益生菌對(duì)斷奶鼠消化酶活力、腸道運(yùn)動(dòng)性及粘膜形態(tài)的影響

劉 飛，郝婧宇，段素芳,3，司徒文佑,3，洪維鍊，劉偉賢，趙子夫, ，霍貴成

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；2.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，伊利母嬰營(yíng)養(yǎng)研究院，北京 100022）

人體內(nèi)定殖的微生物，其多樣性和數(shù)量會(huì)隨著機(jī)體年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，在機(jī)體2～3歲時(shí)幾乎成型。成人腸道中（主要是結(jié)腸）定殖著數(shù)量級(jí)約為1014的細(xì)菌，人消化道內(nèi)容物中的菌群密度在空腸和回腸近端約為103～104CFU/g，回腸遠(yuǎn)端約為107～108CFU/g，升結(jié)腸約為1011～1012CFU/g[1]，編碼的基因數(shù)量是人體的100～150倍[2]。一旦腸道菌群失調(diào)，腸道內(nèi)環(huán)境紊亂，益生菌減少，人體便開始出現(xiàn)各種不適癥狀甚至引發(fā)疾病[3]。定殖于消化道的細(xì)菌與寄主及其它腸道微生物一起在免疫調(diào)節(jié)[4]和通過腸-肝-腦軸對(duì)整個(gè)機(jī)體健康產(chǎn)生作用[5]。與成人相比，兒童屬于特殊群體，由于其腸道發(fā)育不完善，腸道蠕動(dòng)也比成人弱，腹肌的推動(dòng)力更是不足，這些原因造成食物通過比較慢，很容易引起消化不良。而且，兒童腸道菌群易受多種外部因素的影響而導(dǎo)致紊亂，從而阻礙其腸道功能的正常發(fā)揮，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不良甚至引發(fā)其他疾病[6]。

益生菌、維生素和植物提取物成為保健食品工業(yè)的三大新寵。以乳桿菌和雙歧桿菌為代表的益生菌用于維護(hù)腸道健康，已有較長(zhǎng)的安全使用歷史，益生菌已形成成熟的市場(chǎng)，全球大約有5億消費(fèi)者，歐洲的年增長(zhǎng)率達(dá)到15%。中國(guó)益生菌市場(chǎng)的增長(zhǎng)更為迅猛，2016年市值為500億元，據(jù)估計(jì)到2022年將達(dá)到1450億元。益生菌又稱微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、生態(tài)制品、活菌制劑，是指一類通過添加到食品或藥品中，能夠起到調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，從而對(duì)人或動(dòng)物產(chǎn)生有利影響的微生物[7]。益生菌已成為最受消費(fèi)者歡迎的膳食補(bǔ)充劑[8]，以健康改善和疾病預(yù)防的形式被健康人日常消費(fèi)。健康者使用益生菌的益處有緩解腸胃綜合征[9]，強(qiáng)化免疫[10]，預(yù)防感染性疾病[11]，預(yù)防心臟及代謝性疾病[12]，通過腸-肝-腦軸改善精神及行為健康以及促進(jìn)健康[13?14]，促進(jìn)消化道蠕動(dòng)[15]。益生菌在人腸粘膜的定殖，有明顯的個(gè)體、部位和菌株特異性，可將個(gè)體分為“易定殖”和“抗定殖”兩類，并可對(duì)粘膜菌群組成/功能和人腸道基因表達(dá)產(chǎn)生短暫而不同的影響[7]。

