發(fā)酵酒中甜蜜素的確證技術(shù)分析及解決方案

張書(shū)芬，張愛(ài)芝，忻璐琰，蘆 童，邢家溧，王志強(qiáng)，劉 艷，勵(lì) 丹，何 怡，袁 偉

（寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院（寧波市纖維檢驗(yàn)所），浙江 寧波 315040）

發(fā)酵酒是以糧谷、水果、乳類等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵或部分發(fā)酵釀制而成的飲料酒[1]，主要包括葡萄酒、黃酒和果酒等。我國(guó)擁有悠久而豐富的酒文化，酒是朋友聚會(huì)、大眾娛樂(lè)不可或缺的元素，但與這種旺盛的消費(fèi)現(xiàn)狀并存的是，一些生產(chǎn)者為了去除發(fā)酵酒在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的苦味，增加口感，在發(fā)酵酒中超范圍添加甜蜜素。2017-2019年河南省發(fā)酵酒中甜蜜素監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示336份發(fā)酵酒樣品中，甜蜜素不合格率為3.3%[2]；2019-2020年福建、浙江、山東等多地都有相關(guān)葡萄酒或黃酒中檢出甜蜜素的報(bào)道，引發(fā)社會(huì)廣泛關(guān)注，非法添加甜蜜素成為發(fā)酵酒最重要的風(fēng)險(xiǎn)因子。

甜蜜素，化學(xué)名為環(huán)己基氨基磺酸鈉，作為一種食品加工甜味劑，被廣泛應(yīng)用于糕點(diǎn)、飲料、醬腌菜、配制酒等食品中，但過(guò)量攝入有致癌、致畸、損害腎功能等副作用[3-6]。為了保證人民的生命安全，GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]明確規(guī)定了甜蜜素在各類食品中的使用量，發(fā)酵酒未包括其中。

目前甜蜜素常用的檢測(cè)方法有氣相色譜法[8-9]、液相色譜法[10-11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]及液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[14-15]。由于發(fā)酵酒中添加的甜蜜素含量相對(duì)較低，氣相色譜法、液相色譜法檢測(cè)甜蜜素均需進(jìn)行衍生化處理，且酒中含有的環(huán)己醇及環(huán)己基等類似物質(zhì)會(huì)與亞硝酸鈉反應(yīng)，生成環(huán)己醇亞硝酸酯，造成假陽(yáng)性的結(jié)果，因而我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》[16]中明確規(guī)定白酒、葡萄酒、黃酒、料酒中甜蜜素的檢測(cè)僅能用液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)。與白酒等蒸餾酒不同，葡萄酒、黃酒等發(fā)酵酒基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，其中含有大量的糖類、單寧及有機(jī)酸成分，極易在檢測(cè)時(shí)造成干擾。按照目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)時(shí)，由于基質(zhì)干擾，樣品中甜蜜素與標(biāo)準(zhǔn)溶液中甜蜜素離子豐度比的偏差經(jīng)常不能滿足液相色譜-質(zhì)譜法的要求，定性困難[17]，存在誤判的可能。本實(shí)驗(yàn)旨在解決發(fā)酵酒中甜蜜素的定性確證困難的問(wèn)題，以便為食品監(jiān)管提供更加可靠的數(shù)據(jù)，保證廣大消費(fèi)者的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：加拿大Torononto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司；甲酸銨（色譜純）：美國(guó)Fisher Chemical公司；乙酸銨（色譜純）：上海麥克林公司。

1.2 儀器與設(shè)備

I-CLASS XeVO TQ-XS 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL）、液相色譜柱（ACQUITY UPLCBEHC18（100mm×2.1mm，1.7μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm））：美國(guó)Waters公司；HHS-21-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠：Turbovap LV多功能全自動(dòng)氮吹濃縮儀：英國(guó)Biotage公司；VORTEX 2自動(dòng)渦旋混合器：德國(guó)IKA公司；Fotector Plus全自動(dòng)固相萃取儀：?？萍瘓F(tuán)股份有限公司；Milli-Q超純水儀：美國(guó)Millipore 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

