高通量測序技術(shù)及其在黃酒微生物多樣性研究中的應(yīng)用

杜貞娜，程 斐，單之初，郭懷宇，孫劍秋 ，臧 威

（1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000；2.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312032）

黃酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵酒精飲料[1-2]，酒精含量（4%vol～20%vol）較低，其富含營養(yǎng)物質(zhì)，具有獨特風(fēng)味，被譽為“液體蛋糕”[3-4]。我國黃酒的種類豐富，產(chǎn)品以江浙滬為中心，遍布全國[4-5]。各地黃酒以糯米、黍米、玉米、黑米等富含淀粉的谷物作為主要原料，以酒母、麥曲和酒藥等作為糖化發(fā)酵劑釀造而成[6]，釀造過程包括浸米、蒸飯、攤冷、落缸、發(fā)酵、壓榨、煎酒和貯存等諸多環(huán)節(jié)[7]。黃酒的釀造過程中，主要源于糖化發(fā)酵劑的釀酒微生物產(chǎn)生各種復(fù)雜的分解酶系，通過一系列的生物化學(xué)反應(yīng)過程將原料中淀粉等大分子物質(zhì)降解和轉(zhuǎn)化為乙醇和糖類、酯類、有機酸類、氨基酸類及其各種醇類物質(zhì)等。黃酒釀造過程與其他傳統(tǒng)釀造食品一樣都屬于開放式發(fā)酵，環(huán)境中的微生物也參與發(fā)酵過程，與主要釀造微生物共同影響黃酒風(fēng)味物質(zhì)的形成[8-9]。因此，研究黃酒中的微生物多樣性對控制黃酒釀造工藝、提升黃酒品質(zhì)具有重要意義。

黃酒中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究最早采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，基于菌株的生理生化特性與某種基因序列對釀酒微生物進(jìn)行分類和鑒定，研究結(jié)果具有一定的局限性，LV X C等[10]對紅曲酒中酵母菌的研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能檢測到所有的酵母菌株。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，逐漸建立起來的變性凝膠梯度電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)[11-12]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）[13]等分子生物學(xué)方法，使人們更深入了解參與黃酒釀造過程中的微生物種類，這對黃酒釀造微生物研究發(fā)揮了積極作用，但是在分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成時，以上技術(shù)也表現(xiàn)出準(zhǔn)確率低、實驗條件要求高等缺點。目前，廣泛使用的第二代測序技術(shù)（second generation sequencing，SGS），又稱下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）或深度測序（deep sequencing，DS）[14-15]，及第三代測序技術(shù)（third generation sequencing，TGS）能夠克服上述分子生物學(xué)技術(shù)的缺點，因其具有測序時間短、高通量、成本低、定量準(zhǔn)等優(yōu)點，日益發(fā)展成熟，廣泛運用于黃酒釀造微生物的研究[16-19]。本文綜述了高通量測序技術(shù)的發(fā)展階段，詳細(xì)介紹了該技術(shù)的原理、方法、操作流程及數(shù)據(jù)分析方法，以及高通量測序技術(shù)在黃酒微生物多樣性的研究中的應(yīng)用，并對黃酒微生物多樣性的研究方向進(jìn)行了展望，為全面認(rèn)識黃酒微生物多樣性及相關(guān)機理，進(jìn)一步深入開展黃酒微生物的深入研究提供參考依據(jù)。

1 高通量測序技術(shù)簡介

1.1 高通量測序技術(shù)的發(fā)展階段

早在20世紀(jì)70年代，美國生物化學(xué)家SANGER F發(fā)明的雙脫氧法測序技術(shù)（Sanger測序）是第一代測序技術(shù)，在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶合成DNA鏈的過程中加入雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP），得到一系列不同長短的DNA片段[20]，這成為當(dāng)時DNA測序的主流技術(shù)。但是，Sanger測序法存在速度較慢、通量較低、成本較高等不足，已經(jīng)不能滿足大規(guī)模測序所需的測序深度和測序效率等的要求[21]。

