納豆菌對液態(tài)糙米醋品質的影響

董紅兵，蔡 凱，黃 程，龔元元，祁勇剛，汪 超，張亮子*

（1.武漢商學院 食品科技學院，湖北 武漢 430056；2.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068；3.武漢一元堂生物科技股份有限公司，湖北 武漢 430223）

糙米是稻谷脫殼后不加工而獲得的全谷米粒，與精米相比，其蛋白質、脂肪、總膳食纖維含量高，其中膳食纖維是精米的6倍多，主要存在于糙米表皮層中，糙米也因含有較高的膳食纖維，蒸煮食用起來口感差，發(fā)芽處理后，糙米會有顯著變化[1-2]。吳曉娟等[3]研究發(fā)現(xiàn)，糙米發(fā)芽后淀粉顯著下降，纖維素和γ-氨基丁酸顯著提高；袁周率等[4]通過酵母發(fā)酵糙米漿制備酵素，發(fā)現(xiàn)維生素B1、維生素B2和γ-氨基丁酸顯著提升；陳海旭[5]采用篩選的6株益生菌發(fā)酵糙米漿，制備的發(fā)酵飲料具有濃郁發(fā)酵香味，酸度適中、風味獨特，乳酸含量為45 nmol/L；趙志浩等[6]先將粉碎的糙米通過高溫α-淀粉酶酶解0.5 h，而后采用邊攪拌邊噴淋的方式調節(jié)水分為22%，擠壓膨化，制備預酶解-擠壓膨化糙米粉，提高了水溶性和消化率。糙米中的多酚主要是阿魏酸和香豆酸，TIAN S等[7]研究發(fā)現(xiàn)，糙米發(fā)芽后游離阿魏酸、香豆酸顯著增大；OHTSUBO K等[8]研究了糙米發(fā)芽72 h后阿魏酸含量從34 mg/100 g增至43 mg/100 g；JIRAPORN B等[9]研究發(fā)現(xiàn)，三種糙米發(fā)芽48 h總酚分別提高1.12、1.37和1.43倍；MOONGNGARM A等[10]研究發(fā)現(xiàn)，稻米發(fā)芽4 d后，總酚由62 mg/100 g增至102 mg/100 g。

液態(tài)發(fā)酵食醋具有原料利用率高、生產周期短、自動化程度高、色澤淺、產品質量穩(wěn)定等優(yōu)點，但因其原料單一，純菌種發(fā)酵，發(fā)酵周期短，食醋總酸含量高，不揮發(fā)酸、氨基酸、可溶性無鹽固形物含量低，酸味刺激性強，適合淺色食品調味。譚海剛等[11]針對液態(tài)食醋顏色淺，沉淀對其影響更明顯的難題，通過分析沉淀組分，采用酸性蛋白酶和糖化酶處理可明顯減少沉淀量，提高其穩(wěn)定性，米醋透光率增加39.08%；鄧永建等[12]通過添加麩皮培養(yǎng)的不同乳酸菌發(fā)酵液，與醋酸菌混合發(fā)酵制備液態(tài)米醋，檢測出乳酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸4種不揮發(fā)性酸，檢測81種揮發(fā)性成分，降低了刺激性酸味，增強了米醋香氣；蔣忠等[13]采用乳酸菌和酵母菌共酵，使液態(tài)米醋不揮發(fā)性酸和酯類含量分別提升了10.25倍和1.62倍；胡凱弟等[14]研究了以篩選的優(yōu)良巴氏醋桿菌為菌種優(yōu)化發(fā)酵條件制備了液態(tài)麩醋，其口感柔和、香味獨特，游離氨基酸含量為805.29 mg/100 mL，各項指標優(yōu)于其他液態(tài)發(fā)酵食醋。

芽孢桿菌是食醋發(fā)酵過程中的核心菌群，可代謝蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶，對食醋風味和香氣有重要的貢獻[15-16]。王宗敏等[17]從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選一株環(huán)狀芽孢桿菌，其可耐6%vol的乙醇，在pH＞4時菌體生長正常，并能促進有機酸、氨基酸和揮發(fā)性成分的產生；劉軍等[18]從四川曬醋醋醅中篩選一株產纖維酶的蘇云金芽孢桿菌，纖維素酶活為161.33 U/g；原海兵等[19]將麩醋醋醅中分離的芽孢桿菌進行優(yōu)化培養(yǎng)，提高了以豆粕、麩皮為主要成分的培養(yǎng)基的總酚含量為229.8 μg/mL。

