高產(chǎn)酸本土非釀酒酵母菌株的篩選及發(fā)酵性能研究

董琦楠，葉冬青，梁艷英，姜 嬌，劉延琳，3*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站，寧夏 永寧 750104）

近年來，我國西部葡萄酒產(chǎn)區(qū)葡萄原料糖分過高、酸度過低的現(xiàn)象愈發(fā)突出，因此，導(dǎo)致所釀造的葡萄酒口感風(fēng)味不平衡[1]，葡萄酒色澤變暗[2]，易遭到微生物的污染[3]。如何提高葡萄酒酸度，突出葡萄酒典型性風(fēng)格特征，已成為我國西部地區(qū)葡萄酒釀造急需解決的問題。目前較為普遍的增酸方法包括物理增酸、化學(xué)增酸及生物增酸三類[4-7]?；瘜W(xué)方法主要通過添加酒石酸調(diào)節(jié)葡萄酒的酸度，但這可能會引起酒石酸沉淀[3]，進而對葡萄酒產(chǎn)生復(fù)雜影響，而且添加量受到法律的嚴(yán)格限制[8]。物理方法增酸主要是采用離子交換法，其價格昂貴，且易引入大量其他離子[7]。生物增酸使葡萄酒穩(wěn)定性高、口感柔和，成為理想的增酸方法。

隨著近年來對非釀酒酵母（non-Saccharomyces）研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)葡萄酒在發(fā)酵過程中可利用非釀酒酵母產(chǎn)生乳酸，使其口感柔和，性質(zhì)穩(wěn)定[9]。非釀酒酵母用于葡萄酒生物增酸具有極大潛力，逐漸成為近年來的研究熱點[10-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）及葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）能夠提高葡萄酒的酸度、降低pH值，同時也能夠增加葡萄酒的香氣[13-16]，其有較強的發(fā)酵能力，對酒精、SO2耐受性較高[17-18]。

本研究以25株本土非釀酒酵母（18株耐熱克魯維酵母、7株葡萄汁有孢漢遜酵母）為研究對象，將其在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）10、Triple M改良模擬汁中進行發(fā)酵，測定產(chǎn)酸能力，篩選增酸菌株，并對所篩選菌株的乙醇、SO2、糖及pH耐受性進行研究，最后利用篩選菌株對葡萄汁進行發(fā)酵，進而篩選能夠有效增加葡萄酒酸度的優(yōu)良本土非釀酒酵母菌，以期為非釀酒酵母在發(fā)酵低酸葡萄汁中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株本研究所用實驗菌株的類型及來源見表1。

表1 本研究所用實驗菌株類型及來源Table1 Types and origins of test strains used in the study

1.1.2 試劑

酒石酸、蘋果酸、檸檬酸（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；精氨酸、脯氨酸、色氨酸（純度99.85%）：北京索萊寶科技有限公司；L-乳酸試劑盒、D-乳酸試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基[19]：葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD10液體培養(yǎng)基[20]：葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Triple M改良模擬汁[21]：將ergo stock（12.5 mL Tween80，37.5 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，0.125 g麥角固醇）、溶液A（375 mL去離子水中加125 g葡萄糖，125 g果糖，4 mL ergo stock，溶解后加入去離子水補充到500 mL）、溶液B（250 mL去離子水中加6 g酒石酸，3 g蘋果酸，0.5 g檸檬酸）、溶液C（250 mL去離子水中加入1.7 g無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB），2 g水解酪蛋白，6 mg肌醇，0.2 g無水氯化鈣，0.8 gL-精氨酸，1 gL-脯氨酸，0.1 g色氨酸，1 g磷酸銨）混合后，用氫氧化鉀調(diào)pH至3.25，過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-Vis Cary60紫外分光光度計：美國安捷倫公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；BK1301生物顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司；87H+液相色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）：美國Bio Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 本土非釀酒酵母菌株在YPD10培養(yǎng)基中的發(fā)酵實驗

以商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10及商業(yè)釀酒酵母NX11424為對照，取-20 ℃甘油保藏的菌液50 μL于含4 mL YPD培養(yǎng)基的試管中，在28 ℃、150 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h。將活化好的菌株以105CFU/mL的接種量接種到20 mL YPD10液體培養(yǎng)基（初始pH值5.8）中，在28 ℃、150 r/min的條件下發(fā)酵60 h，取樣。將樣品以8 000 r/min離心2 min后取上清液，測定乳酸（L-乳酸及D-乳酸）含量及pH值，并計算pH降低值（ΔpH），以進行高產(chǎn)乳酸菌株的初步篩選。

