傷寒沙門(mén)菌激活TRAIL信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡

尹芬芬，楊帆帆，謝中藝，王雨柔，黃新祥，生秀梅，張 盈

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

傷寒沙門(mén)菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，簡(jiǎn)稱S.Typhi)是一種寄生在人類腸道的革蘭氏陰性桿菌，屬胞內(nèi)寄生菌，具有嚴(yán)格的宿主特異性，人是其惟一的感染宿主[1].糞口傳播是S.Typhi主要的傳播途徑，S.Typhi通過(guò)污染的食物和水源進(jìn)入機(jī)體，經(jīng)消化道感染，最終引起嚴(yán)重的全身系統(tǒng)性疾病，傷寒熱是其典型癥狀，此外還會(huì)出現(xiàn)一些其他癥狀，如軀干上出現(xiàn)玫瑰疹、腹痛、腹瀉、肝脾腫大、胃腸出血等[2].

凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)性死亡，包括外源性和內(nèi)源性途徑.外源性通路主要是配體和死亡受體結(jié)合募集FADD和caspase-8前體，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物DISC，進(jìn)一步激活caspase-8以及下游caspase-3蛋白，caspase-8是外源性途徑的關(guān)鍵蛋白.內(nèi)源性線粒體通路主要由DNA損傷、毒素等多種因素誘發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素c，協(xié)同凋亡蛋白活性因子-1激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3、caspase-7，caspase-9是內(nèi)源性途徑的關(guān)鍵蛋白[3]；內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路主要是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失常引起Ca2+紊亂、大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積等引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，特異性激活caspase-12，進(jìn)而剪切活化caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4].三條通路最終的執(zhí)行蛋白均為caspase-3，caspase-3被認(rèn)為是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶.

沙門(mén)菌感染巨噬細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逃避宿主的免疫識(shí)別，有利于細(xì)菌在宿主內(nèi)更好的存活.S.Typhi感染巨噬細(xì)胞后激活TNF-α，通過(guò)增加機(jī)體活性氧ROS、減少抗氧化物酶SOD產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TNF-α和其受體結(jié)合后激活caspase-8、caspase-3介導(dǎo)的外源性凋亡途徑[5]；鼠傷寒沙門(mén)菌三型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ Secretion System，T3SS)分泌的效應(yīng)蛋白SipA能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中caspase-3的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6].

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的一員，屬于Ⅱ型跨膜蛋白.TRAIL蛋白和死亡受體4/5(Death receptor，DR4/5)結(jié)合介導(dǎo)的凋亡通路是近些年的研究熱點(diǎn)，外源加入重組TRAIL蛋白或TRAIL受體激動(dòng)劑能夠誘導(dǎo)乳腺癌、腎癌等腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到較好的疾病治療效果[7-8]，TRAIL處理也可以誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7呈現(xiàn)時(shí)間依賴性凋亡[9]；也有研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL蛋白能夠誘導(dǎo)某些正常細(xì)胞如人肝細(xì)胞、人角質(zhì)細(xì)胞等發(fā)生凋亡[10-11].沙門(mén)菌感染機(jī)體過(guò)程中，巨噬細(xì)胞是抵抗細(xì)菌入侵過(guò)程中重要的吞噬細(xì)胞，在機(jī)體免疫應(yīng)答及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用，沙門(mén)菌也進(jìn)化出相應(yīng)的機(jī)制如在巨噬細(xì)胞內(nèi)形成含沙門(mén)菌的囊泡SCV (Salmonell-containing vacuole)等得以在細(xì)胞內(nèi)生存及增殖[12].但是TRAIL凋亡通路在細(xì)菌影響巨噬細(xì)胞凋亡方面的研究較少.因此，本研究通過(guò)S.Typhi感染巨噬細(xì)胞來(lái)探究沙門(mén)菌對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡通路的影響以及TRAIL信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞株S.Typhi 野生株GIFU10007(以下簡(jiǎn)稱為WT)由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng)；人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1購(gòu)買自上海生科院細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室保存及培養(yǎng).

