基于SSR的四川榛子資源親緣關(guān)系研究

王澤亮, 吳斌, 邢文曦, 鄭崇文, 李丕軍

四川省林業(yè)科學(xué)研究院, 四川 成都 610081

榛屬（CorylusL.）植物，為落葉小喬木或灌木，較少為喬木，約有20余種，分布于亞洲、歐洲與北美洲。我國(guó)有10個(gè)種（變種），主要原生分布在西南地區(qū)與東北、華北、西北三北地區(qū)[1]。榛屬植物種子不但含油豐富，還富含蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)元素，為世界“四大堅(jiān)果”之一，可直接食用，在巧克力、糖果、奶制品及焙烤食品產(chǎn)業(yè)中也廣泛應(yīng)用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。我國(guó)遼寧省經(jīng)濟(jì)林研究所等單位自20世紀(jì)60—80年代先后開(kāi)展了歐榛引種、平榛選育以及平榛與歐榛的雜交育種研究，并于1999年開(kāi)始選育出了一系列平歐雜交榛子良種，目前已在三北地區(qū)與山東、安徽等地推廣，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)榛子栽培品種的空白，開(kāi)啟了我國(guó)榛子園藝化栽培與產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新時(shí)代[2-3]。

四川是榛屬植物資源的重要分布區(qū)，盡管不同文獻(xiàn)記述稍有差異，但國(guó)內(nèi)榛子資源至少有7種在本區(qū)域有分布，包括滇榛、川榛、刺榛、毛榛、藏刺榛（C.feroxvar.thibetica）、華榛（C.chinensis）、披針葉榛（C.fargesii）[1]，主要分布在阿壩州、涼山州、甘孜州及秦巴山區(qū)等地，目前國(guó)內(nèi)外僅有少量研究將川榛、滇榛作為試驗(yàn)材料的一部分[4-6]。為了有效的利用這些野生榛子資源，首先需要深入了解其分布狀況及遺傳基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeat，SSR）分子標(biāo)記在植物中分布廣泛、多態(tài)性豐富，且具有共顯性、表現(xiàn)穩(wěn)定等特點(diǎn)，已成為植物群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)等研究的有效手段，持續(xù)推動(dòng)了遺傳改良進(jìn)程[7-10]。在榛屬植物研究中，美國(guó)俄勒岡州立大學(xué)Mehlenbacher實(shí)驗(yàn)室首先開(kāi)發(fā)出了專用的SSR分子標(biāo)記[11]，目前已廣泛應(yīng)用于榛子遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)分析及遺傳圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系研究等方面[12-14]，有效推動(dòng)了榛子資源的培育與利用研究。

本研究使用前期篩選的9對(duì)引物[15]分析了目前收集到的川榛、滇榛、刺榛、毛榛、歐榛資源的親緣關(guān)系，以利于下一步雜交育種親本的選擇，并期望最終推動(dòng)四川榛子資源的良種選育與保護(hù)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇54份榛子資源參與本項(xiàng)目研究，具體信息見(jiàn)表1，其中歐榛為國(guó)外引進(jìn)資源。采集新鮮葉片，使用變色硅膠干燥，并保存于-80℃冰箱備用。

表1 參試的榛子種質(zhì)資源Tab.1 General information of the test hazelnut germplasm resources

1.2 方法

利用9對(duì)SSR引物對(duì)樣品進(jìn)行分型分析，引物信息、基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增體系、程序與SSR產(chǎn)物電泳分型桐以前研究[15]。遺傳參數(shù)采用GenAlEx6.51b2軟件計(jì)算[16]，個(gè)體Nei’s遺傳距離利用NTSYS-pc 2.10s計(jì)算、并進(jìn)行UPGMA聚類分析[17]，利用計(jì)算的參數(shù)對(duì)參試榛子群體遺傳多樣性與親緣關(guān)系進(jìn)行解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛子資源遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)

本文使用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)54份榛子資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，SSR位點(diǎn)遺傳參數(shù)見(jiàn)表2。其中，等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon's信息指數(shù)（I）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）分別介于2.455~5.000、1.877~4.083、0.667~1.461、0.445~0.818、0.381~0.732之間。平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出3.596個(gè)等位基因，Ch07檢測(cè)到的平均等位基因數(shù)最多、為5.000，Ch03檢測(cè)到的最少、為2.455。平均有效等位基因數(shù)為2.772，其中最多的位點(diǎn)是Ch07、為4.083，而Ch08最少、為1.877。

有效等位基因數(shù)、雜合度與Shannon’s信息指數(shù)反映了群體等位基因分布的豐富與均勻程度[18]。本研究中，11個(gè)群體的有效等位基因數(shù)介于2.030~3.427之間、均值，觀察雜合度范圍介于0.467~0.756，期望雜合度變動(dòng)于0.396~0.678，Shannon’s信息指數(shù)范圍為0.680~1.296，4個(gè)參數(shù)的均值分別為2.772、0.644、0.546、1.016（見(jiàn)表2）?；谏鲜鰯?shù)據(jù)，參試的11個(gè)榛子群體的遺傳多樣性處于中等水平，且11個(gè)群體中茂縣川榛（C）與瀘定滇榛（B）群體多樣性水平較高，而鹽源滇榛（E）與茂縣毛榛（O）群體遺傳多樣性水平較低。

