赤霞珠葡萄籽多酚低共熔溶劑提取及其抗氧化活性研究

崔夢(mèng)情，石 侃，2，3，鄧聲林，曹嘉敏，劉樹(shù)文，2，3*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 渭南 715300；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

葡萄酒釀造過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物（葡萄皮渣），占鮮果質(zhì)量的25%左右，每年產(chǎn)生的葡萄皮渣超過(guò)900萬(wàn)t[1]。葡萄皮渣中含有豐富的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、膳食纖維和多種酚類(lèi)物質(zhì)，尤其是其中的酚類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抑菌及抗癌等多種生物活性[2]。葡萄皮渣中的酚類(lèi)物質(zhì)主要分布在葡萄籽中，葡萄籽中的酚類(lèi)物質(zhì)主要是黃烷-3-醇類(lèi)[3-4]。然而，目前釀酒葡萄皮渣主要被用作植物肥料[5]、牲畜飼料[6-7]，甚至被當(dāng)作廢棄垃圾，這些處理方式會(huì)造成土壤酸化、板結(jié)以及生態(tài)環(huán)境污染等負(fù)面影響，同時(shí)也導(dǎo)致了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

目前，植物基質(zhì)中多酚化合物的提取主要采用有機(jī)溶劑提取法，或者是借助物理方法輔助提取。然而有機(jī)溶劑提取法存在許多缺點(diǎn)，如較高揮發(fā)性、毒性、可燃性以及較低生物降解率等。低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）是一類(lèi)環(huán)境友好的新型綠色溶劑，其通常由氫供體（hydrogenbonddonor，HBD）和氫受體（hydrogenbondacceptor，HBA）組成，溶劑熔點(diǎn)比其中任一組分的熔點(diǎn)都低，因此在室溫下能以液態(tài)形式穩(wěn)定存在[8]。相比有機(jī)溶劑，DESs易于合成、成本低、穩(wěn)定性好、不易揮發(fā)、可生物降解、綠色環(huán)保，近年來(lái)引起越來(lái)越多的人關(guān)注，并廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取研究中[9-10]。焦曉波等[11]合成了4種DES溶劑用來(lái)提取芝麻渣中的芝麻蛋白，相比傳統(tǒng)的堿溶酸沉法，其中醋酸鈉和尿素形成的DES對(duì)芝麻蛋白的提取純度較高，說(shuō)明DESs可以作為一種綠色新型的植物蛋白提取溶劑。周萍等[12]利用DESs提取桑葚果渣中的花色苷，發(fā)現(xiàn)草酸-氯化膽堿對(duì)桑葚果渣花色苷的提取率最高，經(jīng)大孔樹(shù)脂分離后，回收率達(dá)到92.76%。孫悅等[13]采用超聲輔助低共熔溶劑法，優(yōu)化提取甘草中多糖的工藝條件，在含水量為40%，物質(zhì)的量比為1∶3的氯化膽堿-異丙醇溶劑，提取溫度39 ℃、料液比1∶50（g∶mL）、超聲時(shí)間30 min、超聲功率250 W條件下，對(duì)多糖的提取率高達(dá)8.31%。

本研究首先合成不同的DESs，采用合成的DESs結(jié)合超聲輔助法提取赤霞珠葡萄籽多酚，分析不同DESs對(duì)葡萄籽的酚類(lèi)化合物提取及體外抗氧化活性的影響，為釀酒葡萄皮渣中多酚的高效提取及基于多酚的釀酒葡萄廢棄物資源化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄皮渣（手動(dòng)分離得到赤霞珠葡萄籽，置于烘箱內(nèi)，50 ℃烘干48 h，經(jīng)粉碎、過(guò)篩（18目），避光儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱，待用）：由寧夏賀蘭山東麓保樂(lè)力加酒廠提供；沒(méi)食子酸、氯化膽堿、脯氨酸、甜菜堿、甘油、乳酸、三乙二醇、乙酰丙酸、乙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丁香酸、兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、原花青素B1、原花青素B2（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）（均為分析純）、四川西隴科學(xué)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-150小型粉碎機(jī)：濟(jì)南柏盛生物科技有限公司；78-1加熱磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Cary60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 DESs合成

按照表1中的摩爾比合成相應(yīng)的低共熔溶劑[14-16]（DES-1～DES-13），使用磁力加熱攪拌器加熱至80 ℃，攪拌3～5 h，直至形成均一透明的溶液，合成的低共熔溶劑穩(wěn)定12 h后，用去離子水稀釋后待用。