以高通量為特點的第二代測序技術(shù)是測序技術(shù)發(fā)展歷程的一個重要里程碑，可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生數(shù)以千計甚至百萬計的序列，這些序列有助于識別樣本中難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物，可以直接對微生物類群進(jìn)行全貌的分析，為研究各種微生物和發(fā)現(xiàn)一些稀有甚至未知的物種提供了新的研究手段[18，22]，目前，下一代測序技術(shù)主要包括羅氏（Roche）公司的454焦磷酸測序平臺，Illumina公司的Solexa測序技術(shù)、ABI公司的SOLiD測序技術(shù)和Life Techologies公司的Ion Torrent測序技術(shù)。

大部分第二代測序技術(shù)也存在局限性，如無法準(zhǔn)確全面的測序、依賴于PCR擴增、測序讀長較短及其易變異等，無法實現(xiàn)全基因組覆蓋。為了更加準(zhǔn)確與高效解讀DNA序列信息，第三代測序技術(shù)已經(jīng)建立，目前有HelicosBiosciences公司的真單分子測序（true single-molecule sequencing，tSMS）技術(shù)、Pacfic Biosciences公司的單分子實時（single molecule real-time，SMRT）測序技術(shù)、Oxford Nanopore公司的納米孔單分子測序技術(shù)（Oxford nanopore technologies，ONT）以及VisiGen Biotechnologies公司研發(fā)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）測序技術(shù)。

1.2 高通量測序技術(shù)原理及特點

（1）第二代測序技術(shù)

由于傳統(tǒng)的測序技術(shù)已經(jīng)不能完全滿足各種生境內(nèi)微生物多樣性研究的需要，第二代測序技術(shù)應(yīng)運而生，由于具有測序結(jié)果的通量高、可定量、平行測序等優(yōu)點而被廣泛運用于各領(lǐng)域研究中。2005年，羅氏公司（Roche）公司首先推出劃時代的新型高通量454焦磷酸測序技術(shù)，該技術(shù)采用焦磷酸合成測序法[23]，利用乳膠系統(tǒng)對DNA分子進(jìn)行擴增，實現(xiàn)了大規(guī)模測序，測序特點為速度快、通量高以及讀長長等，可避免傳統(tǒng)測序需要進(jìn)行的熒光標(biāo)記以及跑膠等繁瑣步驟，但在2013年停止了454測序儀的使用。

隨后Illumina公司推出Solexa測序技術(shù)[21，24]，其原理為基于高密度的單分子陣列序列分析，核心技術(shù)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和可逆性終止化學(xué)反應(yīng)，實現(xiàn)了邊合成邊測序。Solexa測序的步驟是：第一步將基因組DNA處理成100～200 bp片段，在兩端接上特定的DNA接頭后進(jìn)行擴增，獲得單鏈DNA文庫；第二步將帶接頭的待測DNA片段加入芯片上與其表面的堿基產(chǎn)生互補雜交連接到芯片表面，這些小段的DNA分子經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在flow cell上形成了具有數(shù)以億計單分子簇（Clusters），第三步加入帶熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）進(jìn)行邊合成邊測序，由于這些dNTP的3'末端被一個疊氮基堵住，所以每次反應(yīng)只能添加一個dNTP，最后記錄熒光信號并進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)化為測序堿基信息?，F(xiàn)在Illumina公司主要測序平臺有Hiseq、MiSeq、NovaSeq 6000等，其優(yōu)勢主要在于測序數(shù)據(jù)精準(zhǔn)度最高可達(dá)99.9%，確保了高精確度和真實的單堿基連續(xù)測序，而且與其他二代測序平臺相比，測序成本也較低和運用領(lǐng)域多，但是序列讀長較短。

