GFI1B在急性髓系白血病中表達(dá)及對臨床療效的評估

張志敏，劉鑫艷，張永梅，潘志蘭，周 潔，林鳳茹

獨(dú)立生長因子1B(growth factor-independent 1B， GFI1B)是一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，位于人類基因組9q34.13[1]。GFI1B基因主要表達(dá)于胎兒、成人的紅系和巨核系，是兩系生成和分化過程中一種必需的轉(zhuǎn)錄因子，故其表達(dá)水平的高低與急性白血病、T細(xì)胞淋巴瘤、重型再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[2]。急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是髓系造血干/祖細(xì)胞惡性疾病，以骨髓和外周血中原始和幼稚髓細(xì)胞異常增生為特征[3]。目前有關(guān)GFI1B基因在AML中的表達(dá)規(guī)律及其與患者臨床特征之間的關(guān)系報道較少[4]，本研究通過分析AML患者GFI1B表達(dá)及與其病情、預(yù)后的關(guān)系，以期研究GFI1B的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 回顧性分析2018年5月—2020年3月本院收治的AML患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：均由臨床、血常規(guī)、骨髓象確診為AML[5]；病例資料完整；年齡<80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他血液系統(tǒng)疾病者；合并心、肝、腎等器官和系統(tǒng)嚴(yán)重疾病或惡性腫瘤者；妊娠期和哺乳期女性、精神障礙者。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)最終納入106例AML為觀察組，男61例，女45例；年齡26～78(43.52±5.73)歲；AML類型：M1型28例、M2型22例、M5型21例、M4型20例、M6型10例，M7型5例；另選取同期在本院進(jìn)行體檢的健康者100例為對照組，男性51例，女性49例；年齡27～77(43.54±5.78)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1檢測儀器及試劑：以實時熒光定量PCR儀(PQ-PCR)及超敏CRP檢測儀(PQ-CRP)檢測GFI1B mRNA的表達(dá)并進(jìn)行動態(tài)觀察，熒光分析儀(ABI-5700)購自美國PE公司，PQ-PCR引物合成、熒光探針合成、PQ-PCR用dNTP、5×PQ-PCRbuffer購自廣東達(dá)安臨床檢驗中心，PCR引物合成購自北京賽百盛公司。

1.2.2檢測方法：①細(xì)胞分離、總RNA提?。撼槿?組新鮮外周血4 ml，肝素(107 U/L)抗凝，加Ficoll淋巴細(xì)胞分離液4 ml，離心(2000 r/min)20 min分離出單個核細(xì)胞，0.9%氯化鈉注射液洗滌3次。采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA，1 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀顯示28 S和18 S兩條清晰的條帶，顯示提取完整的RNA。②cDNA的合成：逆轉(zhuǎn)錄體系20 μl，包括細(xì)胞總RNA 1 μg，隨機(jī)引物500 ng，RNA酶抑制劑25 U，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μl，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U。37℃、60 min，94℃、5 min，1℃、2 min終止反應(yīng)。③GFI1B正向引物：5'-TCTGGCCTCCTGCCCTTAC-3'，GFI1B反向引物：5'-CCGGCTCTCGTTTGAGGTT-3'，GFI1B探針序列：5'-FAM-CCGGTGCCCAGAGACCAGGC-TAMRA-3'GFI1B擴(kuò)增片段長度為117 bp。④RQ-PCR反應(yīng)：待測樣本和陽性標(biāo)準(zhǔn)品按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：反應(yīng)體系50 μl，包括5×定量PCR buffer 10 μl，上游引物F(10 pmol/μl)1 μl，下游引物R(10 pmol/μl)1 μl，探針(5 pmol/μl)1 μl，dNTPs(10 mmol/L)1 μl，Taq酶(3 U/μl)1μl，cDNA或陽性標(biāo)準(zhǔn)品1 μl，ddH2O34 μl。擴(kuò)增條件為：93℃、3 min，然后93℃、30 s，55℃、45 s，共40循環(huán)。⑤產(chǎn)物的定量分析：反應(yīng)結(jié)束后，任選4～5個陽性模板標(biāo)準(zhǔn)梯度點(diǎn)分析，若相關(guān)系數(shù)r2>0.97，表明線性關(guān)系良好，可確定為定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣本熒光定量反應(yīng)的絕對定量值，即為目的基因的表達(dá)水平。

1.2.3療效判斷：參考《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第4版)評估。①完全緩解(CR)：臨床無白血病細(xì)胞浸潤的癥狀和體征；血紅蛋白≥100 g/L(男性)或≥90 g/L(女性)，中性粒細(xì)胞絕對值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，外周血無白血病細(xì)胞；骨髓中原始細(xì)胞≤5%。②部分緩解(PR)：骨髓中原始細(xì)胞5%～20%，或臨床、血常規(guī)中有一項未達(dá)到CR標(biāo)準(zhǔn)。③未緩解(NR)：骨髓象、血常規(guī)及臨床表現(xiàn)未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4復(fù)發(fā)難治白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：①復(fù)發(fā)性AML定義為CR后外周血再次出現(xiàn)白血病細(xì)胞或骨髓中原始細(xì)胞>5%(除鞏固化療后骨髓再生等其他原因外)或出現(xiàn)白血病髓外浸潤。②難治性AML:經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)治療2個療程后未達(dá)到CR的初診患者；CR后經(jīng)過鞏固強(qiáng)化治療6個月內(nèi)復(fù)發(fā)者；6個月后復(fù)發(fā)但經(jīng)常規(guī)化療無效者；2次或多次復(fù)發(fā)者；髓外白血病持續(xù)存在者。

