾病頻發(fā)，造成了嚴重的經濟損失。為更好進行疾病防控，需從病魚中分離病原菌，了解其生理生化特性后，再深入進行病原菌耐藥性[6-8]、毒力因子[9]、疫苗方面[10]的研究，方便對同類疾病進行快速、精確防控。

海南省三亞市網箱養(yǎng)殖羅非魚爆發(fā)細菌性疾病，從中分離得到一株病原菌，通過序列比對和生理生化分子鑒定，確定為羅非魚源的無乳鏈球菌，在實驗室內利用紙片擴散法，對藥物敏感性進行檢測，為避免羅非魚源細菌性病害的大規(guī)模爆發(fā)，以及養(yǎng)殖的進一步發(fā)展提供生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2020年7月份，海南省三亞市崖州區(qū)牛落水庫網箱中羅非魚出現(xiàn)大量死亡的情況，發(fā)病羅非魚的體長為12～15 cm，體質量為100～200 g。觀察并記錄魚體的運動狀況及病理特征，從羅非魚養(yǎng)殖網箱內撈出10尾瀕死的羅非魚，塑料袋充氧后運回實驗室，進行后續(xù)病原分離、病原鑒定實驗。實驗所用材料見表1。

1.2 病原菌的分離、純化

在超凈工作臺內，用75%乙醇擦拭瀕死的羅非魚體表，之后進行羅非魚各組織、器官的病原分離，具體包括：肝臟、腦、脾臟、血液、腎臟等，組織樣在腦心津液固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)環(huán)境：30 ℃恒溫培養(yǎng)箱;培養(yǎng)時間：24 h。對平板上的優(yōu)勢菌落進行三區(qū)劃線，純化菌株。對純化后長出的單一菌落進行保種，具體操作：制備好無菌腦心津液培養(yǎng)基，將單菌落轉接于培養(yǎng)基內，培養(yǎng)環(huán)境：30 ℃振蕩培養(yǎng)箱;轉速設定：180 r/min;培養(yǎng)時間：16～20 h，后將培養(yǎng)好的菌液與50%的無菌甘油混合，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 病原菌形態(tài)觀察 將病原菌劃線、純化的腦心津液培養(yǎng)皿倒置，培養(yǎng)環(huán)境：30 ℃恒溫培養(yǎng)箱;培養(yǎng)時間：20 h，觀察并記錄菌落形態(tài)。

1.3.2 分子鑒定

1.3.2.1 PCR擴增與測序 提取菌液DNA后，利用細菌16S的通用引物進行擴增，序列預期長度為 1 500 bp。取6 μL的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，部分擴增產物寄送基因技術有限公司，獲取菌株16S核酸序列。

16S通用引物序列為：

27 F ：（ 5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3）

1 492 R ：（ 5- GGTTACCTTGTTACGACTT - 3）

1.3.2.2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建 登入NCBI官網，將測序結果上傳至Microbes，進行Blastn同源性分析，記錄查詢結果，并下載鏈球菌屬核酸序列。利用Mega7.0軟件，生成HH-0708的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設定構建法則：鄰接法;Bootstrap值：1 000;距離檢測方法：clustal V。

1.3.3 生理生化鑒定 利用生化鑒定管的反應情況，根據(jù)不同功能產生的生理生化反應對菌株種屬進行鑒定，觀察其與各種酶類發(fā)生氧化發(fā)酵的能力，水解七葉苷和明膠的能力，利用各種糖類產酸的能力，以及不同鹽度下的生長能力的變化。對照菌株：無乳鏈球菌（NCTC8181）。

1.4 藥敏試驗

本次藥敏試驗原理為紙片擴散法。具體操作：將上述培養(yǎng)好的菌液，吸取100 μL，均勻涂布于LB平板，后取藥敏紙片貼于該涂布平板表面。藥敏平板培養(yǎng)溫度：30 ℃;倒置培養(yǎng);培養(yǎng)時間：24 h。利用游標卡尺測定抑菌圈直徑，并判斷菌株對各抗生素的敏感性。

2 結果

2.1 病原菌的形態(tài)學觀察

對腦、肝臟、脾臟等取樣部位進行病原菌的分離，長出的菌落形態(tài)基本一致，認定為優(yōu)勢病原菌落。挑取長出的單菌落，于無菌的腦心津液培養(yǎng)基進行劃線純化，長出的菌落形態(tài)一致，均表面光滑、邊緣整齊，呈乳白色。2.2 病原菌的分類鑒定

2.2.1 病原菌系統(tǒng)進化分析 利用細菌16S通用引物即27 F和1492 R構建PCR體系，通過2720型PCR儀對HH-0708菌株DNA進行 PCR擴增處理，通過瓊脂糖凝膠結果顯示條帶長度為1.5 kbp，將測序結果上傳至NCBI網站上進行Blastn同源性分析，菌株 HH-0708與結果中各類無乳鏈球菌相似性均達99.67%。下載16S 核酸序列，運用MEGA 7.0軟件的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可見，該病原菌株HH-0708與菌株NCTC8187聚為一支。

