嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗汁的非靶向代謝組學研究

王 彤，劉慧燕，潘 琳，胡明珍，李旭陽，馬 妮，方海田

（寧夏大學 食品與葡萄酒學院 寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

紅棗（Ziziphus jujubaMill.）是李科棗屬植物，棗果原產(chǎn)自中國[1]。紅棗中含有豐富的有機酸、氨基酸[2]、維生素、礦物質(zhì)和微量元素，以及大量的多糖、總酚、總黃酮類化合物[3]、環(huán)磷酸腺苷[4]、皂苷[5]等，具有抗衰老、抗腫瘤、護肝等的作用[6]。而紅棗含糖量較高，并不適宜低糖人群食用，因此利用技術(shù)手段降低紅棗含糖量就成為新的研究趨勢。乳酸菌具有維持胃腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)消化免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血糖等作用。采用乳酸菌發(fā)酵果汁可降低單糖含量，豐富產(chǎn)品口感，防止腐敗，生成新的營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高保健價值[7]。余偲等[8]利用乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的特點，生產(chǎn)出一種具有功能性成分的紅棗乳酸菌飲品；周春峰等[9]利用復合乳酸菌發(fā)酵紅棗，減少了自由基，提高了抗氧化活性。

代謝組學是以生物樣品中的低分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物（如有機酸、脂肪酸、氨基酸、糖等）為研究對象，通過高通量檢測和數(shù)據(jù)處理，進行信息整合及生物標記物鑒定的科學[10]，由于氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spec trometry，GC-MS）技術(shù)成本較低，具有重復性好、分辨率高、基體效應(yīng)小的優(yōu)點[11]，已被廣泛用于發(fā)酵食品中代謝物的定性和定量測定。如陳中等[12]利用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵西瓜汁，利用GC-MS技術(shù)測定主要揮發(fā)性物質(zhì)，對比了不同乳酸菌發(fā)酵特性的差異；楊立啟[13]采用GC-MS法比較了植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵蜜桔的揮發(fā)性成分差異，以及三種乳酸菌對呈香呈味方面的作用。上述研究均表明基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝物分析有助于了解發(fā)酵產(chǎn)品的代謝物差異。

然而，目前關(guān)于發(fā)酵棗汁的報道主要集中經(jīng)過發(fā)酵后風味物質(zhì)變化，對發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的差異以及動態(tài)變化的研究較少，本研究采用GC-MS結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對發(fā)酵紅棗汁在不同發(fā)酵階段差異代謝物進行全面的鑒定與分析，以期深入了解發(fā)酵過程中風味形成、營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的潛在機制，為紅棗乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的功能性研發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

干紅棗（Ziziphus jujube）：寧夏同心路市場采購；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）：寧夏固原農(nóng)家采集漿水，無菌離心管采樣帶回實驗室，放于實驗室4 ℃保存。

1.1.2 化學試劑

氯仿（色譜純）：北京沃凱生物科技有限公司；吡啶（色譜純）、甲氧胺鹽酸鹽（分析純）、L-2氯苯丙氨酸（分析純）：上海阿達瑪斯試劑有限公司；雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺（bistrimethylsilane trifluoroacetamide，BSTFA）（1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS））硅烷化試劑：美國Regis公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher Scientific公司；果膠酶（500 U/mg）：上海源葉生物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；Y66靜音真空高速破壁機：九陽股份有限公司；Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀：上海萬柏生物科技有限公司；NewClassicMFMS105DU New Classic MS電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機、（100～1 000）μL、（20～200）μL手動單道移液器：德國Eppendorf公司；JXDC-20氮吹儀：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；8890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；TH2-D恒溫振蕩器：上海葉拓儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將嗜酸乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基上進行劃線后放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過兩次MRS液體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)進行擴培。

1.3.2 發(fā)酵棗汁的制備

將干紅棗清洗干凈、去核、切塊，將清洗后的紅棗按料液比1∶6（g∶mL）加水，在90 ℃條件下預煮20 min可使紅棗充分軟化，冷卻到室溫后，打漿機破碎，加入0.15%果膠酶，裝入已滅菌的錐形瓶，進行巴氏殺菌，根據(jù)單因素響應(yīng)面優(yōu)化的發(fā)酵條件，按4%（V/V）接種量接入事先活化好的嗜酸乳桿菌，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h。將上述發(fā)酵汁放置-80 ℃，備用[14]。

