跨腸道膽固醇排泄的研究進展

唐曉禹、于碧蓮綜述，劉德良、彭道泉審校

膽固醇是生物膜上必不可少的組分，也是合成多種生物活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。膽固醇主要經(jīng)飲食攝入、自身合成、糞便排泄，在體內(nèi)維持動態(tài)平衡。雖然膽固醇具有重要的生理意義，但是血膽固醇濃度升高卻是我國以及世界范圍內(nèi)首位疾病死亡原因——動脈粥樣硬化性心血管疾?。ˋSCVD）的致病性危險因素[1]。在我國，目前高膽固醇血癥的患病率高達28.5%，但血脂異常的知曉率、治療率和控制率整體仍處于較低水平[2]。以膽固醇為切入點控制ASCVD 的方案還有很多進步的空間。膽固醇的分子式是C27H46O，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，它可以被轉(zhuǎn)化為生物活性物質(zhì)，但不能被降解。因此膽固醇排泄對維持膽固醇穩(wěn)態(tài)具有重要作用。膽固醇逆轉(zhuǎn)運（reverse cholesterol transport，RCT）是目前研究較為透徹的膽固醇排泄通路，它清除外周組織中過多的膽固醇，是ASCVD 有力的保護機制。

RCT 對ASCVD 的保護作用源于對動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)泡沫細胞中膽固醇的清除。泡沫細胞內(nèi)過載的膽固醇以非特異性液相擴散或受體介導的方式流出細胞，這些受體膜蛋白包括：三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP binding cassette transporter A1,ABCA1）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1（ATP binding cassette transporter G1,ABCG1）和B 類Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptor B Ⅰ，SR-B Ⅰ）。流出細胞的膽固醇結(jié)合組織間隙中的高密度脂蛋白（HDL）顆粒。HDL 經(jīng)血液循環(huán)到達肝臟，被肝細胞攝取。肝細胞將膽固醇以原型或膽汁酸的形式分泌至膽汁，最后膽固醇經(jīng)糞便排出體外，這是經(jīng)典的RCT 模型[3]。在此模型中，腸道僅作為最后一環(huán)——膽固醇排泄的通道發(fā)揮作用。但近十余年來，越來越多的研究證實，腸道可主動分泌膽固醇至腸腔，直接排出血中的膽固醇，此即跨腸道膽固醇排泄（transintestinal cholesterol excretion,TICE）。在人體，生理情況下此過程占糞便膽固醇排泄總量的35%。

1 跨腸道膽固醇排泄是活躍的生理過程

1959年，Cheng 等[4]發(fā)現(xiàn)，胰頭癌導致完全性膽道梗阻的患者無膽汁排入腸腔，但其糞便中仍可檢出較多膽固醇（約400 mg/d，已校正飲食來源膽固醇），提示存在膽汁以外的膽固醇排泄旁路。1967年，Simmonds 等[5]研究人體腸道膽固醇吸收功能時，對近段空腸灌注，并在相距50 cm 的下游收集灌流液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下游位點灌流液中膽固醇含量反而較上游有所增加，提示該腸段本身可分泌膽固醇至腸腔。動物模型證實了該發(fā)現(xiàn)，并進一步明確，近段小腸較中、遠段小腸分泌膽固醇的能力更強，且該過程依賴于腸腔受體（膽鹽、磷脂）的存在[6]。2016年，Jakulj 等[7]則終于在人體實現(xiàn)了對TICE 過程的定量檢測。人們從認識TICE 到對其定量分析，經(jīng)過了數(shù)十年。造成研究進展緩慢的原因主要在于膽固醇代謝的復雜性。糞便中膽固醇的來源除TICE 以外，包括三部分：（1）飲食中未被腸道吸收的部分——外源性膽固醇；（2）內(nèi)環(huán)境中的膽固醇，經(jīng)膽汁排泄進入腸腔，且未被重吸收的部分；（3）隨腸腔上皮細胞脫落而丟失的部分（圖1）。如何區(qū)分不同來源的膽固醇，是研究TICE 時遇到的難點。