1.3隨訪方法 觀察組進(jìn)行為期6個月的隨訪，隨訪方式包括電話隨訪、門診復(fù)查[7]；隨訪截止時間為2020年9月，了解預(yù)后情況。

2 結(jié)果

2.1GFI1B表達(dá)水平比較 2組GFI1B表達(dá)水平分別為觀察組(0.76±0.12)×106拷貝/μl cDNA、對照組(0.06±0.01)×106拷貝/μl cDNA。觀察組GFI1B表達(dá)水平高于對照組(P<0.01)。

2.2CR、PR及難治復(fù)發(fā)的AML患者GFI1B表達(dá)比較 經(jīng)化療后，CR 30例，PR 49例，難治復(fù)發(fā)27例。CR AML患者治療前后GFI1B的表達(dá)水平分別為(0.75±0.14)×106拷貝/μl cDNA、(0.13±0.02)×106拷貝/μl cDNA，PR AML患者治療前后GFI1B的表達(dá)水平分別為(0.78±0.11)×106拷貝/μl cDNA、(0.42±0.09)×106拷貝/μl cDNA，難治復(fù)發(fā)AML患者治療前后GFI1B表達(dá)水平分別為(0.74±0.16)×106拷貝/μl cDNA、(0.78±0.15)×106拷貝/μl cDNA。與治療前比較，CR和PR AML患者治療后GFI1B表達(dá)水平顯著降低，且CR患者低于PR和難治AML復(fù)發(fā)者，PR AML患者低于難治復(fù)發(fā)AML患者(P<0.05，P<0.01)。難治復(fù)發(fā)AML患者治療前后GFI1B表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3觀察組預(yù)后情況 截至隨訪結(jié)束，觀察組106例中生存61例、死亡45例，生存率57.55%，病死率為42.45%。

2.4單因素分析 年齡、性別與AML患者預(yù)后生存無關(guān)(P>0.05)，白細(xì)胞水平、髓外浸潤、危險度分型、達(dá)CR所需療程數(shù)、查爾森合并癥指數(shù)(CCI)評分及GFI1B表達(dá)水平為AML患者預(yù)后生存的危險因素(P<0.05)。見表1。

表1 影響AML預(yù)后生存的單因素分析[例(%)]

2.5多因素分析 經(jīng)非條件多因素Logistic回歸模型分析得，有髓外浸潤、CCI評分≥2分及GFI1B表達(dá)≥0.5×106拷貝/μl cDNA是影響AML患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響AML預(yù)后生存多因素Logistic回歸分析

3 討論

AML初始的標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療方案可使緩解率達(dá)50%以上[7]。但仍有部分患者終將復(fù)發(fā)，一旦復(fù)發(fā)病死率顯著增加。年齡、髓外浸潤、CCI評分、白細(xì)胞水平、免疫分型等均對AML預(yù)后存在一定影響[8]。本研究結(jié)果顯示，髓外浸潤、CCI評分是影響預(yù)后生存的獨(dú)立危險因素，與既往研究一致[9]。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一批與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的基因，針對癌基因的分子靶向治療也取得重要進(jìn)展[10]。AML是造血干細(xì)胞的異常增殖和成熟障礙所致，且是一個多步驟多基因參與的過程，因此該病發(fā)生的第一步往往是由于控制細(xì)胞生長的基因表達(dá)異常或其編碼蛋白功能異常[11]。調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)化最常見的一類基因是以轉(zhuǎn)錄因子形式起作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常，GF正是這類基因[12]。1993年，Gilks等在大鼠T細(xì)胞淋巴瘤的MOMULV的整合位點(diǎn)上第一次發(fā)現(xiàn)了GFl1基因[13]。GFI1B是GFI1家族的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，GFI1B可加速T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)展；同時由于GFI1B也表達(dá)于造血干細(xì)胞，其對維持造血干細(xì)胞的自我更新活性及功能完整性尤為重要[14]。此外，近年基因打靶實驗揭示了GFI1B在中性粒細(xì)胞分化中也發(fā)揮著重要作用。

動物研究顯示，GFI1B缺乏的小鼠不能生成成熟的紅細(xì)胞，而在這些小鼠的肝臟中紅系和巨核系生成的前體物質(zhì)增多，這表明GFI1B在紅系和巨核系的生成和分化中起了重要的作用，并且GFI1B在造血干細(xì)胞中表達(dá)，以不依賴與紅細(xì)胞生成素的方式誘導(dǎo)紅系的生成[1,15-16]。2006年Ahmet等首次報道了GFI1B在急性白血病中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，尤其是在AML患者中表達(dá)顯著增高[17-18]。本研究結(jié)果顯示，觀察組GFI1B表達(dá)水平高于對照組，同時在療效滿意AML患者中GFI1B水平呈下降趨勢，這與既往結(jié)果一致。有力地佐證了GFI1B可參與AML的發(fā)生，并可為臨床療效評估提供了有效依據(jù)。有研究認(rèn)為GFI1B基因不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期依賴激酶抑制物p2l Wafl/Cip的產(chǎn)生和表達(dá)，使細(xì)胞滯留在G0期，還能與GFl1基因相互作用使細(xì)胞癌變，故GFI1B基因表達(dá)水平高的AML病死率較高[19-20]。本研究結(jié)果顯示，GFI1B表達(dá)是影響AML預(yù)后生存的獨(dú)立危險因素，這提示進(jìn)行GFI1B基因的監(jiān)測對AML預(yù)后有著重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，GFI1B在AML患者中呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)異常升高者預(yù)后死亡風(fēng)險更高，臨床可加強(qiáng)對AML患者GFI1B的動態(tài)監(jiān)測，以提高生存率。本研究不足之處在于納入病例數(shù)較少，未來需擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)一步驗證。