1.3.3 發(fā)酵棗汁預處理

稱取50 mg發(fā)酵棗汁樣本，放入1.5 mL EP管中，加入40 μL內(nèi)標（L-2-氯-苯丙氨酸0.3 mg/mL），加入360 μL冷甲醇，勻漿，冰水浴中超聲提取30 min，加入200 μL的氯仿和400 μL的純水，渦旋1 min，冰水浴中超聲提取30 min，10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取400 μL上清液，室溫揮干后衍生化。

1.3.4 不同發(fā)酵階段棗汁中揮發(fā)性化合物分析

采用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀對發(fā)酵棗汁進行代謝組學分析。

分別設(shè)置0 h（記為FJ-0 h）、18 h（記為FJ-18 h）、22 h（記為FJ-22 h）的不同發(fā)酵時間，并設(shè)置未發(fā)酵組（記為UFJ）及質(zhì)控樣品組（記為QC），每組樣品采樣5次，全部上機進行分析。

氣相色譜條件：HP-5MS（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣量1 μL；不分流進樣；載氣：高純氦氣（He）；流速1.0 mL/min；進樣口溫度260 ℃；程序升溫：初始溫度60 ℃，8 ℃/min 的速度升至310 ℃，并維持6 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV；掃描類型：全掃描模式。

1.3.5 代謝物定性定量分析

GC-MS的原始數(shù)據(jù)經(jīng)MassHunter軟件進行預處理，導出CSV格式的三維數(shù)據(jù)矩陣，三維矩陣包括的信息有：樣品信息、代謝物名稱和質(zhì)譜響應(yīng)強度，內(nèi)標峰以及任何已知的假陽性峰（包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰）均從數(shù)據(jù)矩陣中去除，并進行去冗余和峰合并。用峰面積歸一化法對樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強度進行歸一化，得到歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣。采用MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進行代謝物注釋、數(shù)據(jù)預處理等，最終得到代謝物列表及數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)合T檢驗和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal-partial least squares-discriminant analysis，O-PLS-DA）篩選出代謝物。進一步采用通路分析、關(guān)聯(lián)分析、聚類分析等高級分析對代謝的生物學信息進行挖掘。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

篩選出的顯著性代謝差異物根據(jù)其質(zhì)荷比、保留時間（retention time，RT）和二級碎片信息通過Progenesis QI軟件在HMDB（http：//www.hmdb.ca/），ECMDB（http：//ecmdb.ca/），YMDB（http：//www.ymdb.ca/）與KEGG（http：//www.kegg.jp/），Chem-spider（http：//www.chemspider.com/）等數(shù)據(jù)庫進行檢索，確定其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多元統(tǒng)計分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖的聚散程度反映了樣本代謝物的相近程度，即發(fā)酵過程中代謝物的聚類情況，代謝水平越接近的點在得分圖上越接近[15]。將未發(fā)酵棗汁、嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗汁0 h、18 h、22 h進行PCA，結(jié)果見圖1。由圖1可知，樣品PCA中模型對X變量差異解釋能力R2為0.651＞0.5，表明模型的擬合準確性好，且得分圖的所有樣品均在橢圓內(nèi)，說明分析的樣品中沒有異常值。隨著發(fā)酵時間的延長，由于代謝物之間的相互作用，產(chǎn)生酸等各種風味物質(zhì)，導致未發(fā)酵、0 h和18 h樣本之間存在明顯分離。而發(fā)酵18 h和22 h后的樣本在得分圖上區(qū)分不明顯，可能是原料中的糖基本被消耗，代謝物變化緩慢。

圖1 不同發(fā)酵階段代謝物主成分分析結(jié)果Fig.1 Results of principle component analysis for metabolites in different fermentation stages

2.2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗汁過程中揮發(fā)性成分O-PLS-DA結(jié)果

對嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗汁過程中的揮發(fā)性成分進行主成分分析和聚類分析，可將發(fā)酵分為四個階段：未發(fā)酵、0 h、18 h、22 h。因此將發(fā)酵過程中的樣品進行歸類，利用O-PLS-DA進行分析，可以得出發(fā)酵棗汁各階段的主要呈味香氣成分，不同發(fā)酵時間O-PLS-DA得分結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，此模型共提取4個預測成分，這4個預測成分的累計統(tǒng)計量所建模型對X矩陣的解釋能力R2為0.788，說明該模型對揮發(fā)性成分矩陣的解釋能力R2為0.788；所建模型對Y矩陣的解釋能力R2為0.998，說明該模型對發(fā)酵過程中樣品矩陣的解釋能力R2為0.998；模型的預測能力Q2為0.978。通常R2和Q2＞0.50擬合準確性較好，＞0.4即可接受，預測該模型在本實驗中的擬合準確性極高。