圖1 糞便中膽固醇的來源

以下多種研究方案巧妙地解決了從整體角度研究TICE 的難題。（1）原位灌注，直接研究單一器官。2007年van der Velde 等[6]向小鼠尾靜脈注射同位素標記的膽固醇，30 min 后，原位游離腸段并灌注。在回收的灌流液中可檢出標記膽固醇，直接提示小腸可分泌膽固醇至腸腔。（2）外科方式進行膽汁改道，分離膽汁來源膽固醇。De Boer 等[8]以膽道置管的方式，將大鼠1 的膽汁引流至大鼠2 的十二指腸，將大鼠2 的膽汁引流至大鼠1 的十二指腸。膽汁改道后，給大鼠1 腹腔注射含氚標膽固醇的巨噬細胞以檢驗膽汁途徑和非膽汁途徑對RCT 的貢獻。結(jié)果示大鼠1、大鼠2 的糞便中均可檢出標記膽固醇，且63%的氚標膽固醇出現(xiàn)在大鼠2 糞便中，37%的氚標膽固醇出現(xiàn)在大鼠1 糞便中，說明TICE 參與RCT 且為旁路途徑。（3）遺傳方式改變小鼠膽固醇排泄通路上的關鍵蛋白，在生理狀態(tài)下阻斷膽汁來源的膽固醇進入腸腔。ABCB4 基因敲除、肝臟過表達尼曼-匹克C1 型類似蛋白1（Niemann-Pick C1L1,NPC1L1）[9]的小鼠均表現(xiàn)為膽汁中膽固醇含量顯著降低甚至缺如，但以上小鼠糞便中膽固醇含量卻無顯著下降，同樣說明存在肝-膽汁以外的旁路膽固醇排泄途徑。（4）人類疾病模型。前述研究方案均不適用于人體研究，但某些疾病本身可造成肝-膽汁排泄通路的完全阻斷。類似Cheng 等[4]的研究，Moreau 等[10]給2例同樣是胰頭癌完全性膽道梗阻的患者靜脈注射穩(wěn)定同位素標記的膽固醇，2 d 后在患者的糞便中發(fā)現(xiàn)了標記膽固醇。這個簡單清晰的試驗提供了TICE 在人體存在的直觀證據(jù)。（5）同位素標記不同來源膽固醇，直接計算各途徑貢獻。Jakulj 等[7]給15 名健康受試者口服D4-膽酸，用Entero-test 膠囊行膽汁采樣。通過測定膽汁中D4-膽酸含量及膽汁中膽汁酸/膽固醇比值，計算膽汁來源膽固醇。飲食來源膽固醇則以D7-膽固醇標記，并口服不吸收的D4-谷固醇校正糞便排泄量。靜脈注射13C2-膽固醇并多次采集血樣、糞便，檢測13C2-膽固醇的含量。接下來再測定糞便中膽固醇排出量后可計算得到，在生理條件下，TICE 貢獻人體糞便膽固醇排出總量的35%。以上研究結(jié)果強有力地證明，血漿中膽固醇可跨腸道直接排泄至糞便，TICE 是活躍的生理過程，具有重要的生理意義。

2 跨腸道膽固醇排泄的分子機制

從細胞層面來看，TICE 其實是小腸吸收細胞從基側(cè)面到管腔面的膽固醇流出（圖2）。小腸吸收細胞為單層柱狀上皮細胞，細胞間的緊密連接將單個吸收細胞的細胞膜分為基底面?zhèn)让妫ɑ鶄?cè)面）和管腔面兩個功能面。兩個功能面上的膜蛋白種類和數(shù)量迥異。類似肝細胞，吸收細胞基側(cè)面有低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR），而管腔面有ABCG5/G8、ABCB1、NPC1L1 等膜蛋白。目前對于TICE 所涉及的分子機制，仍存在許多未解之謎，現(xiàn)對已有證據(jù)匯總。

圖2 跨腸道膽固醇排泄的分子機制

血漿供體：TICE 是RCT 過程的一環(huán)。類比HDL介導肝-膽汁途徑的RCT，小腸是否也由HDL 顆粒供給膽固醇呢？目前結(jié)論不完全一致。Vrins 等[11]給小鼠尾靜脈注射含標記膽固醇的HDL 顆粒并行小腸灌注，結(jié)果標記膽固醇基本不出現(xiàn)在小腸灌流液中。但在Le May 等[12]報道的類似實驗中，腸腔灌流液可檢出標記膽固醇，且基于尤斯室系統(tǒng)的體外實驗同樣發(fā)現(xiàn)HDL 中的標記膽固醇可跨小腸上皮細胞運輸。Le May 等認為，造成上述不一致結(jié)果的原因可能在于以HDL 為供體的TICE 排出量本身較低，而Vrins 等給藥量較少所以檢出量亦少。雖然HDL在TICE 中的作用仍有爭議，但已經(jīng)明確含載脂蛋白B（apoB）的脂蛋白是TICE 的供體。在反義核苷酸誘導的肝臟酰基輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶2（Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 2,ACAT2）快速敲除的小鼠模型中，肝細胞內(nèi)膽固醇酯化障礙，游離膽固醇增多。肝細胞內(nèi)游離膽固醇通過含apoB 的脂蛋白、經(jīng)TICE 途徑排出體外，引起TICE 增加[13]。若以反義核苷酸敲除肝細胞組裝極低密度脂蛋白（VLDL）的關鍵酶——微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTP），則TICE 顯著下降[14]。以低密度脂蛋白（LDL）為載體的體內(nèi)、體外實驗和對LDLR 的藥物干預實驗也證實LDL 是TICE 的供體[12]。