在以上兩種測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，ABI公司在2007年推出基于酶連接法的新一代高通量SOLiD測序技術(shù)[25-26]，基本測序步驟是：第一步是獲得目標(biāo)DNA小片段，兩端加上接頭，構(gòu)建DNA文庫；第二步是乳液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）/微珠富集，與454焦磷酸測序類似，但是測序微珠只有1 μm；第三步為加入連接酶進(jìn)行測序；第四步是數(shù)據(jù)分析，得到SOLiD原始序列。創(chuàng)新之處在于應(yīng)用雙堿基編碼的方式獲取DNA序列信息，將每個堿基閱讀兩次，大大降低了測序帶來的錯誤率，提供了內(nèi)在的校正功能。

2010年，Life Techologies公司利用半導(dǎo)體芯片技術(shù)成功設(shè)計出基于Ion Torrent的測序技術(shù)[27]，基于半導(dǎo)體的微pH計實現(xiàn)了快速地高通量測序。在這項測序技術(shù)中，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，按順序加入4種非修飾核苷酸中的一個，依據(jù)堿基互補配對原則合成互補DNA鏈，DNA鏈每延伸一個堿基，就會釋放一個質(zhì)子（H+）而導(dǎo)致pH值改變，通過傳感器檢測，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)學(xué)信號，最終獲得DNA序列信息?；静襟E：首先構(gòu)建基因文庫，在樣品DNA兩端加上標(biāo)準(zhǔn)接頭；然后進(jìn)行油包水PCR，也叫乳濁液PCR，把文庫種到測序珠子上去并進(jìn)行擴增；最后將上一步洗脫下來的珠子上機測序，通過測量并記錄pH值變化而測出DNA序列。該測序平臺的主要優(yōu)勢，就是可以從很少量的起始DNA進(jìn)行測序，測序速度快。

（2）第三代測序技術(shù)

第三代測序是以單分子測序技術(shù)為基礎(chǔ)，不依賴于PCR擴增，具有超長讀長和運行快等特點，主要用于突變鑒定（single nucleotide polymorphisms，SNP）檢測、基因組測序、甲基化研究等方面[28]。

tSMS平臺是由Helicos Biosciences公司推出的第一個商業(yè)化的單分子測序平臺，其基于光學(xué)信號的邊合成邊測序技術(shù)[29-30]。測序時首先進(jìn)行樣品DNA處理，然后在3'末端加上polyA和使用Cy5熒光染料標(biāo)，同時在末端進(jìn)行阻斷；其次與玻璃芯片上的DNA模板polyT進(jìn)行雜交并精確定位，之后加入被標(biāo)記的堿基和DNA聚合酶的混合液，堿基自然延長；最后使用電荷耦合器件（coupled-charge device，CCD）攝像機在光學(xué)信號下讀取雜交模板信息。當(dāng)標(biāo)記解除后，加入新的標(biāo)記的堿基和DNA聚合酶使反應(yīng)繼續(xù)循環(huán)下去，從而確定堿基序列。由于采用Cy5熒光基團具有很好的光穩(wěn)定性、高熒光效率和靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)等，可以讀取單個分子，在很大程度上提高了序列分析的精準(zhǔn)度，但是這種測序技術(shù)也存在測序讀長短、輸出數(shù)據(jù)低、錯誤率高等不足。

Pacific Biosciences公司推出SMRT測序技術(shù)，是基于熒光標(biāo)記的邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為載體進(jìn)行測序反應(yīng)[31-32]，核心技術(shù)是零模波導(dǎo)孔（zero-mode waveguides，ZMWs）技術(shù)，ZMWs是一種直徑為100 nm、厚度為70 nm的微小納米孔，此空間正好可容納一個DNA聚合酶分子，從而使得在此位置可觀察到合成DNA鏈過程。測序時將樣品DNA處理成小片段，以4種不同熒光標(biāo)記的dNTP作為原料進(jìn)行合成時，所連接的dNTP會因為反應(yīng)而在ZMW納米孔底部短暫停留，在熒光收集設(shè)備則可以收集到配對dNTP的熒光信號，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類，從而實現(xiàn)測序。