表1 低共熔溶劑合成列表Table1 List of deep-eutectic solvents composition

1.3.2 葡萄籽多酚超聲輔助提取流程

準(zhǔn)確稱(chēng)量0.500 g葡萄籽粉末置于15 mL離心管中。分別加入5 mL稀釋后的DESs，并以水、體積分?jǐn)?shù)均為80%乙醇和甲醇作為對(duì)照，在超聲功率300 W、超聲溫度40 ℃條件下提取30 min[16]，提取液于10 000 r/min離心5 min后，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，用于后續(xù)分析。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

總酚含量測(cè)定采用福林酚法[17]。取1 mL適當(dāng)稀釋后的提取液，加入0.5 mL福林酚試劑，混勻后放置5 min，加入1.5 mL20%的碳酸鈉溶液，混勻后用去離子水定容至10 mL，室溫下靜置1 h后在765 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值。用不同質(zhì)量濃度沒(méi)食子酸溶液（10～100 mg/L）代替樣品溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以沒(méi)食子酸含量（x）為橫坐標(biāo)、吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=0.011 2x+0.052 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 2。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中總酚含量，結(jié)果以mg沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）/100 g表示，以干基計(jì)。

1.3.4 總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定采用分光光度法[18]。取200 μL稀釋后的提取液，加入800 μL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，然后加入60 μL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后放置5 min，加入60 μL 10%三氯化鋁溶液，混勻，放置6 min，加入400 μL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，加入480 μL體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇，混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，用不同質(zhì)量濃度（50～400 mg/L）的兒茶素溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以?xún)翰杷睾浚▁）為橫坐標(biāo)、吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=0.002 7x-0.007 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量，結(jié)果以mg兒茶素當(dāng)量（catechin equivalent，CE）/100 g表示，以干基計(jì)。

1.3.5 單體酚含量測(cè)定

單體酚含量測(cè)定采用高效液相色譜（high performance liquidchromatography，HPLC）法[19]。HPLC色譜條件為：Waters-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；樣品進(jìn)樣體積20 μL；流動(dòng)相A：2%（V/V）乙酸溶液，流動(dòng)相B：2%（V/V）乙酸-乙腈溶液；流速1 mL/min，采取梯度洗脫（0 min，5%B；40 min，20%B；55 min，27.5%B；65 min，50%B；66～71 min，80%B；73～78 min，5%B）。通過(guò)外標(biāo)法，對(duì)比6種單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，確定色譜峰代表的物質(zhì)種類(lèi)，通過(guò)峰面積計(jì)算出物質(zhì)的含量。

1.3.6 體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除活性測(cè)定：取250 μL稀釋后的樣品加入2 mL 100 μmol/L的DPPH溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值，用不同摩爾濃度（0～300 μmol/L）的維生素C溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以維生素C含量（x）為橫坐標(biāo)、吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程（y=-2.865 3x+1.079 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5），照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品的DPPH自由基的清除能力，結(jié)果以mg 維生素C當(dāng)量（vitamin C equivalent，VCE）/100 g表示[20]，以干基計(jì)。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A空白是DPPH純?nèi)芤涸诓ㄩL(zhǎng)517 nm條件下的吸光度值，A樣品是反應(yīng)液在波長(zhǎng)517 nm條件下的吸光度值。

ABTS+自由基清除活性測(cè)定：配制2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液和7 mmol/L的ABTS的溶液，等體積混勻，室溫下避光反應(yīng)16 h得新鮮的ABTS+溶液，使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋至波長(zhǎng)734 nm條件下吸光度值為0.70±0.02。取2 mLABTS+溶液，加入500 μL適當(dāng)稀釋后的提取液，混勻后，室溫避光反應(yīng)10 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，用不同摩爾濃度（0～60 μmol/L）的維生素C溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以維生素C含量（x）為橫坐標(biāo)、吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程（y=-3.219 7x+0.570 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8），按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品的ABTS+自由基的清除能力，自由基的清除能力以mg VCE/100 g表示[20]，以干基計(jì)。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A空白是ABTS+自由基純?nèi)芤涸诓ㄩL(zhǎng)734 nm條件下的吸光度值，A樣品是反應(yīng)液在波長(zhǎng)734 nm條件下的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對(duì)赤霞珠葡萄籽總酚提取的影響

體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇、體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇和水是植物多酚最常用的提取溶劑，因此本研究中將DESs作為提取溶劑的提取量與上述常見(jiàn)提取溶劑進(jìn)行對(duì)比，赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物中總酚含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄籽不同溶劑提取物中總酚含量Fig.1 Total phenol contents in different solvents extracts of grape seed