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑(Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR熒光定量試劑(Vazyme公司)，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、佛波酯PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate)、胎牛血清(Gibco公司)，Annexin V FITC/PI凋亡試劑盒(聯(lián)科生物科技公司)，caspase-3、caspase-8、caspase-9抗體(ABclonal生物科技公司)，TRAIL、DR5抗體(Proteintech公司)，RIPA裂解液(上海生工生物工程有限公司).

1.1.3 主要儀器 恒溫?fù)u床、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、核酸檢測(cè)儀(Thermo scientific公司)，分光光度計(jì)、PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf公司)，定量PCR儀、免疫印跡凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(Beckman公司).

1.1.4 引物 實(shí)驗(yàn)中所用引物均由蘇州泓訊生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將WT接種于2 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基中，置于搖床中37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液.次日，按1∶100的比例將種子液轉(zhuǎn)接至20 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期(A600為0.4左右).

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，按7×105mL-1的細(xì)胞密度接種于六孔板中，加入150 μg·L-1PMA誘導(dǎo)48 h，THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞.

表1 qPCR特異性引物名稱及序列Tab.1 Specific primer names and sequences used for qPCR

1.2.3 細(xì)胞感染 實(shí)驗(yàn)前1 h吸去培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS洗滌2次后加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液.按MOI為20∶1的比例感染巨噬細(xì)胞，加入WT菌株的時(shí)間點(diǎn)記為0 h；細(xì)菌感染1 h后，每孔加入100 mg·L-1慶大霉素殺死胞外細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，每孔棄去一半培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至不同時(shí)間點(diǎn).TRAIL抗體處理實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為3組，細(xì)菌感染細(xì)胞前1 h即未加入細(xì)菌時(shí)，第1組細(xì)胞加入TRAIL抗體，其終濃度為500 μg·L-1，作為實(shí)驗(yàn)組，第2組細(xì)胞加入無(wú)菌PBS，作為對(duì)照組；前2組細(xì)胞均加入細(xì)菌感染，第3組細(xì)胞加入等量新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液，不加入細(xì)菌，作為未感染組；感染2 h更換一半新培養(yǎng)液時(shí)，補(bǔ)充一半抗體，使其終濃度保持不變.

1.2.4 RNA-seq WT感染THP-1細(xì)胞0 h、4 h和26 h時(shí)，棄去培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS洗滌2次，用Trizol法提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.

1.2.5 qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 取2 μg RNA，Oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.以β-actin作為內(nèi)參基因，相對(duì)定量法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，對(duì)RNA-seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.實(shí)驗(yàn)有3次以上生物學(xué)重復(fù).

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 WT感染THP-1細(xì)胞0 h、6 h和24 h時(shí)收集細(xì)胞，Annexin V FITC/PI染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，操作過(guò)程嚴(yán)格按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)有3次以上生物學(xué)重復(fù).

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 WT感染THP-1細(xì)胞0 h、6 h、24 h時(shí)，棄去培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS洗滌2次后，加入RIPA裂解液冰上裂解，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上清液進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè).

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 8.0、SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn).P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平

取S.Typhi感染THP-1細(xì)胞0 h、4 h和26 h后的RNA樣本進(jìn)行RNA-seq，將4 h和26 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別與0 h比較，篩選出與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)且存在變化的基因(表2).進(jìn)一步使用qPCR對(duì)RNA-seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.qPCR結(jié)果顯示caspase-3、caspase-8在4 h表達(dá)未有明顯變化，26 h表達(dá)水平顯著增加(圖1A、1B)，caspase-9在4 h表達(dá)下降，26 h表達(dá)水平增加(圖1C)，Tnfsf10(編碼TRAIL蛋白)、Tnfrsf10b(編碼DR5蛋白)、Tnf、Fas在4 h、26 h均出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)錄增加(圖1D～1G).RNA-seq中caspase-9在4 h表達(dá)基本無(wú)變化，caspase-3、Fas基因26 h表達(dá)略有下降，與qPCR結(jié)果存在差異，其余基因驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq一致.以上數(shù)據(jù)表明TRAIL、TNF、FAS三條外源性凋亡通路在感染早期和后期均發(fā)生不同程度的激活.