圖2 不同發(fā)酵階段代謝物正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果Fig.2 Results of orthogonal partial least squares-discriminant analysis for metabolites in different fermentation stages

2.3 差異代謝物篩選與分析

基于O-PLS-DA模型分析結(jié)果，將P值＜0.05的代謝物作為后發(fā)酵階段的差異代謝物，結(jié)果共鑒定出29種顯著差異代謝物。其中有機酸4種，苯環(huán)化合物3種，酯類物質(zhì)2種，有機雜環(huán)化合物2種，碳氧化合物1種，其他種類化合物15種。不同發(fā)酵階段差異代謝物含量如表1所示。

表1 棗汁不同發(fā)酵階段差異代謝物Table1 Different metabolites of jujube juice in different fermentation stages

續(xù)表

差異代謝物在不同階段相對豐度變化的聚類分析見圖3，左側(cè)為代謝物聚類的樹狀圖，右側(cè)為代謝物的名稱，同一代謝物在不同時間段，藍色表示表達量降低，紅色表示表達量升高。由圖3可知，隨著發(fā)酵時長增長，代謝物表達量逐漸增加，18 h和22 h代謝物表達相似。

圖3 棗汁不同發(fā)酵階段差異代謝物聚類分析Fig.3 Cluster analysis of differential metabolites of jujube juice in different fermentation stages

在發(fā)酵乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類化合物主要來源于脂肪分解、蛋白質(zhì)水解等代謝途徑[16]。有機酸在風味方面更顯較大。由圖3可知，通過嗜酸乳桿菌與紅棗協(xié)同發(fā)酵可產(chǎn)生更多具有酸敗氣味[17]的己酸，在發(fā)酵過程中己酸含量逐漸降低，說明通過嗜酸乳桿菌發(fā)酵可減弱不良氣味，有利于風味的提升。

風味物質(zhì)方面，在發(fā)酵過程中，辛酸甲酯的含量由高降低，辛酸甲酯具有柑香與酒香味[18]。另外發(fā)現(xiàn)一種與3-苯乳酸類似的物質(zhì)苯乙醛，它是一種具有濃郁玉簪花香氣的風味物質(zhì)[19]，在發(fā)酵初期階段相對含量提高，賦予發(fā)酵產(chǎn)品獨特風味，它通過苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生，苯丙氨酸代謝途徑與酚類化合物合成有關(guān)。對甲酚具有臭味，在發(fā)酵過程中含量下調(diào)。松油醇具有花香，是常見香料，經(jīng)過發(fā)酵后，含量降低。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草的香氣[20]，在發(fā)酵棗汁產(chǎn)品揮發(fā)性成分中常見，隨著發(fā)酵時間延長，相對豐度增加。1-十八烯是一種馬鈴薯苗所具有的揮發(fā)性物質(zhì)，在發(fā)酵過程中代謝被抑制。這些香氣物質(zhì)通過發(fā)酵在發(fā)酵產(chǎn)品所含濃度增加，促進了良好風味的形成。

氨基酸具有縮短發(fā)酵時間賦予了發(fā)酵產(chǎn)品更多的營養(yǎng)物質(zhì)的作用[21]。雖然氨基酸并非發(fā)酵乳的揮發(fā)性風味物質(zhì)，但作為揮發(fā)性化合物的前體物質(zhì)，能夠進一步轉(zhuǎn)化成醇類、醛類、酯類和硫化物等物質(zhì)，且對發(fā)酵產(chǎn)品的滋味具有的較大貢獻[22]。去甲纈氨酸、L-組氨酸在發(fā)酵過程中上調(diào)。肌氨酸在發(fā)酵過程中含量降低，與甘氨酸代謝有關(guān)。

2.4 關(guān)鍵代謝物分析

為了深入了解發(fā)酵棗汁發(fā)酵階段潛在代謝途徑，進行差異代謝物的代謝途徑分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，通路分析結(jié)果顯示共獲得26個途徑，基于重要性分析，對關(guān)鍵代謝途徑進行篩選，篩選出12條在嗜酸乳桿菌發(fā)酵紅棗過程重要的代謝通路，這些途徑包括：組氨酸代謝、苯乙烯降解、煙酸和煙酰胺代謝、精氨酸生物合成、甲苯降解、苯丙氨酸代謝、阿特拉津降解、嘌呤代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯甲酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、嘧啶代謝。其中重要的代謝物分別為L-組氨酸、去甲纈氨酸、尿素、次黃嘌呤、褪黑素、煙酰胺。