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是一種酚酸，常存在于植物細胞壁中，具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抑菌消炎、預防癌癥和抗突變等多種作用[20-21]。FAULDS C等[22]選用木聚糖酶和阿魏酸酯酶協(xié)同酶解小麥麩皮，發(fā)現(xiàn)可以有效打破細胞壁多糖結構，顯著提高阿魏酸的提取效率。前期試驗在納豆的發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)納豆菌還具有代謝產生阿魏酸的酶系，因此將其用于糙米醋中，研究其對液態(tài)發(fā)酵糙米醋的影響，以期提升糙米醋品質，為工業(yè)化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米：湖北鳳池實業(yè)有限公司；乙酸（食品級）、耐高溫α-淀粉酶（4 000 U/g）、糖化酶（10萬U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

酵母膏、葡萄糖、氯化鈉、蛋白胨、無水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

納豆菌（Bacillusnatto）WBUSPN01：本試驗室保藏菌種。

液體培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母膏、10 g/L NaCl。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

MSF-S-50L自動型機械攪拌罐：南京匯科生物工程設備有限公司；LHS-250SC型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；大型SLY-2112B型立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市盛藍儀器制造有限公司；YM系列A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；PC-420磁力恒溫攪拌器：美國Corning公司；QDWZⅠ3000-7D濕法粉碎機：無錫輕大食品有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺：廣州瑞智科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糙米醋工藝流程及操作要點

操作要點：

取1 kg糙米，加4 kg水，常壓蒸煮25 min，90～95 ℃保溫，加入0.5 g耐高溫α-淀粉酶保溫15 min后降溫至65 ℃，加入2.0 g糖化酶，62～65 ℃保溫4 h，制備米酒醪。將制備米酒醪通過添加無菌水調整至一定酒精度，而后通過添加乙酸調整至一定總酸。

糙米粉碎至通過100目篩，按質量比1∶9添加水，攪拌均勻，121 ℃滅菌20 min，接種納豆菌，120 r/min、35 ℃搖床培養(yǎng)28 h，制備納豆菌種子液。

調整后的米酒醪，搖勻，取100 mL置于三角瓶中，控溫，接種醋酸菌種子液9.0%（V/V）和納豆菌種子液，在轉速100 r/min、一定溫度條件下發(fā)酵至總酸不再升高，過濾，得到糙米醋。

1.3.2 糙米醋醋酸發(fā)酵工藝單因素試驗

納豆菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響：納豆菌接種量分別設置為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，初始乙酸含量0.8%、初始酒精度6.0%vol、發(fā)酵溫度32 ℃，取醋酸發(fā)酵結束時醋汁，測定醋汁阿魏酸和總酸含量，試驗做3組平行。

初始乙酸含量對醋酸發(fā)酵的影響：初始乙酸含量分別設置為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，納豆菌接種量1.0%、初始酒精度6.0%vol、發(fā)酵溫度32 ℃，取醋酸發(fā)酵結束時醋汁，測定醋汁阿魏酸和總酸含量，試驗做3組平行。

初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響：初始酒精度分別設置為5.0%vol、5.5%vol、6.0%vol、6.5%vol、7.0%vol、7.5%vol、8.0%vol，納豆菌接種量1.0%、初始乙酸含量0.8%、發(fā)酵溫度32 ℃，取醋酸發(fā)酵結束時醋汁，測定醋汁阿魏酸和總酸含量，試驗做3組平行。

發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響：發(fā)酵溫度分別設置為28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃，納豆菌接種量1.0%、初始乙酸含量0.8%、初始酒精度6.0%vol，取醋酸發(fā)酵結束時醋汁，測定醋汁阿魏酸和總酸含量，試驗做3組平行。

1.3.3 糙米醋醋酸發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗設計

為了研究納豆菌接種量、初始乙酸含量、初始酒精度、發(fā)酵溫度對糙米醋品質的影響，在單因素試驗的基礎上，用L9（34）正交試驗設計試驗，以阿魏酸和總酸含量為評價指標確定最優(yōu)條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 糙米醋醋酸發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic acid fermentation process optimization of brown rice vinegar