注：*:P<0.05，**:P<0.01，ns:P>0.05圖1 qPCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)Fig.1 Expression of apoptosis-related genes in THP-1 cells was detected by qPCR

2.2 S. Typhi誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡

S.Typhi感染THP-1細(xì)胞0 h、6 h和24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況.結(jié)果如圖所示，S.Typhi感染6 h和24 h后，細(xì)胞凋亡較未感染(0 h)時(shí)明顯增加，24 h細(xì)胞凋亡率較6 h也明顯增多(圖2A、2B，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，說(shuō)明S.Typhi能夠誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡，且隨著感染時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡越明顯.

注：*:P<0.05，**:P<0.01圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡(A)及其統(tǒng)計(jì)結(jié)果(B)Fig.2 Apoptosis rate in THP-1 cells was detected by flow cytometry (A)and its statistical results (B)

凋亡相關(guān)蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，上游caspase蛋白特異性剪切激活下游底物蛋白，進(jìn)而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用.通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9剪切條帶的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，S.Typhi未感染細(xì)胞(0 h)時(shí)，三個(gè)蛋白未發(fā)生剪切活化，細(xì)菌感染THP-1細(xì)胞6 h和24 h時(shí)均檢測(cè)到三個(gè)蛋白的剪切條帶，24 h caspase-3、caspase-9剪切條帶明顯強(qiáng)于6 h，表明S.Typhi感染細(xì)胞后激活外源性、內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)其凋亡，感染后期細(xì)胞凋亡明顯增加，此結(jié)果與前述qPCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致.

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)caspase-3、caspase-8、caspase-9剪切蛋白的水平Fig.3 Levels of cleaved caspase-3，caspase-8 and caspase-9 detected by western blot

表2 RNA-seq 凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化Tab.2 Expression changes of apoptosis-related genes in RNA-seq

2.3 S. Typhi激活TRAIL信號(hào)通路

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)S.Typhi感染細(xì)胞0 h、6 h和24 h后TRAIL信號(hào)通路中死亡配體TRAIL和其受體DR5的表達(dá)情況.結(jié)果如圖4所示，S.Typhi未感染細(xì)胞(0 h)時(shí)TRAIL幾乎不表達(dá)，細(xì)菌感染后TRAIL的表達(dá)顯著增加，DR5蛋白表達(dá)水平較未感染時(shí)也明顯增加，但未呈時(shí)間依賴性.以上結(jié)果表明S.Typhi感染THP-1細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)TRAIL信號(hào)通路的激活.

圖4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)TRAIL及其受體DR5的蛋白水平Fig.4 Protein levels of TRAIL and its receptor DR5 detected by western blot

2.4 TRAIL抗體處理減少THP-1細(xì)胞凋亡

在S.Typhi感染細(xì)胞前1 h加入TRAIL抗體(anti-TRAIL Ab)來(lái)結(jié)合活化的TRAIL蛋白，另外未加菌感染和加無(wú)菌PBS作為對(duì)照.S.Typhi感染THP-1細(xì)胞6 h時(shí)，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，加入TRAIL抗體處理后凋亡相關(guān)蛋白caspase-3剪切條帶明顯減弱(圖5)，凋亡細(xì)胞數(shù)量也明顯下降(圖6A、6B，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義).以上結(jié)果表明TRAIL抗體通過(guò)結(jié)合活化的TRAIL蛋白，一定程度上阻斷了TRAIL凋亡通路的激活，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)一步證實(shí)了S.Typhi能夠激活TRAIL信號(hào)通路，且TRAIL信號(hào)通路在S.Typhi誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用.