2.2.2 生理生化特性 為描述HH-0708的生理生化特性，利用生化鑒定管分析該病原菌利用各類物質的能力（如表2），結果顯示，菌株 HH-0708和標準菌株NCTC8181均在MR反應、鳥氨酸脫羧酶反應、丙氨酸生化反應中表現(xiàn)出陽性;HH-0708可以利用麥芽糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、果糖、半乳糖、甘露糖、水楊素發(fā)生陽性反應，分解糖類產酸供能。無法水解七葉苷和明膠進行水解反應;在各梯度鹽度下無法完成正常的生長;無法利用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、纖維二糖、木糖、乳糖等低聚糖和甘油、肌醇進行產酸反應。HH-0708與NCTC8181在利用各類糖類的能力上略有不同。

2.3 藥敏試驗

對致病菌HH-0708進行藥敏試驗，在25種藥敏紙片呈現(xiàn)出不同的敏感表現(xiàn)（如表3）。該病原菌對多西環(huán)素、頭孢他啶、呋喃妥因、左氧氟沙星、大觀霉素、阿莫西林、頭孢呋辛、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、復方新諾明、青霉素共11種抗生素敏感，即對測定的頭孢類和部分喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為高度敏感;對多黏菌素B、紅霉素、諾氟沙星、依諾沙星、鏈霉素5種抗生素呈現(xiàn)中度敏感，對喹諾酮類部分抗生素表現(xiàn)為藥物中度敏感;而對呋喃唑酮、氨芐西林、新霉素、四環(huán)素、慶大霉素等9種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，主要對β-內酰胺類抗生素顯示強耐藥性。

3 討論

3.1 病原分離與鑒定

2020年7月針對海南養(yǎng)殖網箱患病羅非魚進行研究，從發(fā)病羅非魚的腦、肝臟、脾臟等部位分離病原菌，發(fā)現(xiàn)長出的菌落顏色、形態(tài)一致，所以從中挑取一株菌進行后續(xù)病原鑒定實驗。通過菌落形態(tài)記錄，利用BLAST比對其16S rDNA序列，發(fā)現(xiàn)與NCTC8187標準菌株表現(xiàn)出高度的同源性，并完成系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

3.2 藥敏試驗及防治措施

將本次藥敏結果與不同地區(qū)下分離得到的無乳鏈球菌藥物分析結果進行比較[11-14]，除青霉素外，HH-0708對環(huán)丙沙星、復方新諾明、氟苯尼考等藥物表現(xiàn)出高度敏感性，但對紅霉素表現(xiàn)為中度敏感，造成這種差異的原因：一是不同地區(qū)菌株遺傳背景具有差異性，導致部分藥物敏感性不一致[15-16];二是長期使用、濫用單一抗生素，使細菌的毒力因子、耐藥因子的表達發(fā)生變化，病原菌本身耐藥和獲得性耐藥能力不斷提升，造成紅霉素等抗生素藥物敏感性下降，抗生素防治疾病效果下降[17-20];除此之外，還有其他環(huán)境條件等其他因素，導致致病菌株的藥物敏感性不斷變化，出現(xiàn)抗生素“失效”或“低效”的現(xiàn)象。

目前，禁用的漁用抗生素種類不斷增加[21]，一方面有效避免了抗生素的濫用，而另一方面抗生素的使用受限增加了防控細菌性疾病的難度，所以應當積極尋找快速、有效的抗生素替代途徑來治療水生生物的細菌性疾病，如研制疫苗[22]，開發(fā)抗菌肽[23]，進行中草藥防治[24-25]等，控制無乳鏈球菌在羅非魚中的進一步傳播。

4 結論

通過對病原菌的形態(tài)特征、生化特性、序列分析等結果分析，將該菌株鑒定為無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）。目前，抗生素仍是一種主要的疾病防控手段。為了防止抗生素的濫用，可以利用紙片擴散法有效篩選目標抗生素，迅速、謹慎確定給藥方案，從而高效防控鏈球菌疾病的發(fā)展。

參考文獻：

[1] PIER G B， MADIN S H.Streptococcus iniae sp. nov.， a Beta-Hemolytic Streptococcus Isolated from an Amazon Freshwater Dolphin， Inia geoffrensis[J].International Journal of Systematic Bacteriology， 1976，26（4）：545-553.

[2] LIU L，LI Y W，HE R Z，et al.Outbreak of Streptococcus agalactiae infection in barcoo grunter， Scortum barcoo （McCulloch & Waite）， in an intensive fish farm in China[J].Journal of Fish Diseases，2014，37（12）：1067-1072.

[3] SAAD M Z，AZMAL M N A，ABDULLAH S Z，et al.Control and prevention of Streptococcosis in cultured tilapia in Malaysia：a review[J].Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science，2014，37（4）：389-410.

[4] KAYANSAMRUAJ P，PIRARAT N，KATAGIRI T，et al.Molecular characterization and virulence gene profiling of pathogenic Streptococcus agalactiae populations from tilapia （Oreochromis ?sp.） farms in Thailand[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2014，26（4）：488-495.

[5] 肖俊，甘西，羅永巨.羅非魚育種研究進展[J].湖南科技大學學報（自然科學版），2014（1）：106-112.