1.3.4 測定方法

阿魏酸的測定：參照文獻[23]中阿魏酸的測定方法，并做適當優(yōu)化。取醋汁，過濾后，5 000 r/min離心，取上清液10 mL，加入6 mL乙酸乙酯萃取，重復3次，取乙酸乙酯層，合并萃取液，旋轉蒸干，得到阿魏酸粗品。用4 mL無水乙醇溶解，于波長286 nm處測定其吸光度值，樣品做3個平行試驗。

總酸、不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮、可溶性無鹽固形物的測定：參考GB 18187—2000《釀造食醋》中規(guī)定的方法測定。

2 結果與分析

2.1 糙米醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結果與分析

2.1.1 納豆菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響

相對于傳統(tǒng)固態(tài)食醋，液態(tài)發(fā)酵食醋因其良好的物質和能量交換性能，微生物增殖和代謝更為快捷、原料轉化率更高，也因此多菌種發(fā)酵時更易相互影響。在傳統(tǒng)固態(tài)食醋醋酸發(fā)酵過程中為醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等多種微生物共存，在液態(tài)食醋中也能協(xié)同發(fā)酵。由圖1可知，隨著納豆菌接種量的增大，阿魏酸含量顯著增大，接種量為2.0%時，阿魏酸含量可達8.46 mg/L，而后穩(wěn)定。接種納豆菌對醋汁總酸有一定的影響，當接種量＞2.5%之后，總酸開始顯著下降，可能是納豆菌接種量大消耗了過多的碳源，或競爭性抑制醋酸菌的增殖和代謝。因此，選擇納豆菌接種量為2.0%較適宜。

圖1 納豆菌接種量對糙米醋阿魏酸和總酸含量的影響Fig.1 Effect of Bacillus natto inoculum on ferulic acid and total acid contents of brown rice vinegar

2.1.2 初始乙酸含量對醋酸發(fā)酵的影響

前期試驗表明，液態(tài)食醋發(fā)酵起始時，如果乙酸含量為0或很低，盡管初始乙醇充足，總酸僅能達到3.0 g/100 mL，這與KRUSONG W等[24-25]的研究一致，因此糙米醋醋酸發(fā)酵起始，須添加一定量乙酸，但乙酸的添加可能會對納豆菌有抑制作用。

從圖2可以看出，隨著初始乙酸含量的增大，阿魏酸從6.3 mg/L開始有緩慢減小的趨勢，當初始乙酸含量＞1.0%時，阿魏酸開始顯著減小；而醋汁總酸在初始乙酸含量＜0.6%時維持在3.0 g/100 mL，而后顯著增大至6.26 g/100 mL，而后又開始減小，醋酸發(fā)酵起始階段添加低濃度的醋酸可以誘導乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的表達，提高菌體發(fā)酵效率及醋酸耐受性。初始乙酸含量過高可能會抑制納豆菌增殖與代謝，進而影響阿魏酸代謝生成。因此，初始乙酸含量為1.0%時較合適。

圖2 初始乙酸含量對糙米醋阿魏酸和總酸含量的影響Fig.2 Effect of initial acetic acid contents on ferulic acid and total acid contents of brown rice vinegar

2.1.3 初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響

醋酸發(fā)酵起始時，酒精度過高會抑制醋酸菌增殖與代謝，甚至導致總酸不會升高[26]，同樣也會抑制納豆菌。

由圖3可知，初始酒精度由5.0%vol增大至7.0%vol，醋汁中阿魏酸穩(wěn)定在6.2 mg/L，初始酒精度＞7.5%vol時阿魏酸含量顯著下降，而總酸隨著初始酒精度增至7.0%vol時提升至7.03 g/100 mL，高于7.5%vol時的0.8 g/100 mL，說明醋酸菌增殖受抑制，代謝終止，可能過高的乙醇濃度導致菌體細胞破裂。因此，初始酒精度應為7.0%vol。

圖3 初始酒精度對糙米醋阿魏酸和總酸含量的影響Fig.3 Effect of initial alcohol contents on ferulic acid and total acid contents of brown rice vinegar

2.1.4 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響

醋酸菌和納豆菌均為溫度適宜范圍廣的微生物，適宜的溫度會促進其增殖與代謝活動，進而提高原料利用率。液態(tài)食醋醋酸發(fā)酵的最佳溫度為30 ℃，而納豆菌發(fā)酵納豆的最佳溫度為37 ℃，當兩種菌混合發(fā)酵時可能會相互影響，從圖4可知，阿魏酸與總酸變化趨勢一致，先增大后減小，阿魏酸和總酸在發(fā)酵溫度為32 ℃時分別高達6.24 mg/L和6.25 g/100 mL，但在32～34 ℃時二者含量差異不顯著。因此，醋酸發(fā)酵溫度為32 ℃較適宜。