注：未感染組為未加S.Typhi感染，為陰性對(duì)照；PBS為S.Typhi感染細(xì)胞前1 h加入無(wú)菌PBS，為對(duì)照組；anti-TRAIL Ab為S.Typhi感染細(xì)胞前1 h加入TRAIL抗體，為實(shí)驗(yàn)組.圖5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)TRAIL抗體處理后caspase-3的剪切水平Fig.5 Level of cleaved caspase-3 after TRAIL antibody treatment detected by western blot

注：未感染組為未加S.Typhi感染，為陰性對(duì)照；PBS為S.Typhi感染細(xì)胞前1 h加入無(wú)菌PBS，為對(duì)照組；anti-TRAIL Ab為S.Typhi感染細(xì)胞前1 h加入TRAIL抗體，為實(shí)驗(yàn)組；*:P<0.05，**:P<0.01.圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRAIL抗體處理后THP-1細(xì)胞凋亡變化(A)及其統(tǒng)計(jì)結(jié)果(B)Fig.6 Apoptosis rate changes in THP-1 cells after TRAIL antibody treatment detected by flow cytometry (A)and its statistical results (B)

3 討論

S.Typhi感染每年可引起2 000多萬(wàn)病例，導(dǎo)致40多萬(wàn)人死亡[13]，在人口密度大、醫(yī)療衛(wèi)生落后的國(guó)家和地區(qū)，S.Typhi感染仍然是值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[14].S.Typhi屬于糞口傳播致病菌，進(jìn)入機(jī)體后突破胃酸屏障，粘附并入侵小腸上皮細(xì)胞，而后被巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞吞噬，在胞內(nèi)生存增殖，引起全身系統(tǒng)性感染.

沙門(mén)菌感染機(jī)體過(guò)程中巨噬細(xì)胞是其重要的宿主細(xì)胞.沙門(mén)菌可以抑制巨噬細(xì)胞凋亡，有利于細(xì)菌在宿主內(nèi)更好的增殖和生存，也可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，逃避機(jī)體的免疫識(shí)別，同時(shí)將凋亡細(xì)胞作為載體擴(kuò)散到全身，造成機(jī)體的持續(xù)性感染.

沙門(mén)菌感染細(xì)胞后抑制細(xì)胞凋亡已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道.沙門(mén)菌T3SS-1分泌的效應(yīng)蛋白AvrA具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，通過(guò)乙?；种平z裂原活化蛋白激酶4/7(MKK4/7)水平的JNK通路激活，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用.鼠傷寒沙門(mén)菌感染小鼠腸上皮IEC6細(xì)胞、骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞時(shí)，AvrA能夠抑制其凋亡，AvrA缺陷可引起全身細(xì)胞因子反應(yīng)強(qiáng)烈、上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞凋亡增加[15].沙門(mén)菌感染細(xì)胞后也可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，逃避機(jī)體的免疫識(shí)別，減少炎癥反應(yīng).沙門(mén)菌T3SS-1分泌的雙功能效應(yīng)蛋白SipA能夠促進(jìn)宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合，在鼠傷寒沙門(mén)菌感染RAW264.7細(xì)胞早期激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]；S.Typhi感染巨噬細(xì)胞后TNF-α和其受體結(jié)合激活caspase-8、caspase-3介導(dǎo)外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

本研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[5]一致，檢測(cè)到Tnf、caspase-3、caspase-8轉(zhuǎn)錄水平和caspase-3、caspase-8蛋白水平表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明外源性途徑在凋亡過(guò)程中發(fā)揮了重要作用.然而文獻(xiàn)[5]中S.Typhi感染THP-1細(xì)胞8 h后未檢測(cè)到caspase-9的增加，加入caspase-9抑制劑后細(xì)胞凋亡未發(fā)生明顯變化，認(rèn)為caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑不參與凋亡過(guò)程，本研究中卻檢測(cè)到細(xì)菌感染細(xì)胞26 hcaspase-9表達(dá)顯著增加，感染6 h和24 h caspase-9剪切條帶明顯增強(qiáng)，猜測(cè)可能是caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮的作用弱于外源性途徑，以至于加入caspase-9抑制劑未對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生較大的影響.此外，文獻(xiàn)[5]中通過(guò)S.Typhi標(biāo)準(zhǔn)菌株感染巨噬細(xì)胞8 h使用比色法檢測(cè)caspase-9含量，其MOI感染比例、感染時(shí)間、檢測(cè)方法以及所使用菌株均與本研究不同，這些因素對(duì)結(jié)果存在差異也產(chǎn)生一定影響.