表2 總?cè)后w SSR 遺傳參數(shù)Tab.2 SSR genetic parameters of total populations

遺傳分化系數(shù)（Fst）是衡量群體間分化程度的指標(biāo)，根據(jù)Fst值（見(jiàn)表2），參試群體31.7%的遺傳變異存在于群體間、68.3%存在于群體內(nèi)，說(shuō)明群體間、群體內(nèi)的變異均是榛子總?cè)后w遺傳變異的來(lái)源。同時(shí)Fst>0.25表示群體間的遺傳分化很大[19-20]，因此本文認(rèn)為參試榛子總?cè)后w間的遺傳分化很大，與遺傳分化很大相一致，群體間的平均基因流值（Nm）僅為0.646，這也與參試材料包括滇榛、川榛、毛榛、刺榛、歐榛相一致。

同時(shí)從各群體來(lái)說(shuō)，觀察雜合度均高于期望雜合度（見(jiàn)表3），表明參試的各榛子群體雜合子過(guò)剩，群體內(nèi)有較高的基因交流。

表3 群體遺傳參數(shù)Tab.3 Genetic diversity of the test populations

2.2 榛子資源親緣關(guān)系

基于參試個(gè)體的遺傳距離，分別進(jìn)行了Population assignment（見(jiàn)圖1）分析與主坐標(biāo)（PCoA）分析（見(jiàn)圖2）。 Population assignment分 析 則 顯 示 刺榛、毛榛與歐榛為1類，川榛與滇榛為1類。主坐標(biāo)分析顯示榛子資源分為刺榛、毛榛與歐榛、川榛與滇榛3類。說(shuō)明毛榛與歐榛的親緣關(guān)系較近，川榛與滇榛的親緣關(guān)系也較近。

圖1 群體分配分析Fig.1 Population assignment analysis

圖2 主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinate analysis

進(jìn)一步利用個(gè)體Nei’s遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類圖（見(jiàn)圖3），結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)為 0.31時(shí)，54個(gè)榛子種質(zhì)資源個(gè)體可聚類為毛榛、歐榛、刺榛、川榛與滇榛4類。而且從聚類圖上可以看出毛榛與歐榛的親緣關(guān)系較近，川榛與滇榛的親緣關(guān)系也較近，與主坐標(biāo)分析結(jié)果相似，也與王艷梅的結(jié)果相一致[4]。

圖3 基于 Nei’s 遺傳距離的 UPGMA 聚類分析Fig.3 UPGMA clustering analysis based on Nei's genetic distance

3 討論

本研究使用9個(gè)SSR分子標(biāo)記分析了四川不同縣域的川榛、滇榛、刺榛、毛榛與引進(jìn)的歐榛資源的群體遺傳多樣性與親緣關(guān)系，結(jié)果顯示參試的榛子群體的遺傳多樣性處于中等水平，且川榛與滇榛的親緣關(guān)系較近，毛榛與歐榛的親緣關(guān)系也較近。

一般來(lái)說(shuō)，在較近的地理區(qū)域內(nèi)，由于環(huán)境與氣候條件比較接近，自然選擇壓力趨于一致，在一定程度上增加了種間的基因交流，因此地理較近的種遺傳相似性較大、親緣關(guān)系較近。川榛與滇榛的親緣關(guān)系較近也說(shuō)明了這一點(diǎn)，川榛主要分布于阿壩州，滇榛主要分布于涼山州，而且根據(jù)文獻(xiàn)資料與我們的調(diào)查，川榛與滇榛在涼山冕寧、甘孜瀘定均有分布。而毛榛與歐榛地理距離遠(yuǎn)、親緣關(guān)系較近，川榛與毛榛（參試資源分布于茂縣）、刺榛與滇榛（冕寧均有分布）親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，可能跟其進(jìn)化歷史有關(guān)。Bassil等通過(guò)研究認(rèn)為：亞洲在冰期是榛屬植物的避難地，隨后其通過(guò)地中海擴(kuò)散到歐洲，通過(guò)大西洋陸橋與（或）白令陸橋擴(kuò)散到北美洲[21]，與樺木科榿木屬植物系統(tǒng)發(fā)育相一致[22]。因此，我們推測(cè)在進(jìn)化歷史上毛榛與歐榛可能有較近的共同祖先，而川榛與毛榛、刺榛與滇榛盡管目前地理距離較近，然而進(jìn)化歷史上卻來(lái)自不同的分支。當(dāng)然，這種推測(cè)需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。對(duì)于雜交育種，從本文研究結(jié)果來(lái)說(shuō)，川榛與滇榛、毛榛與歐榛可能比較容易得到雜交子代，當(dāng)然這也需要下一步的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)驗(yàn)證。

同時(shí)對(duì)四川榛子資源來(lái)說(shuō)，盡管目前采集到了部分資源，然而部分資源數(shù)量不足，藏刺榛、披針葉榛目前尚未采集到資源，因此要對(duì)四川榛子資源進(jìn)行較全面的評(píng)價(jià)與利用，也需要進(jìn)一步的調(diào)查與研究。