圖4 發(fā)酵溫度對糙米醋阿魏酸和總酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on ferulic acid and total acid contents of brown rice vinegar

2.2 糙米醋醋酸發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗結果與分析

選取納豆菌接種量、初始乙酸含量、初始酒精度和發(fā)酵溫度4個因素進行正交試驗設計，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

由表2的正交試驗結果與分析可知，影響糙米醋汁阿魏酸含量的主次因素為：納豆菌接種量＞初始乙酸含量＞發(fā)酵溫度＞初始酒精度，其最佳條件為A3B1C2D2；影響其總酸含量的主次因素為：初始乙酸含量＞初始酒精度＞納豆菌接種量＞發(fā)酵溫度，其最佳條件為A2B3C3D2。由表3的方差分析可知，納豆菌接種量對阿魏酸含量有極顯著的影響（P＜0.01），初始乙酸含量、發(fā)酵溫度對其有顯著的影響（P＜0.05），初始酒精度影響不顯著（P＞0.05）；初始乙酸含量對總酸含量有極顯著的影響（P＜0.01），而初始酒精度、納豆菌接種量對其有顯著的影響（P＜0.05），發(fā)酵溫度影響不顯著（P＞0.05）。對于多個考核指標采用綜合平衡法確定優(yōu)方案，雖然納豆菌接種量對阿魏酸含量影響非常顯著，但是接種量2.0%和2.5%時阿魏酸含量差異小，因此從節(jié)約資源的角度選A2；初始乙酸含量對總酸含量影響非常顯著，因此選B3，同理選C3，最后得出優(yōu)方案為A2B3C3D2。將優(yōu)方案與試驗組A2B2C3D1進行驗證，結果表明，二者醋汁阿魏酸含量分別為6.22mg/L和6.54mg/L，總酸含量分別為7.11g/100mL和7.29 g/100 mL，驗證試驗證明優(yōu)方案效果更好，即納豆菌接種量2.0%、初始乙酸含量1.0%、初始酒精度7.0%vol、發(fā)酵溫度32 ℃。

表2 糙米醋醋酸發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗設計結果與分析Table2 Results and analysis of orthogonal experiments design for acetic acid fermentation process optimization of brown rice vinegar

表3 正交試驗結果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.3 糙米醋質量評價

以糙米為原料，采用優(yōu)化的液態(tài)發(fā)酵工藝釀造糙米醋，醋酸發(fā)酵調整初始乙酸含量為1.0%、初始酒精度為7.0%vol，醋酸菌接種量9.0%、納豆菌接種量2.0%、發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵結束、過濾，釀造糙米醋。糙米醋，暗黃色、澄清、酸味柔和，總酸為7.26g/100 mL、阿魏酸含量為6.57 mg/L，試驗制備的糙米醋與不添加納豆菌釀造的糙米醋相比，理化指標見表4，總酸差異不顯著，氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸和可溶性無鹽固形物的含量分別是對照組的4.18倍、2.95倍和2倍，新增了阿魏酸成分。接種納豆菌，與醋酸菌混合發(fā)酵，提高了以糙米為原料的液態(tài)醋整體品質，特別是新增了功效成分阿魏酸，提升了糙米醋的功能性。

表4 糙米醋與不添加納豆菌釀造的糙米醋理化指標對比Table4 Comparison of physical and chemical indexes between brown rice vinegar and brown rice vinegar brewed without Bacillus natto

3 結論

通過單因素和正交試驗設計優(yōu)化，得到醋酸發(fā)酵適宜工藝條件為：納豆菌接種量2.0%、初始乙酸含量1.0%、初始酒精度7.0%、發(fā)酵溫度32 ℃。按照優(yōu)化后的工藝條件制備的糙米醋，暗黃色、澄清、酸味柔和，總酸高達7.26 g/100 mL、阿魏酸為6.57 mg/L，試驗制備的糙米醋與不添加納豆菌釀造的糙米醋相比，氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸和可溶性無鹽固形物的含量分別提高了4.18倍、2.95倍和2倍?？芍{豆菌代謝產生的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶等多種酶系，酶解了糙米營養(yǎng)成分，與醋酸菌混合發(fā)酵，提高了糙米醋整體品質，特別是新增了功效物質阿魏酸，提升了糙米醋的功能性。