基側(cè)面膜蛋白：血漿供體到達吸收細胞基側(cè)面后，是如何入胞的呢？目前已明確的有基側(cè)面膜蛋白LDLR。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）可介導LDLR 的降解，減少細胞膜上LDLR 數(shù)量。PCSK9 基因敲除的小鼠TICE 顯著升高，而PCSK9給藥則造成TICE 顯著下降，且下降程度在LDLR敲除小鼠中顯著減弱[12]，說明PCSK9 對TICE 的影響是通過LDLR 發(fā)揮作用的，LDLR 是TICE 通路上的一環(huán)。但有趣的是在LDLR 基因敲除小鼠，TICE并未消失[12]，說明在基側(cè)面除了LDLR，還存在其他受體介導血漿膽固醇入胞，尚需進一步研究以明確該受體。而另一方面，在經(jīng)典肝-膽汁途徑中起重要作用的SR-B Ⅰ在小鼠小腸吸收細胞的基側(cè)面和管腔面均有表達，但對TICE 過程無明顯影響[15]。

細胞內(nèi)膽固醇運輸：關于吸收細胞內(nèi)膽固醇運輸?shù)难芯枯^少。在Caco-2/TC7 結(jié)腸癌細胞系中，若加入秋水仙堿抑制微管形成，則熒光標記的膽固醇從細胞基側(cè)面向管腔面的轉(zhuǎn)運減少，說明微管參與TICE 途徑細胞內(nèi)膽固醇運輸[16]。

管腔面膜蛋白：三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1/G8（ABCG5/G8）異二聚體是管腔面介導膽固醇排出的膜蛋白。腸道特異性敲除ABCG5/G8 的小鼠模型TICE 下降約40%[17]。敲除ABCG5/G8 后,TICE 仍有保留提示ABCG5/G8 并非管腔面唯一介導膽固醇流出的膜蛋白。膜蛋白三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體B1a/b（ABCB1a/b）可發(fā)揮膽固醇翻轉(zhuǎn)酶的作用，介導膽固醇排出?；蚯贸蛩幬镄砸种艫BCB1a/b 的小鼠TICE 下降26.5%～64.0%[12]。但管腔面是否還存在ABCG5/G8、ABCB1a/b 以外的轉(zhuǎn)運子介導膽固醇排出尚屬未知。

跨腸道排出的膽固醇同飲食攝入、膽汁分泌的膽固醇一樣，也會被重新收。TICE 排出的膽固醇取決于排出量與重吸收量的差值。事實上，如同腎臟產(chǎn)生大量原尿，腸道也通過TICE 途徑排出大量膽固醇，但大量被排出的膽固醇又被重吸收回體內(nèi)。小鼠模型中，若用藥物或遺傳方式抑制小鼠對膽固醇的吸收，TICE 可增加至未被抑制時的5～7 倍[18]。在吸收細胞的管腔面，LIM 結(jié)構(gòu)域肌動蛋白結(jié)合蛋白1 橋接膜蛋白NPC1L1 和轉(zhuǎn)運復合體上的肌球蛋白Vb，共同協(xié)助膽固醇吸收[19]。膜蛋白NPC1L1 是參與重吸收的最重要蛋白，NPC1L1 與ABCG5/G8、ABCB1a/b 共同調(diào)控吸收細胞管腔面的膽固醇進出。

3 跨腸道膽固醇排泄的調(diào)節(jié)

TICE 作為肝-膽汁-糞便途徑以外的旁路膽固醇排泄途徑，當肝細胞內(nèi)膽固醇過載或膽汁排泄通路被阻斷時，TICE 增加以保證足夠的膽固醇排出，維持體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)。目前已發(fā)現(xiàn)，飲食和多種藥物可調(diào)控TICE。

不同飲食對TICE 的影響不一，腸腔受體的存在顯著增加TICE：用不同飲食飼養(yǎng)小鼠后行腸道灌注，高脂肪飲食（無膽固醇，24%脂肪）、西方飲食（0.25%膽固醇，16%脂肪）可分別增加TICE 途徑的膽固醇排泄量至普通飲食喂養(yǎng)的2 倍、1.5 倍。而高膽固醇飲食（2%膽固醇，無脂肪）則對TICE 無顯著影響[20]。