納米孔單分子測序技術(shù)（ONT）采用“邊解鏈邊測序”的方法，其中核酸外切酶與α-溶血素納米孔相耦合是該測序平臺的核心，控制堿基穿過納米孔的速度是技術(shù)的關(guān)鍵；主要原理是將蛋白納米孔嵌入合成膜，浸在離子溶液中，膜的兩側(cè)施加恒定的電勢，使離子電流通過納米孔，由于不同堿基的帶電性質(zhì)不同，通過檢測電流信號來確定堿基序列[33-34]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）測序技術(shù)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理對樣本基因組進(jìn)行測序[35]，基本步驟是先將被供體熒光基團標(biāo)記的DNA聚合酶和DNA模板分子固定，摻入四種不同的熒光受體所標(biāo)記的dNTP，根據(jù)堿基發(fā)出的熒光信號來判斷dNTP的類別以確定基因組信息。這項測序技術(shù)是利用電信號測序，處理樣品較簡單、成本較低等；可是由于DNA通過納米孔的速度很快，容易導(dǎo)致電流變化不明顯，從而降低了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3 高通量測序技術(shù)的操作流程

高通量測序技術(shù)的主要操作流程，一般包括樣品準(zhǔn)備、總DNA的提取、構(gòu)建文庫、上機測序、原始數(shù)據(jù)預(yù)處理與質(zhì)控、操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析、數(shù)據(jù)分析等步驟，高通量測序技術(shù)的基本操作流程見圖1。

圖1 高通量測序技術(shù)的基本操作流程Fig.1 Basic operation flow of high-throughput sequencing technology

1.4 高通量測序技術(shù)常用的數(shù)據(jù)分析方法

高通量測序產(chǎn)出的是原始reads數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)一般需要使用USEARCH或QIIME進(jìn)行雙端合并、去標(biāo)簽和引物、拼接質(zhì)控操作，獲取樣品的代表序列信息，運用Vsearch進(jìn)行聚類獲得OTUs或運用DADA2去噪獲得擴增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASVs）之后再進(jìn)行統(tǒng)計分析。然后，可以通過量化每個樣本中特征序列的頻率來獲得特征表，即OTU或ASV表。接著，對特征序列進(jìn)行分類，通常在界、門、綱、目、科、屬和種的層級上進(jìn)行分類，從而為微生物群提供了更多級別的降維視角，其中OTUs和ASVs的獲取主要通過與已經(jīng)建立的基因數(shù)據(jù)庫比對以獲得分類學(xué)注釋。目前，常用的基因數(shù)據(jù)庫有Greengenes[36]、SILVA[37]、UNITE[38]和GenBank[39]等。在多樣性分析中，普遍采用QIIME、Mothur等軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，主要包括相關(guān)性分析、聚類分析、物種種類、差異性分析和排序分析等。

2 高通量測序技術(shù)在黃酒微生物多樣性研究中的應(yīng)用

2.1 糖化發(fā)酵劑對黃酒微生物多樣性的影響

在黃酒釀造過程中，酒曲內(nèi)的微生物主要發(fā)揮糖化功能，利用釀酒原料中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖和代謝，將淀粉分解為葡萄糖及其他碳水化合物，供酵母菌發(fā)酵利用而產(chǎn)生酒精，并為黃酒的釀造提供各種酶類、有機酸、多肽類、氨基酸等物質(zhì)，影響黃酒獨特的色、香、味特征[40]，對黃酒品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[41-42]。