圖4 棗汁不同發(fā)酵階段差異代謝物京都基因與基因組百科全書拓撲學分析氣泡圖Fig.4 Bubble chart of Kyoto encyclopedia of genes and genomes topological analysis of differential metabolites of jujube juice in different fermentation stages

L-組氨酸作為氨基酸代謝的重要產(chǎn)物，在紅棗發(fā)酵過程中參與了其中6條KEGG代謝通路，分別為β-丙氨酸代謝、組氨酸代謝、氨酰tRNA生物合成、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、組氨酸和嘌呤生物堿的生物合成。其中重要的代謝物分別為L-組氨酸、去甲纈氨酸、尿素、次黃嘌呤。肌肽通過β-丙氨酸代謝生成L-組氨酸和β-丙氨酸，肌肽具有調(diào)節(jié)血糖的功效。在接菌后產(chǎn)生此代謝通路，猜測嗜酸乳桿菌可能通過分解乳酸菌中肌肽產(chǎn)生L-組氨酸。

去甲纈氨酸是一種非蛋白源性支鏈氨基酸，非蛋白質(zhì)氨基酸在生物體內(nèi)可參與儲能、形成跨膜離子通道和充當神經(jīng)遞質(zhì)，乳酸菌具有較強的精氨酸代謝能力，通過精氨酸脫亞胺途徑可產(chǎn)生尿素[23]。尿素作為代謝過程中的終產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中注釋到8條KEGG代謝通路，包括精氨酸、脯氨酸、嘌呤、嘧啶、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸代謝通路、阿特拉津降解。

次黃嘌呤氧化酶氧化次黃嘌呤生成黃嘌呤，進一步氧化黃嘌呤生成尿素。黃嘌呤氧化酶在催化多種不同底物的氧化時，除了生成產(chǎn)物尿酸之外，還形成超氧自由基和過氧化氫[24]。接菌0 h次黃嘌呤含量升高，尿素含量升高，黃嘌呤氧化酶含量增加，菌株自身可能具有產(chǎn)次黃嘌呤氧化酶的作用，隨著發(fā)酵時間增長，次黃嘌呤表達豐度降低，產(chǎn)生的代謝物對黃嘌呤氧化酶有抑制作用。

褪黑素是一種強氧化劑強，有超強的抗氧化清除能力，具有抗衰老、調(diào)節(jié)睡眠、抗腫瘤等作用。在參與色氨酸代謝過程中，4個連續(xù)酶促反應(yīng)生成褪黑素。隨著發(fā)酵時間增長，棗汁中的pH降低。pH偏酸會提高褪黑素水平[25]。研究證明，褪黑素含量少，多酚、黃酮等抗氧化物質(zhì)含量增加。YU Z等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在甜櫻桃果實發(fā)育周期內(nèi)，褪黑素含量與丙二醛含量呈現(xiàn)出反比的關(guān)系。乳酸菌具有提高多酚、黃酮物質(zhì)等抗氧化物質(zhì)含量的作用。為開發(fā)功能性發(fā)酵產(chǎn)品提供依據(jù)。

煙酰胺參與生物體內(nèi)糖原分解、脂類代謝及各種物質(zhì)的氧化作用[27]，是一種潛在抗氧化性物質(zhì)，注釋到一條代謝通路為煙酸和煙酰胺代謝。隨著發(fā)酵時間增加，含量增加，說明通過嗜酸乳桿菌的發(fā)酵，抗氧化能力被逐漸提高。

3 結(jié)論

本研究采用GC-MS技術(shù)對嗜酸乳桿菌發(fā)酵紅棗汁各階段的代謝物進行分析。結(jié)果表明，在未發(fā)酵、發(fā)酵0 h、18 h、22 h這4個時間點中有12條代謝通路具有重要作用，其中篩選出關(guān)鍵代謝物為L-組氨酸、去甲纈氨酸、尿素、次黃嘌呤、褪黑素、煙酰胺。辛酸甲酯、苯乙醛、松油醇、1-辛烯-3-醇、1-十八烯作為呈香作用的酯類物質(zhì)和醛類物質(zhì)隨著發(fā)酵時間增加對乳酸菌飲料特殊風味形成發(fā)揮重要作用。煙酰胺、褪黑素等具有強抗氧化能力的物質(zhì)，為產(chǎn)品功能性開發(fā)提供依據(jù)，去甲纈氨酸、L-組氨酸、肌氨酸、肌肽等有機酸、氨基酸、多肽類等生物活性物質(zhì)的含量變化為益生菌飲料的生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支撐和理論指導。