1.3.2 本土非釀酒酵母菌株在Triple M改良模擬汁中的發(fā)酵實驗

以商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10為對照，將上一步篩選出的非釀酒酵母進行活化，將活化好的菌株以105CFU/mL的接種量接種到20 mL Triple M改良模擬汁（初始pH為3.25，還原糖含量為250 g/L，可滴定酸含量為8.97 g/L）中，在28 ℃，150 r/min的條件下進行發(fā)酵。每24 h稱質(zhì)量以測定其CO2質(zhì)量損失，當(dāng)連續(xù)3 d CO2質(zhì)量損失均在0.1 g以下，則發(fā)酵結(jié)束。對發(fā)酵結(jié)束的樣品進行取樣，將樣品以8 000 r/min離心2 min后取上清液，測定酒精度、殘?zhí)橇俊H值、可滴定酸、揮發(fā)酸、乳酸及蘋果酸含量。

1.3.3 菌株耐受性研究

以YPD培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（3%、6%、9%、12%、15%）、不同質(zhì)量濃度的SO2（以H2SO3形式添加）（60 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L、300mg/L、360mg/L）、不同質(zhì)量濃度的葡萄糖（200g/L、250g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L），調(diào)成不同的pH值（pH2.8、pH3.2、pH3.6、pH3.8），將處于對數(shù)生長期的所篩選菌株分別以105CFU/mL的接種量接種于不同培養(yǎng)基中進行耐受性試驗，在28 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值），分別繪制菌株乙醇耐受性、SO2耐受性、糖耐受性、pH耐受性曲線。

1.3.4 菌株的葡萄汁發(fā)酵實驗

將活化好的菌株以105CFU/mL的接種量接種到100 mL經(jīng)除梗破碎低溫浸漬24h后的葡萄汁（初始糖含量為280.45g/L，pH值為3.31，可滴定酸含量為5.08g/L，蘋果酸含量為1.35 g/L）中，在28 ℃、150 r/min的條件下進行發(fā)酵。每天稱質(zhì)量以測定其CO2質(zhì)量損失，當(dāng)連續(xù)3 d CO2質(zhì)量損失均在0.1 g以下，則發(fā)酵結(jié)束。對發(fā)酵結(jié)束的樣品進行取樣，以8 000 r/min離心2 min后取上清液，測定殘?zhí)橇?、pH值、酒精度、可滴定酸、乙酸、乳酸及蘋果酸含量。

1.3.5 分析檢測

酒精度、可滴定酸含量、pH和揮發(fā)酸含量的測定：參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；殘?zhí)橇康臏y定：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]；CO2質(zhì)量損失的測定：稱重法；根據(jù)CO2質(zhì)量損失計算CO2質(zhì)量損失速率，其計算公式：（后一天CO2質(zhì)量損失-前一天CO2質(zhì)量損失）×50/24；L-乳酸和D-乳酸含量的測定：采用試劑盒法及高效液相色譜法[23]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計；采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，利用Duncan's多重比較在置信區(qū)間0.05下對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析；采用Origin 2018軟件作圖。每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 YPD10液體培養(yǎng)基發(fā)酵實驗

27株酵母菌在YPD10液體培養(yǎng)基發(fā)酵60 h時，發(fā)酵液中乳酸含量及ΔpH見表2。

由表2可知，各菌株在YPD10液體培養(yǎng)基中發(fā)酵60 h時，其發(fā)酵液中均能夠檢測到乳酸，且在大部分的酵母發(fā)酵液中，L-乳酸的生成量大于D-乳酸。其中本土非釀酒酵母菌HU3的乳酸產(chǎn)量最高（7.77 g/L），是商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10（1.68 g/L）的3.63倍。對總?cè)樗崃考唉H進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總?cè)樗崃颗cΔpH顯著相關(guān)（P＜0.05），且相關(guān)系數(shù)R2為0.894，說明乳酸的增加對pH的降低起到顯著作用。最終，在所有菌株中，以總?cè)樗岙a(chǎn)量＞3 g/L、ΔpH＞1為篩選條件，篩選出9株耐熱克魯維酵母（LT1、LT6、LT8、LT10、LT11、LT13、LT15、LT17、LT18）、6株葡萄汁有孢漢遜酵母（HU1、HU2、HU3、HU4、HU6及HU7），共計15株菌。

表2 27株酵母菌株在YPD10液體培養(yǎng)基中發(fā)酵60 h時的乳酸產(chǎn)量及ΔpHTable2 Lactic acid content and ΔpH of 27 yeast strains after fermentation 60 h in YPD10 liquid medium

2.2 Triple M模擬葡萄汁發(fā)酵實驗

15株本土非釀酒酵母及商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10的Triple M模擬汁發(fā)酵液的理化指標(biāo)檢測結(jié)果見表3。

表3 Triple M模擬汁發(fā)酵液理化指標(biāo)的檢測結(jié)果Table3 Determination results of physical and chemical indexes of Triple M simulated juice fermentation broth