[6] 尹欣悅，吳鵬，馬忠臣，等.一株無乳鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2020（22）：99-101+168.

[7]林華劍.無乳鏈球菌對抗菌類藥物的感受性研究[J].海洋與漁業(yè)，2019（7）：100-101.

[8] 范雪，邵偉，趙艷坤，等.無乳鏈球菌毒力基因與耐藥性的相關性研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2021，48（1）：375-384.

[9] 劉禮輝，張德鋒，李寧求，等.鯪魚源無乳鏈球菌的鑒定， 血清型分析及藥敏試驗[J].南方農業(yè)學報，2015，46（11）：2053-2058.

[10] RAMOS-ESPINOZA F C，CUEVA-QUIROZ V A，YUNIS-AGUINAGA J，et al.A comparison of novel inactivation methods for production of a vaccine against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia Oreochromis niloticus[J].Aquaculture， 2020，528：735484，

[11] 王愛媛，鄭立新，蒲文淵，等.海南無乳鏈球菌的毒力基因與耐藥特性分析[J].水產科學，2020，39（1）：117-123.

[12] 寧丹，方偉，柯昌文，等.廣東省羅非魚無乳鏈球菌耐藥性及毒力研究[J].熱帶醫(yī)學雜志，2019，19（8）：974-978.

[13] 陳福艷，黎建斌，歐陽賢華，等.魚鴨混養(yǎng)池塘羅非魚無乳鏈球菌病的病原分離鑒定及其防治[J].南方農業(yè)學報，2019，50（11）：2583-2591.

[14] 王巧煌.福建紅羅非魚源無乳鏈球菌的分離鑒定及其分子特征[J].大連海洋大學學報，2019，34（1）：63-69.

[15] ESKANDARIAN N，ISMAIL Z，NEELA V，et al.Antimicrobial susceptibility profiles， serotype distribution and virulence determinants among invasive， non-invasive and colonizing Streptococcusagalactiae （group B Streptococcus） from Malaysian patients[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2015，34（3）：579-584.

[16] WANG X L，CAO X L，LI S M，et al.Phenotypic and molecular characterization of Streptococcusagalactiae colonized in Chinese pregnant women：predominance of ST19/Ⅲ and ST17/Ⅲ[J].Res Microbiol，2018，169（2）：101-107.

[17] 趙琳珊，徐廣健，陳俊文，等.四環(huán)素耐藥無乳鏈球菌生物膜形成特點[J].中國熱帶醫(yī)學，2020，20（3）：227-230.

[18] 張宇藺，蘇寧，陳海鵬，等.蘇州地區(qū)耐左氧氟沙星無乳鏈球菌臨床分離株分子及質譜學特征分析[J].臨床檢驗雜志，2020，38（10）：741-745.

[19]梁靜真，黃立春，韋慕蘭，等.廣西羅非魚源無乳鏈球菌耐藥性及其四環(huán)素耐藥基因檢測[J].南方農業(yè)學報，2018，49（10）：2077-2086.

[20] LI C，SAPUGAHAWATTE D N，YANG Y，et al.Multidrug-resistant Streptococcus agalactiae strains found in human and fish with high penicillin and cefotaxime non-susceptibilities[J].Microorganisms，2020，8（7）：1055.

[21] 陳福艷，覃雅，歐陽賢華，等.幾種水產常用抗生素對無乳鏈球菌的抑菌活性[J].河北漁業(yè)，2020（6）：38-40.

[22] KE X L，LIU Z G，CHEN S Z，et al.The immune efficacy of a Streptococcus agalactiae immersion vaccine for different sizes of young tilapia[J].Aquaculture，2021，534：736289.

[23] DE SOUSA E L，ASSANE I M，SANTOS-FILHO N A， et al.Haematological， biochemical and immunological biomarkers， antibacterial activity， and survival in Nile tilapia Oreochromis niloticus after treatment using antimicrobial peptide LL-37 against Streptococcus agalactiae[J].Aquaculture，2021，533：736181.

[24] 丁月霞，葉梓茵，岑雪萍，等.中草藥水提物對羅非魚無乳鏈球菌的體外抑菌效果[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2019，38（4）：15-17.

[25] 丁浩，董靖，宋懌，等.36種中藥對羅非魚源無乳鏈球菌體外抑菌及生物被膜消除效果[J].淡水漁業(yè)，2019，49（3）：71-77.

Abstract：A pathogen named HH-0708 was isolated from tilapia cultured in Yazhou District， Sanya City， Hainan Province. The HH-0708 strain was identified as Streptococcus agalactiae by a series of tests which included morphological observation， 16S rDNA sequencing， physiological and biochemical identification. The antibiotic sensitivity analysis indicated that HH-0708 was extremely susceptible to 11 kinds of drugs including penicillin， ceftriaxone， doxycycline， etc， and medium sensitive to streptomycin， erythromycin and other three drugs. While HH-0708 was resistant to nine drugs， such as tetracycline， gentamicin，etc.

Key words：tilapia;Streptococcus agalactiae;16S rDNA; drug sensitivity test; biochemical test

（收稿日期：2021-06-18）