廣東省甘薯根結線蟲的鑒定

羅 梅，陳欣瑜，張新新，陳勝勇，董章勇，黃立飛

（1仲愷農業(yè)工程學院農業(yè)與生物學院，廣州 510225；2廣東省農業(yè)科學院作物研究所，廣東省農作物遺傳改良重點實驗室，廣州 510640；3湛江市農業(yè)科學研究院，廣東湛江 524094）

0 引言

甘薯(Ipomoea batatas)是中國重要的糧食作物之一，年產量僅次于水稻、小麥和玉米[1]。近年來，中國甘薯年種植面積約660萬hm2，總產量約1億t，約占世界總產量的80%[2]。廣東省是中國重要的鮮食型甘薯產區(qū)，統(tǒng)計面積15萬hm2左右，居全國第4位。廣東省氣候溫暖潮濕，甘薯病蟲害發(fā)生嚴重，對生產常常造成重大損失。根結線蟲(Meloidogynespp.)是公認的一類分布廣泛、危害最嚴重的一類植物寄生線蟲病害[3-4]，可寄生包括單子葉植物、雙子葉植物、草本植物和木本植物等已超過3000種植物，經濟危害極大，是糧食作物、蔬菜、果樹和觀賞植物上的重要病原生物。常見的有南方根結線蟲(M.incognita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)和北方根結線蟲(M.hapla)。近年來，象耳豆根結線蟲在中國南方地區(qū)報道嚴重危害蔬菜果樹等多種植物，并時有新寄主報道危害[5-7]。近年來，在廣東省粵西的吳川、遂溪、廉江、雷州、電白等多個縣市，粵東地區(qū)陸豐市和海豐縣甘薯產地發(fā)現(xiàn)了一種新的甘薯根結線蟲病害。該病害蔓延迅速，嚴重影響鮮食甘薯的產量和商品品質，并且呈現(xiàn)逐年嚴重的趨勢。本研究對廣東省粵東的陸豐、海豐和粵西的遂溪、吳川、廉江、雷州等地采集的甘薯薯塊帶有明顯癥狀的樣品進行分離，通過對其2齡幼蟲、雌成蟲及會陰花紋特征對其進行形態(tài)學鑒定，并利用根結線蟲鑒定引物進行分子鑒定，以期為甘薯根結線蟲病害的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：2018—2020年自廣東省粵東的陸豐、海豐和粵西的遂溪、吳川、廉江、雷州等地甘薯種植基地采集薯塊帶有明顯根結的甘薯樣本，帶回實驗室進行病原線蟲分離。

1.2 方法

1.2.1 根結線蟲病的田間癥狀觀察 觀察田間發(fā)病株的情況，并將其拔出查看發(fā)病情況；將發(fā)病薯塊清洗后觀察，并用小刀切開發(fā)病部位進行拍照。

1.2.2 根結線蟲病原分離和形態(tài)學鑒定 取帶有明顯根結的甘薯薯塊樣品，自來水洗凈后于體視解剖鏡下用挑針挑取雌成蟲和卵塊。將挑取的卵塊放入裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化2天獲取2齡幼蟲。

參考常規(guī)的方法[8]進行制作雌成蟲的會陰花紋。在Olympus顯微鏡下觀察根結線蟲的雌成蟲、雌蟲會陰花紋、2齡幼蟲的形態(tài)特征并拍照，同時進行形態(tài)測量，每個特征觀察20條蟲。

1.2.3 根結線蟲病病原種類的分子生物學鑒定 DNA提取按照Liao等[9]的方法，提取的DNA直接用于PCR或保存于-20℃待用。選用根結線蟲鑒定引物#C2F3(5′-GGTCAATGTCAGAAATTTGTGG-3′)和#1108(5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′)[10]進行擴增 mtDNA(Mitochondrial DNA)的COⅡ(cytochromeoxidaseⅡ)和lrRNA(lr ribo nucleic acid)基因間序列。按照以下反應體系進行：模板 DNA 1.5 μL，2×PCR buffer for KOD FX 12.5 μL，dNTPs(2 mm)5 μL，引物各 1 μL，KOD FX 0.5 μL，加H2O至25 μL。反應參數(shù)：94℃預變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸2 min，共35個循環(huán)；68℃延伸5 min。退火后將PCR管取出。放置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆没蜻M行電泳。