因此，理想的腸道菌群被認(rèn)為是健康的前提，應(yīng)用益生菌和益生素維護(hù)腸道健康已成為消費(fèi)者的首選，但是，益生菌作為保健品，短期或持續(xù)使用對(duì)健康兒童腸道健康及消化功能的影響有待進(jìn)一步探討。乳雙歧桿菌BL-99和副干酪乳桿菌ET-22是分別從健康嬰兒和成人腸道中分離得到的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌株，課題組前期研究表明它們能夠調(diào)節(jié)宿主腸道菌群，具有通便和促進(jìn)消化的功效。而分離自酸面團(tuán)的植物乳桿菌299v是世界上有大量文獻(xiàn)報(bào)道的益生菌之一，臨床實(shí)驗(yàn)證明其可促進(jìn)胃腸道健康，特別是有研究表明母鼠食用植物乳桿菌299v能夠改善哺乳期大鼠幼鼠腸道屏障功能，促進(jìn)腸道生長(zhǎng)和功能[16]。因此，本研究分別以斷奶大鼠和小鼠為模型動(dòng)物，以植物乳桿菌299v作為對(duì)照菌株，評(píng)估乳雙歧桿菌BL-99和副干酪乳桿菌ET-22對(duì)成長(zhǎng)期動(dòng)物小腸運(yùn)動(dòng)性、消化酶活力和腸道組織形態(tài)的影響，為其將來在兒童食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性ICR小鼠 體重10～12 g，共24只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為11400700362050，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；SPF級(jí)雄性SD大鼠 體重40～60 g，共35只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為11400700362051，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；大、小鼠維持飼料，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為11002900042472北京科奧協(xié)力飼料有限公司；植物乳桿菌299v分離自酸面團(tuán)（DSM 9843）德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心；乳雙歧桿菌BL-99分離自健康嬰兒腸道（CGMCC No.15650）、副干酪乳桿菌ET-22分離自健康成人腸道（CGMCC No.15077） 中國(guó)普通微生物菌種保藏中心；胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；復(fù)方地芬諾酯 河南鼎昌藥業(yè)有限公司；活性炭粉 天津市方正試劑廠；阿拉伯樹膠 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

GL3202i-1SCN型電子天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；7080全自動(dòng)生化分析儀 日本日立公司；MiniH100金屬浴 美國(guó)賽洛捷克公司；UV-1500C紫外可見光分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；1-14K小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；E600光學(xué)倒置顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)分組 參考保健食品功能評(píng)價(jià)方法（2020年版）（征求意見稿）中的“十六、有助于消化功能檢驗(yàn)方法”中的方法[17]，采用小鼠進(jìn)行小腸運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)，其余指標(biāo)的檢測(cè)均采用大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。24只斷奶雄性SD大鼠和35只斷奶雄性ICR小鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)動(dòng)物房中，溫度22℃，濕度10%～60%，12 h明暗交替照明，由大小鼠維持飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只，包括空白對(duì)照組、乳雙歧桿菌處理組、副干酪乳桿菌組和植物乳桿菌處理組；將小鼠隨機(jī)分成5組，每組7只，包括空白對(duì)照組、模型組、乳雙歧桿菌處理組、副干酪乳桿菌組和植物乳桿菌處理組。大鼠和小鼠的3個(gè)益生菌處理組分別一次性灌胃1×109CFU/d的乳雙歧桿菌、副干酪乳桿菌副干酪亞種和植物乳桿菌。在每天灌胃之前分別將事先按照各益生菌處理組的種類和含量分裝好的菌粉溶解在8 mL生理鹽水中備用。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天灌胃0.5 mL，分別連續(xù)給予35 d（大鼠）和28 d（小鼠），空白對(duì)照組和模型組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)則灌胃0.5 mL生理鹽水，其中模型組僅在小腸運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)當(dāng)天灌胃復(fù)方地芬諾酯來抑制小鼠小腸運(yùn)動(dòng)性。稱量大鼠初始體重和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重，并計(jì)算整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠的體重增重。

1.2.2 小腸運(yùn)動(dòng)試驗(yàn) 小鼠灌胃28 d后進(jìn)行小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食16 h，自由飲水。于測(cè)定當(dāng)天按照1.2.1動(dòng)物飼養(yǎng)分組中的灌胃量各處理組小鼠最后一次給予受試樣品，30 min后模型組和各樣品組均灌胃復(fù)方地芬諾酯（0.025%），空白對(duì)照組灌胃同體積蒸餾水。給復(fù)方地芬諾酯30 min后，各組灌胃墨汁（5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠的水溶液）。給墨汁25 min后頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管。將小腸拉成直線，測(cè)量腸管長(zhǎng)度作為“小腸總長(zhǎng)度”，從幽門至炭末前沿的距離作為“炭末在腸內(nèi)推進(jìn)距離”，按下式計(jì)算炭末推進(jìn)百分率[17]。