精確稱取10 g左右樣品于100 mL燒杯中，60 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，過(guò)0.22 μm水系濾膜，上機(jī)分析。當(dāng)樣品中正負(fù)掃描通道均出峰，且保留時(shí)間與甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，但離子豐度比不滿足液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性要求時(shí)，不能簡(jiǎn)單判定為陰性樣品，應(yīng)做如下處理：當(dāng)上機(jī)質(zhì)量濃度≥200 ng/mL時(shí)，稀釋20倍后上機(jī)分析；當(dāng)上機(jī)質(zhì)量濃度＜200 ng/mL時(shí)，取1 mL定容液，加入4 mL 0.1 mol/L HCl，上樣于預(yù)先活化好的WAX固相萃取柱上（WAX固相萃取柱活化：3 mL甲醇，3 mL水），依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，3 mL 5%氨水甲醇洗脫，洗脫液氮吹至干，以1 mL水溶解，過(guò)0.22 μm水系濾膜，上機(jī)分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的棕色容量瓶中，以甲醇＋水（1∶1）定容至刻度，得到1 mg/mL的儲(chǔ)備液，存放于-18 ℃冰箱中，可存放1年。

1.3.3 儀器條件

（1）超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYTMUPLCBEHC18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：20 ℃；進(jìn)樣體積：3 μL。流動(dòng)相A：5 mmol/L甲酸銨水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min，95%A；2.0～5.0 min，95%～50%A；5.0～5.1 min，50%～10%A；5.1～6.0 min，10%A；6.1～9.0 min，95%A。

（2）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI），采用正負(fù)離子同時(shí)掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛細(xì)管電壓正離子模式：3.00 kV，負(fù)離子模式：2.50kV，錐孔電壓：30 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：600 ℃；脫溶劑氣流量：900 L/h。

1.3.4 儀器條件對(duì)基質(zhì)效應(yīng)消除的優(yōu)化

考察了流動(dòng)相體系（乙腈-甲酸銨、甲醇-甲酸銨、乙腈-乙酸銨、甲醇-乙酸銨）、色譜柱（ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（150mm×2.1mm，1.7μm）、ACQUITYUPLCHSST3（100mm×2.1mm，1.7μm））、梯度洗脫程序、進(jìn)樣體積（7μL、5μL、3μL）及上機(jī)液稀釋倍數(shù)在減弱或消除基質(zhì)效應(yīng)方面的作用。

1.3.5 前處理對(duì)基質(zhì)效應(yīng)消除的優(yōu)化

前處理方面減小基質(zhì)效應(yīng)的基本途徑是盡可能將樣品凈化，SPE固相萃取法是分析檢測(cè)中最有效、最常用的凈化方式之一，因而本實(shí)驗(yàn)采用SPE固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。并考察SPE固相萃取柱、萃取柱上樣液pH以及凈化條件對(duì)基質(zhì)效應(yīng)消除方面的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

定性測(cè)定：在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣液中被測(cè)化合物的保留時(shí)間，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，且樣品中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過(guò)表1規(guī)定的范圍，方可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。

表1 定性分析時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差Table1 Maximum allowable deviation of relative ion abundance in qualitative analysis

定量測(cè)定：采用Masslynx4.1軟件處理數(shù)據(jù)，以Masslynx 4.1和Microsoft word 2007軟件分析并繪圖。

基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)效應(yīng)是殘留檢測(cè)中普遍存在的現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與同濃度溶劑標(biāo)準(zhǔn)的響應(yīng)強(qiáng)度對(duì)比進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的考察，其計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)的消除

2.1.1 儀器方面基質(zhì)效應(yīng)的消除

（1）流動(dòng)相體系的選擇

流動(dòng)相的組成不僅會(huì)影響到目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰型，亦會(huì)影響到離子化效率，從而影響靈敏度。在質(zhì)譜條件摸索時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有在酸性條件下正離子采集模式才會(huì)有響應(yīng)，因而流動(dòng)相體系必定為酸性體系。

由圖1可知，乙腈-銨鹽體系的峰型及靈敏度均不及甲醇-銨鹽體系。甲酸銨和乙酸銨對(duì)離子化效率的影響不同，同等條件下甜蜜素在甲酸銨體系中響應(yīng)較乙酸銨稍強(qiáng)。銨鹽的濃度對(duì)甜蜜素的電離影響較小，而流動(dòng)相體系的改變對(duì)基質(zhì)效應(yīng)基本無(wú)影響，因而選擇以甲醇-5 mmol/L甲酸銨為流動(dòng)相體系。