肝X 受體激動劑顯著增加TICE：肝X 受體是配體激活型轉(zhuǎn)錄因子，激活后可調(diào)控一系列與膽固醇運輸相關基因的表達。多項研究已表明，給予小鼠肝X 受體激動劑后，TICE 顯著增加[12]。

依折麥布顯著增加TICE：依折麥布作用于小腸吸收細胞管腔面的NPC1L1 蛋白，可基本廢除腸道膽固醇吸收（膽固醇吸收率從46%下降至4%）[18]。如前文所述，因為抑制重吸收，依折麥布可引起經(jīng)TICE 途徑的膽固醇排泄量大量增加。受試者連續(xù)服用4 周依折麥布（10 mg/d），TICE 從（252±46）mg/d增加至（1 024±114）mg/d。

PCSK9 顯著減少TICE：PCSK9 基因敲除小鼠TICE 增加62%，而快速注射PCSK9 后，小鼠小腸吸收細胞LDLR 顯著減少，TICE 也顯著減少約35%[12]。體外實驗也發(fā)現(xiàn)，給予PCSK9 后，Caco-2/TC7 細胞LDLR 蛋白下降20%，伴隨27%的膽固醇流出下降[16]。

不同他汀類藥物對TICE 的影響不一：他汀類藥物通過競爭性抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶，間接上調(diào)細胞膜LDLR，發(fā)揮顯著的降血脂作用。Le May[12]等發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀使TICE 增加71%。但在另一項研究中[21]，只有阿托伐他汀增加TICE，洛伐他汀和瑞舒伐他汀無明顯作用。目前尚無在人體中觀察他汀類藥物對TICE 的影響的研究。

過氧化物酶體增殖物激活受體δ（peroxisome proliferator-activated receptor δ，PPARδ）激動劑減少NPC1L1 的表達而增加TICE：PPARδ 是調(diào)節(jié)糖脂代謝的轉(zhuǎn)錄因子。PPARδ 激動劑可減少腸道NPC1L1 的表達，增加TICE[12]。

法尼醇受體激動劑改變膽汁酸親水性而增加TICE：法尼醇受體是在肝臟、腸道高表達的轉(zhuǎn)錄因子，其配體為膽汁酸。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，法尼醇受體結(jié)合膽汁酸后，刺激吸收細胞釋放腸激素成纖維細胞生長因子15 入血，經(jīng)門靜脈到達肝臟，調(diào)節(jié)肝細胞膽汁酸的合成。法尼醇受體激動劑可通過上述途徑顯著增加膽汁中親水性膽汁酸的比例，引起TICE 大量增加[22]。

載脂蛋白A-I（apoA-I）模擬肽4F 顯著增加TICE：apoA-Ⅰ模擬肽4F 是人工合成的、功能類似于apoA-Ⅰ的18 氨基酸肽鏈，具有抗動脈粥樣硬化作用。Meriwether 等[23]發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中4F 傾向于到達近段小腸，并跨細胞至腸腔，引起TICE 增加。

4 展望

TICE 作為RCT 中肝-膽汁-糞便以外的旁路膽固醇排泄途徑，可在不增加膽結(jié)石風險的情況下顯著增加膽固醇排泄，降低ASCVD 風險，有重要的藥物干預前景。目前，雖然臨床已廣泛使用他汀類藥物、依折麥布調(diào)控血脂，但尚無以增加TICE為目標的藥物治療方案。至今TICE 的分子機制還存在很多疑問：是否存在LDL、VLDL 以外的其他血漿供體？吸收細胞的基側(cè)面除了LDLR 以外還有何種受體攝取血漿中的膽固醇？吸收細胞內(nèi)膽固醇運輸?shù)姆肿訖C制是什么？管腔面是否還有ABCG5/G8、ABCB1a/b 以外的其他轉(zhuǎn)運蛋白參與TICE 途徑？隨著這些疑問的逐漸解開，未來可能會出現(xiàn)針對TICE途徑的藥物治療方案，在現(xiàn)有藥物治療的基礎上更進一步降低血漿膽固醇，降低ASCVD 風險。

綜上所述，TICE 是肝-膽汁-糞便途徑以外的旁路膽固醇排泄途徑。生理狀態(tài)下，TICE 活躍地將血中的膽固醇泵入腸腔，排出體外，此過程約占人體糞便膽固醇排泄量的35%。當肝-膽汁-糞便途徑排泄膽固醇受阻時，TICE 途徑的膽固醇排泄量將增加以維持膽固醇穩(wěn)態(tài)。TICE 也可受飲食、藥物等多種途徑調(diào)節(jié)。雖然TICE 通路的分子機制還有待進一步闡明，但圍繞TICE 的進一步研究有可能為ASCVD 的防治提供新的藥物干預靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突