酵母菌在發(fā)酵過程中對糖的轉(zhuǎn)化能力可以由發(fā)酵液中的殘?zhí)橇糠从?，發(fā)酵結(jié)束后，若殘?zhí)橇康?，則表明酵母發(fā)酵徹底，對糖的利用能力高，發(fā)酵能力強[24]。由表3可知，15株本土非釀酒酵母的Triple M模擬汁發(fā)酵液中殘?zhí)橇烤?0 g/L，其中，菌株HU1的Triple M模擬汁發(fā)酵液中殘?zhí)橇扛哌_168 g/L，表明非釀酒酵母對糖的利用能力較弱，這也是實際生產(chǎn)中通常將釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵的一個重要原因[25]。

Triple M模擬汁中所測得的乳酸含量均為凈生成量。各試驗菌株的Triple M模擬汁發(fā)酵液中乳酸含量＞1 g/L的菌株有5株，分別是菌株LT1、LT13、HU3、HU4以及HU7，其中菌株HU7生成的乳酸含量最高，達到2.17 g/L。同時，菌株LT13、HU3、HU4及HU7的Triple M模擬汁發(fā)酵液中的蘋果酸含量均＞2 g/L，說明這4株試驗菌株降解蘋果酸能力較弱，能夠優(yōu)先將糖轉(zhuǎn)化為乳酸。而菌株LT1的Triple M模擬汁發(fā)酵液中蘋果酸降解率達到77.33%，說明蘋果酸降解也是其乳酸生成的重要原因。對比可滴定酸含量結(jié)果可知，在上述4株非釀酒酵母中，除了菌株LT13的Triple M模擬汁發(fā)酵液中的可滴定酸含量略有降低外，其他3株非釀酒酵母的Triple M模擬汁發(fā)酵液的可滴定酸均呈現(xiàn)上升趨勢。所有酵母的Triple M模擬汁發(fā)酵液中的揮發(fā)酸含量均低于GB 15037—2006《葡萄酒》中所規(guī)定的要求。

綜合分析，試驗菌株HU7、LT1、LT13、HU3以及HU4的產(chǎn)乳酸能力較強，能在一定程度上降低發(fā)酵液中的pH，同時具有較好的發(fā)酵特性，對其進行耐受性試驗測試。

2.3 菌株耐受性研究

2.3.1 乙醇耐受性

以商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的乙醇耐受性見圖1。

圖1 篩選菌株對乙醇的耐受性Fig.1 Tolerance of screening strains to ethanol

由圖1可知，5株非釀酒酵母的OD600nm值隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時，5株酵母的OD600nm值均＞1.0；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)升至15%時，它們?nèi)阅苌L。其中菌株HU7與HU4在體積分?jǐn)?shù)為6%的乙醇條件下，OD600nm值開始有明顯降低；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，OD600nm值緩慢降低到0.5以下，這表明過高體積分?jǐn)?shù)的乙醇對菌株生長有明顯的抑制作用。菌株LT13在乙醇體積分?jǐn)?shù)升至12%時，OD600nm值才明顯下降。菌株HU3的OD600nm值則隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升呈現(xiàn)持續(xù)下降，表明菌株HU3對于乙醇更加敏感。而菌株LT1的OD600nm值在乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%時才有明顯的下降趨勢，表明其對乙醇的耐受能力較強?？傮w而言，菌株LT1對乙醇的耐受能力最強，而菌株LT13的耐受能力與商業(yè)對照菌株CT10相似。

2.3.2 SO2耐受性

葡萄酒生產(chǎn)過程中，加入適量SO2能起到殺菌，抑制葡萄汁中有害微生物，抗氧化及護色等作用[24]。以商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的SO2耐受性見圖2。由圖2可知，在未加入SO2的培養(yǎng)基中，各菌株的OD600nm值均＞1.0，加入質(zhì)量濃度為60 mg/L的SO2后，各菌株的OD600nm值迅速降低至1.0以下，但其在含質(zhì)量濃度為60～360 mg/L的SO2的YPD培養(yǎng)基中均能生長，且與商業(yè)對照菌株CT10對SO2的耐受性相似。其中，菌株LT1的耐受性最好。這說明5株非釀酒酵母能夠耐受正常葡萄酒生產(chǎn)過程中的SO2濃度（60 mg/L）。

圖2 篩選菌株對SO2的耐受性Fig.2 Tolerance of screening strains to SO2

2.3.3 糖耐受性

在葡萄酒生產(chǎn)過程中，糖是酵母生活的能源物質(zhì)，但是高濃度的糖會抑制酵母的生長，造成葡萄糖代謝阻遏，并且高滲透壓會引起酵母細(xì)胞水分的流失，使其活性降低[26]。以商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的糖耐受性見圖3。由圖3可知，5株非釀酒酵母的OD600nm值均隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高而降低。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為400 g/L時，菌株LT1、LT13及CT10的OD600nm值仍維持在1.0以上，這說明菌株對于糖環(huán)境的適應(yīng)性較好，耐受性強。其中菌株LT1的糖耐受性最好，菌株LT13的糖耐受性與商業(yè)對照酵母CT10相似。