1.2.3 大鼠剖檢取樣 大鼠灌胃35 d后進(jìn)行剖檢取樣，禁食24 h，自由飲水，采用乙醚麻醉后剖檢全部大鼠取樣。包括血樣、胃液、十二指腸液、空腸、回腸、肝臟、腎臟、脾臟、胰腺。

1.2.4 消化酶類的檢測(cè) 參照戴穎[18]的檢測(cè)方法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒分別檢測(cè)大鼠胃液中胃蛋白酶的活性、十二指腸液中胰蛋白酶和淀粉酶的活性，按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 血液指標(biāo)的檢測(cè) 將血液樣品在4℃下靜置1 h，隨后3000×g離心15 min，上清液即為血清[18]。隨后采用全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)大鼠血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、總膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的含量。

1.2.6 臟器稱重和臟器系數(shù)的計(jì)算 分別稱量大鼠肝臟、腎臟、脾臟、胰腺的質(zhì)量，隨后分別計(jì)算每只大鼠的臟器系數(shù)[19]。

式中，臟器重量分別為大鼠完整肝臟、腎臟、脾臟、胰腺的質(zhì)量，體重為對(duì)應(yīng)大鼠處死前的空腹體質(zhì)量，單位均為g。

1.2.7 組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)的檢測(cè) 取大鼠空腸和回腸進(jìn)行石蠟切片及HE染色后采用軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行形態(tài)觀察，包括腸絨毛高度（VH）、隱窩深度（CD）、絨毛高度/隱窩深度（V/C）值、腸壁厚度[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對(duì)小鼠腸道運(yùn)動(dòng)性的影響

益生菌對(duì)小鼠腸道運(yùn)動(dòng)性的影響見圖1。模型組應(yīng)用復(fù)方地芬諾酯人為減慢腸運(yùn)動(dòng)，由圖1可知，同模型組相比灌胃3種益生菌均能顯著提高小鼠腸道的墨汁推進(jìn)率，同模型組相比乳雙歧桿菌、副干酪乳桿菌和植物乳桿菌分別將墨汁推進(jìn)率提高了11.48%、12.12%和21.47%。

圖1 益生菌對(duì)小鼠腸道運(yùn)動(dòng)性的影響Fig.1 Effects of probiotics on intestinal motility of mice

復(fù)方地芬諾酯能夠直接作用于腸平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器，消除局部黏膜的蠕動(dòng)反射而減弱蠕動(dòng)，從而延長(zhǎng)腸內(nèi)容物與腸黏膜的接觸，使得腸內(nèi)水分吸收，大便變干，常被用于便秘小鼠模型的造模[21?22]。本研究結(jié)果表明乳雙歧桿菌、副干酪乳桿菌和植物乳桿菌都能不同程度地加快藥物性腸蠕動(dòng)減慢的運(yùn)動(dòng)性，顯著提高小鼠的腸道運(yùn)動(dòng)性。

2.2 益生菌對(duì)大鼠體重的影響

益生菌對(duì)大鼠體重的影響見圖2，在初始體重沒有顯著差異的前提下，經(jīng)5周益生菌灌胃處理，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的大鼠的最終體重和體重增重有不同程度的變化，其中灌胃乳雙歧桿菌和植物乳桿菌大鼠的體重和體重增重均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），同對(duì)照組相比體重分別增加了10.61%和6.00%，體重增重分別增加了13.33%和8.52%。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳雙歧桿菌BL-99和植物乳桿菌299v均能促進(jìn)宿主腸道運(yùn)動(dòng)性，此外，后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們還可以提高腸液中胰蛋白酶的活力，增加宿主動(dòng)物空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度的比值來改善宿主動(dòng)物的消化吸收功能。因此，灌胃雙歧桿菌BL-99和植物乳桿菌299v大鼠的體重增重均明顯高于對(duì)照組可能是由于以上這些因素引起的。