2.1.1 酒藥

酒藥以秈米粉和辣蓼草等作為主要原料，接種陳藥后在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)而獲得的黃酒釀造用糖化發(fā)酵劑，在黃酒釀造過程中起到重要作用[43-44]。臧威等[43]基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對紹興黃酒酒藥中酵母菌的物種資源進(jìn)行研究，扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）占有絕對的分布優(yōu)勢，表明扣囊復(fù)膜孢酵母對紹興黃酒酒藥的生產(chǎn)性能來說至關(guān)重要。CHEN C等[9]利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)揭示了酒藥微生物的多樣性對紹興酒發(fā)酵過程中發(fā)酵特性與揮發(fā)性成分的影響，結(jié)果表明，酒藥中主要的微生物群落為片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏屬（Weissella）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和根霉屬（Rhizopus），糖化力與片球菌屬、酵母屬和根霉屬的存在呈顯著正相關(guān)，而產(chǎn)酸能力與片球菌屬、魏斯氏屬和根霉屬密切相關(guān)，產(chǎn)酒精能力與片球菌屬和根霉屬呈正相關(guān)，這些微生物對紹興酒的發(fā)酵活性和風(fēng)味特征有重要影響。

2.1.2 麥曲

我國黃酒生產(chǎn)用曲的種類多種多樣，其中使用最為廣泛的是麥曲[45]。麥曲是以小麥作為主要原料，經(jīng)過粉碎、加水、拌和、成型、堆放，在合適的溫度、濕度條件下培養(yǎng)制作而成[44]。制曲過程是開放的，所形成的麥曲微生物群落極其復(fù)雜[46]，麥曲微生物主要包括絲狀真菌、細(xì)菌和酵母菌。

JI Z等[47]利用高通量測序技術(shù)對上海、浙江和江蘇的黃酒麥曲進(jìn)行分析，紹興黃酒生麥曲、江蘇黃酒生麥曲、上海黃酒生麥曲、接種黃曲霉（Aspergillus flavus）的熟麥曲和天然的熟麥曲在真菌屬水平上，真菌的多樣性依次下降，曲霉屬（Aspergillus）是優(yōu)勢絲狀真菌。細(xì)菌在黃酒釀造過程中也同樣扮演著重要角色，劉蕓雅等[48]采用Illumina技術(shù)對紹興黃酒麥曲中細(xì)菌16S rDNA可變區(qū)序列進(jìn)行測序，在屬水平上的主要優(yōu)勢菌包括糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸桿菌屬（Enterobacter），而且芽孢桿菌屬（Bacillus）和糖多孢菌屬表現(xiàn)出突出的分布優(yōu)勢。XIE G F等[17]對麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了基于Illumina技術(shù)的高通量測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第5天麥曲樣品中放線菌門（Actinobacteria）的細(xì)菌相對豐度達(dá)到了87%，其中糖多孢菌屬為優(yōu)勢菌屬，第30天麥曲樣品放線菌門的相對豐度顯著下降到40.7%，而糖多孢菌屬的相對豐度大幅度下降到8%，芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬的相對豐度分別增加至14.5%和11.6%，根據(jù)麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的顯著性變化可以推測不同種類的細(xì)菌在麥曲中發(fā)揮的作用。

2.2 釀造環(huán)節(jié)對黃酒微生物多樣性的影響

2.2.1 浸米

在黃酒釀造前期，浸米是開始正式發(fā)酵之前的關(guān)鍵步驟。浸米不僅能夠使原料米吸水膨脹便于蒸煮，而且漿水中存在的微生物可以使?jié){水酸化，抑制雜菌生長繁殖，對于后續(xù)的黃酒發(fā)酵過程和風(fēng)味物質(zhì)形成都可以發(fā)揮積極作用[1，6，49]。姬中偉等[50]對不同原料的米漿水進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)米漿水中的微生物主要是乳酸菌，糯米漿水酸度明顯高于其他原料，觀察米漿水的酸度變化對于黃酒生產(chǎn)的發(fā)酵控制具有指標(biāo)性意義。朱小芳等[51]利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)全面分析了米漿水中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）為米漿水中主要細(xì)菌類群，豐度占比為60.7%，其中57.4%的菌群為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），21.1%的菌群為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），另外漿水中也分布有片球菌屬、醋酸菌屬（Acetobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）等細(xì)菌類群。