本研究中，S.Typhi感染細(xì)胞早期，THP-1細(xì)胞凋亡發(fā)生較弱，可能感染前期細(xì)菌表達(dá)的組分如莢膜多糖等或分泌的效應(yīng)蛋白能夠抑制巨噬細(xì)胞凋亡，從而保證細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量增殖；隨著感染時(shí)間增加，細(xì)胞凋亡逐漸增強(qiáng)，這也使得在感染后期，胞內(nèi)增殖的細(xì)菌可以釋放至細(xì)胞外，繼而引起持續(xù)性和系統(tǒng)性感染.

TRAIL屬于Ⅱ型跨膜蛋白，C端在胞膜外，N端在胞膜內(nèi)，在特異性蛋白酶作用下，TRAIL蛋白胞外區(qū)域被剪切為可溶性分子存在于細(xì)胞外液中，TRAIL蛋白和DR4/5介導(dǎo)的外源性凋亡通路在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面已經(jīng)有廣泛研究.TRAIL通過(guò)降解sigma1受體激活caspase-8、caspase-3誘導(dǎo)人前列腺細(xì)胞凋亡[16]；喹啉和TRAIL協(xié)同作用增強(qiáng)線粒體凋亡通路介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡[8].然而，TRAIL在細(xì)菌感染中的作用尚不清楚.TRAIL與受體蛋白的親和力與溫度有關(guān)，37 ℃時(shí)TRAIL對(duì)DR5表現(xiàn)出極強(qiáng)的親和力，對(duì)DR4蛋白的親和力較弱[17]，且RNA-seq中編碼DR4的基因未有明顯變化，因此本研究通過(guò)S.Typhi感染THP-1細(xì)胞檢測(cè)TRAIL及其受體DR5蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)S.Typhi感染巨噬細(xì)胞激活細(xì)胞TRAIL信號(hào)通路，猜測(cè)S.Typhi的某種組分如LPS、Vi莢膜多糖、鞭毛蛋白等或細(xì)菌分泌的某種效應(yīng)蛋白被宿主細(xì)胞識(shí)別，細(xì)胞接收胞外凋亡信號(hào)，促進(jìn)TRAIL和受體的結(jié)合，激活TRAIL通路介導(dǎo)的凋亡.加入TRAIL抗體結(jié)合剪切活化的TRAIL蛋白阻斷TRAIL信號(hào)通路后，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡作用減弱，再次表明TRAIL通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著一定作用.

沙門(mén)菌LPS激活炎性通路后能夠激活細(xì)胞產(chǎn)生外源性刺激物TNF-α等，可以激活TNF通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，LPS還可以上調(diào)細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.羊肺炎支原體莢膜多糖誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞凋亡，上調(diào)Fas和FasL蛋白表達(dá)，caspase-8剪切條帶增強(qiáng)激活外源性凋亡途徑，促進(jìn)ROS生成及氧化應(yīng)激，破壞線粒體膜完整性、線粒體膜電位下降，進(jìn)而激活內(nèi)源性途徑[18].新生隱球菌莢膜多糖激活Fas-FasL通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，caspase-8直接或通過(guò)Bcl2家族蛋白放大凋亡信號(hào)間接激活caspase-3[19].沙門(mén)菌鞭毛蛋白可以促進(jìn)原代人巨噬細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞等死亡，以RIP1依賴的方式增加Fas、TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20-21].病原菌通過(guò)自身結(jié)構(gòu)組分激活TNF、Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡已有一定的研究，S.Typhi何種組分或效應(yīng)蛋白介導(dǎo)TRAIL通路的激活尚未可知，有待于深入探究和討論.

綜上所述，S.Typhi感染巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且TRAIL通過(guò)DR5受體激活外源性信號(hào)通路在S.Typhi誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，本研究對(duì)進(jìn)一步了解沙門(mén)菌的致病機(jī)制提供了一定的思路.