由圖1可知，多數(shù)DESs對(duì)赤霞珠葡萄籽總酚的提取量遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑（體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇、體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇）。氯化膽堿-乳酸（ChCl-LA）、氯化膽堿-乙二醇（ChCl-EGly）和甜菜堿-乙酰丙酸（Bet-Lev）對(duì)總酚的提取量較高，分別為2 505.13 mg GAE/100 g、2 323.96 mg GAE/100 g和2109.93mgGAE/100 g，這可能與DESs的極性有關(guān)[21-22]，氯化膽堿-乳酸（ChCl-LA）提取物中總酚含量分別比體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇和體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇提高了154%和97%。大多數(shù)有機(jī)酸作為氫鍵供體的DESs對(duì)赤霞珠葡萄籽總酚的提取量高于甘油作為氫鍵供體的DESs，如總酚含量：甜菜堿-乙酰丙酸（Bet-Lev）＞甜菜堿-丙三醇（Bet-Gly）、脯氨酸-乳酸（Pro-LA）＞脯氨酸-丙三醇（Pro-Gly）、氯化膽堿-乙酰丙酸（ChCl-Lev）＞氯化膽堿-丙三醇（ChCl-Gly）、氯化膽堿-乳酸（ChCl-LA）＞氯化膽堿-丙三醇（ChCl-Gly）。這可能與有機(jī)酸作為氫鍵供體的DESs能與多酚形成較強(qiáng)的氫鍵作用有關(guān)[23-24]。

2.2 不同溶劑對(duì)赤霞珠葡萄籽總黃酮提取的影響

赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物中總黃酮含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄籽不同溶劑提取物中總黃酮含量Fig.2 Total flavonoid contents in different solvents extracts of grape seed

由圖2可知，脯氨酸-乙酰丙酸（Pro-Lev）（2 849.444 5 mg CE/100g）、甜菜堿-乙酰丙酸（Bet-Lev）（2181.713mgCE/100g）和氯化膽堿-乙酰丙酸（ChCl-Lev）（1 819.44 mg CE/100 g）對(duì)總黃酮的提取量較高，氯化膽堿-三乙二醇（ChCl-Tgly）（1 633.18 mg CE/100 g）和氯化膽堿-乳酸（ChCl-LA）（1 571.45 mg CE/100 g）次之。這些DESs對(duì)總黃酮的提取量均顯著高于體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇（1 385.80 mg CE/100 g）、體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇（811.98 mg CE/100 g）和水（274.84 mg CE/100 g）。其中脯氨酸-乙酰丙酸（Pro-Lev）提取物中總黃酮含量分別比體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇和體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇提高了251%和106%。

2.3 赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物中主要酚類(lèi)化合物的定量分析

研究表明，酚類(lèi)化合物的組成和含量與提取溶劑的類(lèi)型有關(guān)[25-26]。赤霞珠葡萄籽不同提取溶劑提取物中單體酚類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的HPLC色譜圖見(jiàn)圖3，不同提取溶劑提取物中主要單體酚類(lèi)化合物（沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2、丁香酸）的定量分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 葡萄籽不同提取溶劑提取物中主要單體酚類(lèi)化合物的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatograms of main monomer phenolic compounds in different solvents extracts of grape seed

表2 葡萄籽不同溶劑提取物中主要單體酚類(lèi)化合物的含量Table2 Main monomer phenolic compounds contents in different solvents extracts of grape seed

續(xù)表

由圖3及表2可知，對(duì)于常規(guī)提取溶劑，體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇提取物中單體酚含量較高，H2O提取物中單體酚含量最低。DESs提取物中單體酚的含量顯著高于常規(guī)提取溶劑（P＜0.05），其中氯化膽堿-三乙二醇（ChCl-TGly）中沒(méi)食子酸含量最高（6.43 mg/100 g），脯氨酸-乳酸（Pro-LA）中原花青素B1含量最高（91.11 mg/100 g），氯化膽堿-乳酸（ChCl-LA）中原花青素B2的含量最高（80.78 mg/100 g），氯化膽堿-乙二醇（ChCl-EGly）中兒茶素（52.29 mg/100 g）、表兒茶素含量最高（31.57 mg/100 g）。較傳統(tǒng)溶劑而言，作為赤霞珠葡萄籽酚類(lèi)物質(zhì)的提取溶劑，DESs對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的提取量更高。