圖1 流動(dòng)相體系對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素分析的影響Fig.1 Effect of mobile phase system on sodium cyclamate analysis in fermented wine

（2）色譜柱的選擇

從現(xiàn)有文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，甜蜜素的分離多采用C18[19-22]、T3[23]等色譜柱，因而實(shí)驗(yàn)比較了Waters公司生產(chǎn)的ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）對(duì)甜蜜素的分離效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，甜蜜素在三種色譜柱上均能獲得較好的峰型，色譜行為無(wú)太大差異，但均不能解決甜蜜素正離子采集模式的基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)最終選擇通用型色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分離柱。

圖2 液相色譜柱對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素分析的影響Fig.2 Effect of liquid chromatographic column on sodium cyclamate analysis in fermented wine

（3）梯度洗脫程序的優(yōu)化

梯度洗脫程序的改變也是減弱和消除基質(zhì)效應(yīng)的有效途徑，不同梯度洗脫程序?qū)Y(jié)果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 流動(dòng)相梯度對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素分析的影響Fig.3 Effect of mobile phase gradient on sodium cyclamate analysis in fermented wine

由圖3可知，在對(duì)甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫梯度，甜蜜素在2 min后均可獲得良好的峰型，但在分析陰性發(fā)酵酒加標(biāo)樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)出峰時(shí)間早于4 min時(shí)，甜蜜素負(fù)離子采集模式有干擾峰，正離子采集模式增強(qiáng)。調(diào)節(jié)梯度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甜蜜素在4 min后出峰時(shí)，負(fù)離子采集模式干擾消除，正離子基質(zhì)干擾有一定的減小，但仍存在較大的基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)再次延緩梯度洗脫程序，來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)，效果不理想。當(dāng)在95%A的等度洗脫的極限條件下，甜蜜素在6 min左右出峰。因而實(shí)驗(yàn)選用1.3.3的梯度洗脫程序，此時(shí)甜蜜素在4.7 min左右出峰。

（4）進(jìn)樣體積的優(yōu)化

小體積進(jìn)樣是減小基質(zhì)效應(yīng)的一種有效方式，本實(shí)驗(yàn)室配備的定量環(huán)體積為10 μL，進(jìn)樣體積在2.5～7.5 μL之間定量最為準(zhǔn)確，因而考察了進(jìn)樣體積為3 μL、5 μL、7 μL時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 進(jìn)樣體積對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 Effect of injection volume on matrix effects

由圖4可知，基質(zhì)效應(yīng)隨著進(jìn)樣體積的減少而呈逐漸減弱趨勢(shì)后趨于平衡，因而，最后選擇以3 μL體積進(jìn)樣。

（5）稀釋對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

稀釋會(huì)減少單位中干擾物含量從而減少對(duì)目標(biāo)分析物電離的影響，試驗(yàn)中經(jīng)常采取稀釋上機(jī)液的方式來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)，稀釋對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 樣品稀釋對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.5 Effect of sample dilution on matrix effects

由圖5可知，當(dāng)樣品稀釋20倍時(shí)基質(zhì)效應(yīng)基本消除，結(jié)合儀器的靈敏度，甜蜜素含量為定量限0.1 mg/kg時(shí)，對(duì)應(yīng)上機(jī)質(zhì)量濃度為10 ng/mL，那么疑似陽(yáng)性樣品上機(jī)質(zhì)量濃度≥200 ng/mL時(shí)，通過(guò)稀釋的方法即可消除干擾物對(duì)正離子模式的干擾，解決了相對(duì)離子豐度比超過(guò)允許的最大相對(duì)偏差，定性困難的問(wèn)題。

當(dāng)上機(jī)質(zhì)量濃度＜200 ng/mL時(shí)，由于值相對(duì)較小，考慮到定量限的關(guān)系，單純的稀釋已不能解決問(wèn)題，因而采取前處理凈化的方式來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)。