2.2.2 發(fā)酵

發(fā)酵是黃酒釀造的重要工序，蒸好的米飯與麥曲、淋飯酒母在陶缸內(nèi)攪拌混勻，經(jīng)過3～5 d完成前發(fā)酵過程，然后將發(fā)酵醪液轉(zhuǎn)入陶壇進(jìn)行后發(fā)酵，發(fā)酵周期歷時3個月。在發(fā)酵醪液內(nèi)復(fù)雜微生物區(qū)系的作用下，完成淀粉轉(zhuǎn)化、酒精形成和風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生等重要的生物轉(zhuǎn)化過程[44]。黃酒發(fā)酵是系列微生物共同參與的生產(chǎn)過程，包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌等各種微生物類群[47]。在落缸發(fā)酵后，醪液內(nèi)酵母菌很快發(fā)酵產(chǎn)生酒精，隨著黃酒發(fā)酵在較低的pH下持續(xù)進(jìn)行，發(fā)酵醪液處于高酒精和高酸環(huán)境，限制了其他雜菌生長，導(dǎo)致大量微生物豐度減少或消失[52]。因為黃酒發(fā)酵是微生物作用的結(jié)果，任何影響微生物菌群結(jié)構(gòu)變化的因素都會對黃酒的最終品質(zhì)產(chǎn)生影響，對黃酒發(fā)酵過程中微生物多樣性的變化研究分析，對指導(dǎo)黃酒生產(chǎn)具有一定意義[53]。

WANG P X等[52]利用454焦磷酸測序技術(shù)對紹興黃酒釀造過程中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處于黃酒不同發(fā)酵階段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在顯著差異，發(fā)酵醪液中存在10多個細(xì)菌屬，其中乳桿菌屬和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢微生物種群，在黃酒風(fēng)味形成中可能起著重要作用。LIU S P等[5]通過MiSeq焦磷酸測序方法研究紹興黃酒發(fā)酵過程中細(xì)菌演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)紹興黃酒發(fā)酵過程中有10個優(yōu)勢細(xì)菌屬，包括芽孢桿菌屬、亮葡菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬、魏斯氏屬、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、糖多孢菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬和乳桿菌屬，其中芽孢桿菌屬和乳酸菌屬在黃酒發(fā)酵細(xì)菌中起主導(dǎo)作用。JI Z等[47]通過Illumina-Miseq高通量測序技術(shù)解析黃酒發(fā)酵過程中真菌微生物的變化，發(fā)現(xiàn)在屬的水平上，各個發(fā)酵階段的醪液中優(yōu)勢菌是曲霉屬，表明絲狀真菌的代謝產(chǎn)物可能對黃酒中主要化學(xué)物質(zhì)的形成有重要貢獻(xiàn)。隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，物種豐富度逐漸降低，這可能是由于氧氣和營養(yǎng)成分的改變，在不同的黃酒發(fā)酵階段中釀酒微生物可以產(chǎn)生不同的有機酸的原因。

3 展望

高通量測序技術(shù)方法簡單、通量更高、成本較低和速度較快，在黃酒釀造微生物研究中具有重要應(yīng)用價值，不僅可以闡釋黃酒發(fā)酵過程中微生物多樣性，而且可以檢測釀造微生物菌群的動態(tài)變化，彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足。由于第三代測序技術(shù)成本較高、準(zhǔn)確率低，第二代測序技術(shù)仍然為黃酒釀造微生物研究的主流技術(shù)。但是，目前利用二代測序技術(shù)對黃酒微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，一般只能注釋到屬水平或者更高的分類階元而不能準(zhǔn)確注釋到種水平，難以徹底解析微生物種類結(jié)構(gòu)及其釀造微生物種類與黃酒中成份物質(zhì)的代謝關(guān)系。在未來的黃酒微生物研究中，高通量測序技術(shù)與宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，可以更加深入的研究黃酒釀造微生物的生物學(xué)功能與群落結(jié)構(gòu)，也為進(jìn)一步開展優(yōu)良釀造菌種的篩選和改良、關(guān)鍵微生物代謝產(chǎn)物對黃酒品質(zhì)的影響等科研課題提供了新的研究手段。