2.4 赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物體外抗氧化能力

本研究采用DPPH和ABTS+自由基清除結(jié)果表征赤霞珠葡萄籽不同溶劑多酚提取物的體外抗氧化能力。DPPH和ABTS+自由基清除能力的結(jié)果表現(xiàn)出良好的一致性。由圖4和表3可知，氯化膽堿-乙二醇（ChCl-EGly）（DPPH，3 873.89 mg VCE/100 g；ABTS+，8 898.49 mg VCE/100 g）、脯氨酸-乙二醇（Pro-EGly）（DPPH，3311.15mgVCE/100g；ABTS+，9536.71 mg VCE/100 g）和氯化膽堿-三乙二醇提取物（ChCl-TGly）（DPPH，3212.82mgVCE/100g；ABTS+，8424.39mgVCE/100g）對(duì)兩種自由基清除效果較強(qiáng)，多數(shù)DESs提取物的體外抗氧化活性顯著高于體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇、體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇和水等常規(guī)溶劑提取物的體外抗氧化活性（P＜0.05）。其中氯化膽堿-乙二醇（ChCl-EGly）的DPPH和ABTS+自由基清除能力分別達(dá)到3 873.89 mg VCE/100 g和8 898.49 mg VCE/100 g，分別比體積分?jǐn)?shù)80%甲醇（DPPH，2 715.13 mg VCE/100 g；ABTS+，6 582.70 mg VCE/100 g）高43%和35%。研究表明，提取溶劑的類(lèi)型顯著影響多酚提取物的總酚含量、總黃酮含量，最終影響其抗氧化活性[27-28]。本研究中，較傳統(tǒng)溶劑而言，作為赤霞珠葡萄籽酚類(lèi)物質(zhì)的提取溶劑，DESs酚類(lèi)物質(zhì)提取物的抗氧化活性更強(qiáng)。

圖4 葡萄籽不同提取溶劑提取物DPPH（A）和ABTS+（B）自由基清除率Fig.4 Radical scavenging rate of DPPH (A) and ABTS+(B) in different solvents extracts of grape seed

表3 葡萄籽不同溶劑提取物中的體外抗氧化活性Table3 Antioxidant activities in vitro in different solvents extracts of grape seed

2.5 赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物中酚類(lèi)物質(zhì)與其抗氧化能力的相關(guān)性分析

采用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物中酚類(lèi)物質(zhì)含量與其抗氧化活性的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，提取物中總酚含量與DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明DESs提取物中總酚含量越高，其抗氧化活性越強(qiáng)，總酚是其體外抗氧化活性主要貢獻(xiàn)因素。兒茶素、表兒茶素、原花青素B2和總酚含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），兒茶素、表兒茶素和總黃酮、DPPH自由基清除能力以及ABTS+自由基清除能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明赤霞珠葡萄籽DESs提取物中兒茶素、表兒茶素含量越高，其抗氧化活性越強(qiáng)，兒茶素、表兒茶素是DESs提取物抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)因素。

表4 葡萄籽不同溶劑提取物中總酚/單體酚含量與其抗氧化能力的皮爾森相關(guān)性分析Table4 Pearson correlation analysis of total phenolic/monomer phenols contents in different solvents extracts of grape seed

3 結(jié)論

本研究利用低共熔溶劑結(jié)合超聲輔助提取赤霞珠葡萄籽中的酚類(lèi)物質(zhì)，13種DESs中多數(shù)DESs對(duì)赤霞珠葡萄籽中多酚提取量顯著高于常規(guī)有機(jī)溶劑。其中，氯化膽堿-乳酸（ChCl-LA）提取物中總酚含量最高，為2505.13mgGAE/100g；脯氨酸-乙酰丙酸（Pro-Lev）提取物中總黃酮含量最高，為2 849.44 mg CE/100 g。不同DESs溶劑提取物中主要的酚類(lèi)物質(zhì)（沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2、丁香酸）的含量顯著高于常規(guī)提取溶劑。部分DESs多酚提取物還具有較高的體外抗氧化活性，其中，氯化膽堿-乙二醇（ChCl-EGly）（DPPH，3 873.89 mg VCE/100 g）和脯氨酸-乙二醇（Pro-EGly）（ABTS+，9 536.71 mg VCE/100 g）提取物體外抗氧化活性較強(qiáng)。因此，氯化膽堿-乙二醇和脯氨酸-乙二醇溶劑結(jié)合超聲輔助提取可作為赤霞珠葡萄籽多酚抗氧化成分的高效綠色提取溶劑，研究結(jié)果具有重要的應(yīng)用價(jià)值及意義，可為基于多酚的釀酒葡萄皮渣資源化利用奠定基礎(chǔ)。