圖2 益生菌對(duì)大鼠體重的影響Fig.2 Effects of probiotics on intestinal body weight of rats

2.3 益生菌對(duì)大鼠消化酶類活性的影響

胃腸道中消化酶活性的高低可直接反映動(dòng)物對(duì)食物的消化能力，本研究中益生菌對(duì)大鼠胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力的影響見圖3。

圖3 益生菌對(duì)大鼠胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力的影響Fig.3 Effectsof probioticson pepsin activity,intestinal trypsin activity and amylase activity of rats

由圖3可知，與對(duì)照組比，益生菌對(duì)大鼠胃蛋白酶活性和腸液中淀粉酶活力沒有顯著影響，但是益生菌對(duì)大鼠腸液胰蛋白酶的活性具有顯著影響。灌胃乳雙歧桿菌和植物乳桿菌都能夠顯著增加大鼠腸液中胰蛋白酶活力（P<0.05），同對(duì)照組相比分別提高了28.76%和31.13%。然而副干酪乳桿菌干預(yù)卻對(duì)大鼠腸道胰蛋白酶活性沒有影響，這表明益生菌對(duì)宿主腸道胰蛋白酶活性的影響具有菌株特異性，但是其中具體的作用機(jī)制和影響因素仍需進(jìn)一步研究。

2.4 益生菌對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

2.4.1 益生菌對(duì)大鼠血清蛋白含量的影響 血清總蛋白可分為白蛋白和球蛋白兩類，血清蛋白具有維持血液正常膠體滲透壓和p H、運(yùn)輸多種代謝物、調(diào)節(jié)被運(yùn)輸物質(zhì)的生理作用和解除其毒性、免疫作用以及營(yíng)養(yǎng)作用等多種功能。在非病理狀態(tài)下，血清總蛋白高表明營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)較好，對(duì)于白蛋白典型反映了機(jī)體代謝功能和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，球蛋白一般處于正常狀態(tài)，極度感染可能出現(xiàn)偏高。益生菌對(duì)大鼠血清中蛋白含量的影響見圖4。

圖4表明除單獨(dú)灌胃乳雙歧桿菌之外，灌胃其它益生菌都能夠明顯提高大鼠血清中總蛋白和球蛋白的含量，同對(duì)照組相比，灌胃副干酪乳桿菌分別將總蛋白和球蛋白的含量提高了6.84%和8.80%，灌胃植物乳桿菌分別將總蛋白和球蛋白的含量提高了6.82%和9.12%。此外，灌胃副干酪乳桿菌還能夠提高大鼠血清中白蛋白的含量，同對(duì)照組相比提高了5.42%。

圖4 益生菌對(duì)大鼠血清總蛋白、白蛋白及球蛋白含量的影響Fig.4 Effectsof probioticson serum total protein,albumin and globulin of rats

2.4.2 益生菌對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響 血脂四項(xiàng)包括：總膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，反映了體內(nèi)的脂類代謝。益生菌對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響見圖5。

圖5 益生菌對(duì)大鼠血清脂類代謝物含量的影響Fig.5 Effects of probiotics on serum lipid metabolites of rats