2.1.2 前處理方面基質(zhì)效應(yīng)的消除

（1）SPE固相萃取柱的確定

在前處理方面，SPE固相萃取凈化法是消除基質(zhì)效應(yīng)最有效、最常用的方式之一。甜蜜素含有磺酸基團(tuán)，適合采用陰離子交換小柱進(jìn)行凈化，WAX小柱是一種混合型弱陰離子交換反相吸附柱，在酸性條件下填料表面電離帶正電，能吸附帶負(fù)電的環(huán)己基氨基磺酸基負(fù)離子，在堿性條件下填料表面不帶電，可對(duì)甜蜜素進(jìn)行洗脫。因而本實(shí)驗(yàn)采用WAX固相萃取小柱進(jìn)行凈化。

（2）SPE固相萃取柱上樣液pH的確定

陰離子交換小柱在上樣時(shí)應(yīng)處于酸性環(huán)境，通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)[18]，陰離子交換小柱的上柱試樣基本由0.1 mol/L HCl進(jìn)行溶解，以保證目標(biāo)化合物可以有效保留在小柱上，因發(fā)酵酒樣品定容液（1.3.1）基本呈現(xiàn)弱酸性偏中性狀態(tài)，因而在上柱前需經(jīng)過(guò)0.1 mol/L HCl進(jìn)行稀釋，方能滿足其要求。0.1 mol/L HCl的pH值為1.0，1 mL定容液上柱前預(yù)先采用4 mL0.1 mol/L HCl稀釋至其pH為1.0。

（3）SPE固相萃取柱凈化條件的確定

實(shí)驗(yàn)采取在紅葡萄酒和黃酒陰性樣品中添加甜蜜素的方式，考察了WAX的凈化程序，具體見(jiàn)1.3.1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WAX小柱經(jīng)淋洗后，肉眼基本看不到有色物質(zhì)，洗脫液也較為清澈，上機(jī)分析后發(fā)現(xiàn)所有樣品基質(zhì)效應(yīng)均完全消除，且回收率在可接受范圍。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

將甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，甜蜜素在10～1000ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程為：y=257802x+295.267，其中x為甜蜜素質(zhì)量濃度，y為響應(yīng)強(qiáng)度。線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 2，均符合理化檢驗(yàn)對(duì)線性相關(guān)性的規(guī)定。

采用向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度的方法確定方法的檢出限，以3倍信噪比、10倍信噪比分別計(jì)算方法的檢出限和定量限，得到其檢出限為0.03 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg。

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵酒按糖度進(jìn)行分類，對(duì)紅葡萄酒（干型、半干型、甜型、半甜型）[24]、黃酒（干型、半干型、甜型、半甜型）[25]8種陰性樣品中分別添加不同濃度水平的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平按試驗(yàn)方法平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）及樣品中甜蜜素與相當(dāng)濃度甜蜜素標(biāo)樣的離子豐度比偏差結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵酒中甜蜜素三個(gè)加標(biāo)水平下的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及定性數(shù)據(jù)Table2 Recovery rates,relative standard deviation and qualitative data of sodium cyclamate at 3 spiked levels in fermented wine

由表2可知，經(jīng)WAX小柱凈化，甜蜜素的回收率在82%～109%之間，試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.2%～8.6%。發(fā)酵酒加標(biāo)樣品中甜蜜素與同濃度標(biāo)樣離子豐度比能夠滿足液相色譜-質(zhì)譜法定性要求，無(wú)定性困難。

2.4 實(shí)際樣品應(yīng)用

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)104份不同類型的葡萄酒、黃酒及部分料酒樣品進(jìn)行了分析測(cè)定，其中5份干紅葡萄酒樣品檢出甜蜜素，其含量在0.2～1.7 mg/kg之間，1份黃酒樣品檢出甜蜜素，其含量為2.1 mg/kg，離子豐度比均滿足液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜定性要求。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以甲醇-5 mmol/L甲酸銨為流動(dòng)相體系，采用正負(fù)離子同時(shí)掃描的方式對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素進(jìn)行測(cè)定。樣品在60 ℃水浴中揮去酒精，用水稀釋10倍后上機(jī)分析，對(duì)甜蜜素進(jìn)行快速初篩測(cè)定，當(dāng)樣品中正負(fù)模式下甜蜜素出峰位置同時(shí)出峰，離子峰度比不滿足液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性要求時(shí)，通過(guò)稀釋或固相萃取小柱凈化的方式進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。方法可用于實(shí)際樣品檢測(cè)，較好地解決了發(fā)酵酒中甜蜜素檢測(cè)定性困難的問(wèn)題。