2 結果與分析

2.1 根結線蟲的田間癥狀

田間發(fā)病的甘薯植株地上部因根部受害，地上部分生長緩慢或停滯，發(fā)育不良，節(jié)間縮短，葉片發(fā)黃，植株直立狀；地下部結薯少，薯塊小，薯塊根毛少，根毛有蟲癭和根結，薯塊表面粗糙不整齊，薯塊表面有斑點或者許多米粒狀凸泡，呈深褐色圓暈。剖視凸泡，內有乳白色粒狀物，為病原雌蟲（圖1）。

圖1 甘薯根結線蟲田間發(fā)病癥狀

2.2 甘薯根結線蟲病病原種類的形態(tài)學鑒定

各地樣品都分離到了同一類型線蟲，雌蟲蟲體膨大呈梨型，頭冠高，有明顯突出的頸；口針細長，基部球粗大明顯，卵圓形；會陰花紋整體卵圓形或橢圓形，線紋大多細且較平滑，背弓圓形至方形，中等至較高；尾尖區(qū)環(huán)紋不規(guī)則，側線不明顯。2齡幼蟲蠕蟲形；體環(huán)小而清晰，唇盤略高于中唇；口針纖細，基部球圓，與桿部分界明顯，邊緣向后傾斜；尾部至尾端漸變細，末端鈍圓，透明區(qū)明顯（圖2）。其測量值范圍（表1）與形態(tài)特征均與文獻[11]報道的象耳豆根結線蟲描述相符。

圖2 廣東省甘薯根結線蟲病病原的形態(tài)特征

表1 甘薯根結線蟲測量值（湛江吳川）

2.3 分子生物學檢測

用引物C2F3和1108對提取的甘薯根結線蟲的DNA進行擴增，PCR產物得到一條約750 bp的序列，進一步證明其為象耳豆根結線蟲。

3 討論

甘薯根結線蟲病廣泛分布于全世界，在中國主要分布在遼寧省沈陽市、遼南地區(qū)，吉林省通化市，山東省的青島市、淄博市、威海市、煙臺市，浙江省的麗水市，福建省的福州市、南平市等地危害最重[12]。長期以來甘薯根結線蟲病害在廣東省不常見，然而近年來甘薯根結線蟲病害卻發(fā)生越來越嚴重，且與傳統(tǒng)的發(fā)病癥狀不相同，發(fā)病地塊，一般減產20%～40%，重者減產80%以上，甚至全田無收。本研究利用形態(tài)學比較及分子生物學相結合的方法，確認了發(fā)生在廣東省粵西和粵東甘薯主產區(qū)根結線蟲病是由象耳豆根結線蟲引起的，與Gao等[13]報道在湛江樣品檢測到的甘薯根結線蟲病相一致。

在中國常見的引起甘薯根結線蟲病有南方根結線蟲、花生根結線蟲和北方根結線蟲。危害甘薯最重的根結線蟲是南方根結線蟲?；ㄉY線蟲可導致甘薯薯塊壞死，但在大多數(shù)甘薯品種上無法產卵，不能完成其生活史。北方根結線蟲(M.hapla）喜冷涼，主要分布在溫帶地區(qū)和一些熱帶的高海拔地區(qū)，是中國遼寧省和吉林省為害甘薯的優(yōu)勢種群[14-16]。象耳豆根結線蟲引起的根結線蟲病害癥狀與過去報道甘薯根結線蟲的癥狀明顯不同[14-16]。象耳豆根結線蟲克服了抗南方根結線蟲的Mi-1和N抗性基因，導致原來的一些抗病品種喪失抗性[17]。由象耳豆根結線蟲引起的根結線蟲病害廣泛分布于廣東省粵東粵西甘薯主產區(qū)，嚴重影響甘薯產業(yè)的發(fā)展。

圖3 甘薯根結線蟲mtDNA的COⅡ/lrRNA間序列電泳圖

本試驗以廣東省多地的甘薯根結線蟲樣本為材料，將其鑒定為象耳豆根結線蟲。甘薯根結線蟲病發(fā)病嚴重時在地上部分雖然會表現(xiàn)出癥狀，但是其主要危害癥狀是在地下部分，故常常導致病害的誤判，因此甘薯根結線蟲的識別與防控顯得尤為重要。國外有部分甘薯抗根結線蟲的品種在選育[18-19]，國內急需調查引起甘薯根結線蟲病的線蟲種類和優(yōu)勢種群，防治象耳豆根結線蟲進一步擴散蔓延，做好種薯種苗的檢驗檢疫，篩選低毒高效的藥劑，并盡快開展選育抗性品種。