由圖5可知，與對(duì)照組比，灌胃益生菌均會(huì)顯著（P<0.05）升高大鼠血清中總膽固醇和高密度脂蛋白的含量，其中灌胃乳雙歧桿菌分別將總膽固醇和高密度脂蛋白的含量提高了44.35%和22.92%，灌胃副干酪乳桿菌分別將總膽固醇和高密度脂蛋白的含量提高了28.23%和27.08%，灌胃植物乳桿菌分別將總膽固醇和高密度脂蛋白的含量提高了17.74%和12.50%；對(duì)甘油三酯和低密度脂蛋白含量的影響均不顯著。目前關(guān)于益生性乳酸菌對(duì)宿主血脂指標(biāo)影響的研究基本上都是利用高脂動(dòng)物模型以及超重和肥胖人群，結(jié)果一般也是益生菌干預(yù)能夠降低宿主血清中血脂指數(shù)中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白此三項(xiàng)指標(biāo)中部分指標(biāo)或全部指標(biāo)的含量[23?24]。但是罕見利用正常動(dòng)物模型，尤其是生長(zhǎng)期大鼠模型的相關(guān)研究。而本研究表明益生菌干預(yù)能夠顯著（P<0.05）提高生長(zhǎng)期正常大鼠血清中的總膽固醇和高密度脂蛋白的含量，對(duì)低密度脂蛋白和甘油三酯含量并沒有顯著影響。膽固醇是動(dòng)物體內(nèi)最豐富的固醇類化合物，它參與細(xì)胞膜的形成，還是合成膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料，激素可參與機(jī)體內(nèi)各種物質(zhì)的代謝，包括糖、蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)等代謝，對(duì)維持機(jī)體正常生理功能十分重要。而高密度脂蛋白對(duì)血管有保護(hù)作用，通常被人們稱為“優(yōu)質(zhì)膽固醇”[25?26]。因此對(duì)于正常動(dòng)物機(jī)體大多數(shù)組織來說，保證膽固醇的供給，維持其代謝平衡是十分重要的。結(jié)合本研究之前的體重增重結(jié)果分析，益生菌可能在維持成長(zhǎng)期大鼠的膽固醇代謝平衡的前提下，通過提高宿主血清中膽固醇的含量來調(diào)節(jié)激素的合成，從而提高機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)代謝水平，促進(jìn)體重增重。

2.5 益生菌對(duì)大鼠臟器重量和臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)又稱臟體比，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與其體重的比值。正常情況下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各臟器與體重的比值比較恒定。動(dòng)物染毒后，受損臟器重量可發(fā)生變化，導(dǎo)致臟器系數(shù)也發(fā)生相應(yīng)變化。益生菌對(duì)大鼠肝臟、脾臟、腎臟和胰腺重量和臟器系數(shù)的影響見表1。

由表1可知，同對(duì)照組相比，灌胃益生菌對(duì)大鼠肝臟、脾臟、腎臟和胰腺重量和臟器系數(shù)沒有顯著影響（P>0.05）。一般來說，臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。本研究中并沒有觀察到相關(guān)現(xiàn)象，這說明植物乳桿菌299v、乳雙歧桿菌BL-99和副干酪乳桿菌ET-22對(duì)宿主臟器沒有不良影響。

表1 益生菌對(duì)大鼠肝臟、脾臟、腎臟和胰腺重量和臟器系數(shù)的影響Table 1 Effects of probiotics on weight and organ coefficient of liver,spleen, kidney and pancreas of rats

2.6 益生菌對(duì)大鼠腸道組織形態(tài)的影響

2.6.1 益生菌對(duì)大鼠腸道形態(tài)指標(biāo)的影響 小腸絨毛高度和隱窩深度是反應(yīng)吸收功能的重要指標(biāo)，一般來說，絨毛高度越大，隱窩深度越淺，吸收能力越強(qiáng)。研究表明益生菌能夠促進(jìn)宿主的吸收功能，本研究中益生菌灌服四周后大鼠空腸和回腸組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，益生菌處理不同程度地對(duì)空腸和回腸的組織形態(tài)學(xué)都有積極的作用。同對(duì)照組相比，灌胃益生菌對(duì)空腸絨毛高度沒有顯著影響，灌胃乳雙歧桿菌能夠顯著降低空腸隱窩深度同時(shí)增加空腸腸壁厚度，其中空腸隱窩深度降低了17.14%，空腸腸壁厚度增加了21.49%；灌胃乳雙歧桿菌、副干酪乳桿菌和植物乳桿菌都能夠顯著增加腸絨毛高度/隱窩深度（Villus height to Crypt depth，V/C）值，其中V/C值分別增加了30.65%、19.35%和21.94%。益生菌處理對(duì)回腸組織形態(tài)學(xué)的影響較突出，同對(duì)照組相比，灌胃乳雙歧桿菌和植物乳桿菌明顯增加了回腸絨毛高度，回腸絨毛高度分別增加了13.40%和12.41%；所有益生菌處理組均能夠顯著（P<0.05）降低回腸隱窩深度同時(shí)顯著增加V/C值和回腸腸壁厚度，其中乳雙歧桿菌、副干酪乳桿菌和植物乳桿菌組的回腸隱窩深度分別降低了13.28%、18.29%和18.20%，回腸V/C值分別增加了30.21%、31.25%和35.94%，回腸腸壁厚度分別增加了21.14%、22.35%和27.51%。