圖3 篩選菌株對糖的耐受性Fig.3 Tolerance of screening strains to sugar

2.3.4 pH值耐受性

高酸可以抑制敗壞酵母的生長，防止葡萄酒的污染，但過低的pH同樣會影響酵母生長，通常葡萄酒發(fā)酵中的pH值在3.2左右[2]。以商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的pH耐受性見圖4。由圖4可知，隨著pH值的降低，菌株LT13、HU7、HU4及CT10的OD600nm值緩慢降低，表明其在pH為3.8的環(huán)境中生長最好。而菌株HU3和LT1在pH為3.6時OD600nm值達到最高（分別為1.81和1.18），表明其最適pH為3.6。與商業(yè)對照酵母CT10相比，菌株HU3和LT1對不同pH環(huán)境下的耐受性更好，其中HU3的pH耐受性最好。

圖4 篩選菌株的pH耐受性Fig.4 Tolerance of screening strains to pH value

2.4 菌株發(fā)酵葡萄汁性能測定結(jié)果

以商業(yè)耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株發(fā)酵葡萄汁過程中，CO2質(zhì)量損失速率見圖5。由圖5可知，6株試驗菌株在葡萄汁的發(fā)酵中有一定的延滯期，這可能是由于葡萄汁中的環(huán)境因素較為復(fù)雜。其中菌株LT1在發(fā)酵時間為48 h進入發(fā)酵旺盛期；菌株LT13和菌株HU4在發(fā)酵時間為72 h進入發(fā)酵旺盛期；菌株HU7和菌株CT10在發(fā)酵時間為96 h進入發(fā)酵旺盛期；菌株HU3在144 h進入發(fā)酵旺盛期。其中菌株LT1及HU4的CO2質(zhì)量損失速率最高，均＞0.8 g/（L·h）。

圖5 發(fā)酵過程中葡萄汁的CO2質(zhì)量損失速率曲線Fig.5 CO2 weight loss rate curve of grape juice during fermentation

發(fā)酵結(jié)束后，各酒樣的理化指標(biāo)見表4。由表4可知，發(fā)酵后酒樣中殘?zhí)橇糠秶?5.27～89.55 g/L之間，均未能發(fā)酵完全。其酒精度均＞11%vol，結(jié)合耐受性結(jié)果，大約12%vol的酒精度已經(jīng)對菌株有較為明顯的抑制作用，這可能是菌株未能將糖消耗完的一個重要原因。試驗菌株HU3、HU4、HU7及LT1發(fā)酵葡萄汁酒樣中乳酸的產(chǎn)量顯著高于對照菌株CT10酒樣，說明這4株酵母菌在葡萄汁中依然具有穩(wěn)定的產(chǎn)乳酸能力，其中菌株HU7酒樣的可滴定酸含量高于其他實驗組，增酸效果較好。所有酵母菌發(fā)酵的酒樣中揮發(fā)酸含量均低于GB 15037—2006《葡萄酒》中的要求。綜上分析，菌株LT1及HU4在葡萄汁中產(chǎn)乳酸能力較好，能耐受較差的脅迫環(huán)境，有較強的發(fā)酵特性，具備釀造增酸葡萄酒的潛力。

表4 菌株發(fā)酵葡萄汁樣品理化指標(biāo)的檢測結(jié)果Table4 Determination results of physical and chemical indexes of grape juice fermented by strains

3 結(jié)論

本實驗通過對25株本土非釀酒酵母在YPD10及模擬汁中發(fā)酵性能的研究，初步選出產(chǎn)酸量較高的菌株LT1、LT13、HU3、HU4以及HU7，對其進行耐受性測試及葡萄汁發(fā)酵實驗。結(jié)果表明，非釀酒酵母LT1及HU4的產(chǎn)酸性能良好，對乙醇、SO2、糖和pH綜合耐受性較好，其中菌株LT1能耐受體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇、400 g/L的糖及2.75的低pH脅迫，菌株HU4能耐受體積分?jǐn)?shù)6%的乙醇、250 g/L的糖及2.75的低pH脅迫。菌株LT1和HU4在葡萄汁中啟酵時間較短，發(fā)酵旺盛期CO2質(zhì)量損失速率均＞0.8 g/（L·h）。菌株LT1和HU4乳酸產(chǎn)量分別為0.93 g/L、1.14 g/L，乙酸產(chǎn)量分別為0.38 g/L、0.42 g/L，具備釀造增酸葡萄酒的潛力。