圖6 益生菌對(duì)大鼠空腸和回腸腸道形態(tài)指標(biāo)的影響Fig.6 Effectsof different probiotics on intestinal morphology index of jejunum and ileum

2.6.2 益生菌對(duì)大鼠腸道組織學(xué)切片的影響 小腸絨毛需要擁有正常的結(jié)構(gòu)才能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)被充分消化吸收，因此本研究采用日本尼康倒置顯微鏡（10×10倍）對(duì)5周齡大鼠空腸和回腸腸道組織切片進(jìn)行觀察，其組織結(jié)構(gòu)變化情況分別見圖7和圖8。

由圖7可知，對(duì)照組空腸絨毛較細(xì)且長(zhǎng)度比益生菌組略短一些，隱窩深度也比益生菌組更大一些，腸壁厚度差異并不明顯。在所有益生菌組中，乳雙歧桿菌組的空腸絨毛較長(zhǎng)且排列整齊，隱窩也較淺且腸壁較厚一些。

圖7 益生菌對(duì)大鼠空腸絨毛、隱窩和腸壁的影響（100×）Fig.7 Effects of different probiotics on villus,crypt and intestinal wall of jejunum（100×）

由圖8可知，對(duì)照組回腸絨毛的長(zhǎng)度明顯比乳酸雙歧桿菌組和植物乳桿菌組短一些，而且對(duì)照組隱窩深度明顯大于所有益生菌處理組，同時(shí)腸壁的厚度也較所有益生菌處理組薄。在所有益生菌組中植物乳桿菌組回腸絨毛較長(zhǎng)且排列整齊、隱窩較淺、腸壁較厚一些。

圖8 益生菌對(duì)大鼠回腸絨毛、隱窩和腸壁厚度的影響（100×）Fig.8 Effectsof different probioticson villus,crypt and intestinal wall of ileum（100×）

3 討論與結(jié)論

胃腸運(yùn)動(dòng)性減弱與許多人類疾病有關(guān)，包括糖尿病、帕金森病、自閉癥和便秘型腸易激綜合征，它們的一個(gè)典型特征就是腸道菌群失調(diào)和有益微生物喪失[27]。腸道共生菌群對(duì)腸道感覺神經(jīng)元和肌間神經(jīng)元的正常興奮性至關(guān)重要。研究表明無菌小鼠空腸和回腸肌間神經(jīng)叢密度顯著降低，胃腸道肌肉收縮幅度明顯降低[28]。在無菌動(dòng)物模型中，各種益生菌已被證明能調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)[29]，而且同一益生菌種的不同菌株在腸道動(dòng)力方面表現(xiàn)出明顯的特異性差異[30?31]。Chandrasekharan等[15]研究表明，每天給小鼠灌胃1次鼠李糖乳桿菌GG（LGG），1周后可顯著增加排便頻率、減少腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，而且離體實(shí)驗(yàn)表明LGG還能夠顯著增強(qiáng)回腸肌肉收縮，其進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LGG可刺激腸肌間神經(jīng)叢產(chǎn)生活性氧，從而誘導(dǎo)腸肌間神經(jīng)元中MAPK 1磷酸化水平升高，促進(jìn)神經(jīng)分化、增加腸神經(jīng)肽生成，增加神經(jīng)元中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)來提高小鼠腸道的運(yùn)動(dòng)性，LGG可能通過這些途徑來增加患者的胃腸動(dòng)力。本研究也發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌BL-99、副干酪乳桿菌ET-22和植物乳桿菌299v都能夠顯著提高小鼠的腸道運(yùn)動(dòng)性。

目前對(duì)于乳酸菌的益生功能的研究已相當(dāng)成熟，但對(duì)其促進(jìn)宿主消化吸收功效的研究仍相對(duì)較少。乳酸菌具有維持宿主機(jī)體腸道菌群平衡、分解食物中碳水化合物和蛋白質(zhì)、合成維生素、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[18]。也有一些關(guān)于乳酸菌改善宿主生長(zhǎng)性能的研究報(bào)道。張琳[32]發(fā)現(xiàn)微膠囊化的糞腸球菌能夠顯著提高肉雞的生長(zhǎng)性能，郭元晟[33]也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳酸桿菌F-6和干酪乳酸桿菌Zhang能夠改善肉雞的生產(chǎn)性能，而曹瑋娜等[34]則發(fā)現(xiàn)在飲水中添加107CFU/mL植物乳桿菌能夠能提高獺兔的生長(zhǎng)性能。此外，黃玉軍[35]等發(fā)現(xiàn)灌胃鼠李糖乳桿菌grx10和發(fā)酵乳桿菌f5能夠顯著提高高脂大鼠的腸道淀粉酶活力，但是對(duì)腸道胰蛋白活力無顯著影響。本研究卻發(fā)現(xiàn)灌胃乳雙歧桿菌、植物乳桿菌都能夠顯著提高大鼠的體重增重，同時(shí)提高大鼠腸液中胰蛋白酶活力而對(duì)腸液淀粉酶和胃液中胃蛋白酶活力無顯著影響。這可能是益生菌能夠增加大鼠腸道菌群中產(chǎn)蛋白酶相關(guān)菌屬的豐度，從而提高胰蛋白酶的活力，進(jìn)而改善宿主的生長(zhǎng)性能，后續(xù)仍然需要進(jìn)一步采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)宿主腸道菌群進(jìn)行分析來確認(rèn)。

絨毛和隱窩作為小腸絨毛的基本結(jié)構(gòu)，是衡量小腸消化吸收的重要指標(biāo)。絨毛高度影響小腸吸收面積，絨毛高度越高，越有利于機(jī)體對(duì)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隱窩深度反映細(xì)胞的生成率，隱窩基部可以不斷的分化細(xì)胞，以此彌補(bǔ)絨毛上皮的正常脫落。隱窩細(xì)胞生長(zhǎng)速率同時(shí)影響著腸絨毛的生長(zhǎng)與萎縮，隱窩越淺說明細(xì)胞成熟率越高，吸收能力越強(qiáng)[20]。V/C值則綜合反映小腸的功能狀態(tài)，比值下降，表示消化吸收功能下降；比值上升，則表示消化吸收能力增強(qiáng)[36]。本研究發(fā)現(xiàn)灌胃益生菌會(huì)顯著提高大鼠空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度的比值，從而提高大鼠的消化吸收功能，其中特別是乳雙歧桿菌組和植物乳桿菌組分別具有最大的空腸和回腸V/C值及腸壁厚度。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌BL-99和植物乳桿菌299v能夠通過促進(jìn)宿主腸道運(yùn)動(dòng)性，提高腸液中胰蛋白酶的活力，增加宿主動(dòng)物空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度的比值來改善宿主動(dòng)物的消化吸收功能，在提高宿主動(dòng)物的體重增重的同時(shí)并不會(huì)帶來不良影響。因此，基于乳雙歧桿菌BL-99和植物乳桿菌299v良好的益生特性，將來可將它們應(yīng)用于制作發(fā)酵乳制品、益生菌制劑甚至醫(yī)藥等領(lǐng)域，從而促進(jìn)人類健康。