基于聚類分析的白茶高效液相色譜指紋圖譜研究

王世博，寧洪鑫，黃龍?jiān)?，姚薛超，李祎亮，侯文彬,

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

白茶為我國(guó)六大茶類之一，屬于微發(fā)酵茶，主要產(chǎn)地為福鼎、政和、建陽(yáng)和松溪，以福鼎白茶品質(zhì)最佳[1?2]。白茶為我國(guó)特有品種，其制備工藝簡(jiǎn)單，有效地保留了茶葉中的營(yíng)養(yǎng)成分，富含維生素，氨基酸、茶多糖、茶多酚、茶色素、黃酮、生物堿等，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3?5]?，F(xiàn)代研究表明白茶有很好的三降三抗（降血壓、降血脂[6]、降血糖[7]、抗氧化[8?10]、抗腫瘤[11]、抗輻射[12?13]）的作用，還可以抗真菌[14]、解酒[15]、清除自由基[4]、調(diào)節(jié)神經(jīng)紊亂[16]和延緩衰老[17]。

近年來(lái)白茶相關(guān)研究不斷增加[5]，目前的研究主要有：白茶制備工藝[18?19]，化學(xué)成分組成與鑒定，白茶藥理作用和衍生產(chǎn)品研究、開(kāi)發(fā)[20?22]等。白茶質(zhì)量控制和鑒別以感官評(píng)判為主，缺乏客觀性。有學(xué)者將白茶作為組合研究對(duì)象，進(jìn)行了香氣成分鑒別[23]及指紋圖譜初探[24?26]。關(guān)于白茶HPLC指紋圖譜的系統(tǒng)研究尚不完善，其鑒別方法亟待提高。

本文采用中藥指紋圖譜與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)白茶多組分復(fù)雜體系進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[27]，可以提供豐富的鑒別信息，便于白茶及其衍生產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與研究。試驗(yàn)主要收集12批不同品種、年份的白茶進(jìn)行研究，建立白茶的高效液相的指紋圖譜，對(duì)12批白茶進(jìn)行成分分析和聚類分析，為白茶的質(zhì)量控制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12批白茶樣品 按照GB/T30766-2014《茶葉分類》[28]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理，分別研磨過(guò)40目篩，放置于密封、干燥、溫度20℃條件下儲(chǔ)藏備用，樣品的種類屬性見(jiàn)表1；乙腈、甲醇 色譜純，天津康科德公司；乙酸 色譜純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG） 批號(hào)：111987-201501，中國(guó)食品藥品檢定研究所；表兒茶素（EC）批號(hào)：110878-200102，中國(guó)藥品生物制品檢定所；表沒(méi)食子兒茶素（EGC） 批號(hào)：DST190703-038，樂(lè)美天醫(yī)藥德思特生物；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG） 批號(hào)：DST191107-036，樂(lè)美天醫(yī)藥德思特生物；沒(méi)食子酸（GA） 批號(hào)：SDT190715-008，純度≥98.0%，樂(lè)美天醫(yī)藥德思特生物；咖啡堿（CAF） 批號(hào)：C11693000，純度≥98.0%，Ehrenstorfer，德國(guó)。

表1 茶葉樣品生產(chǎn)信息Table 1 Tea sample production information

Waters 2695-2998高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3數(shù)據(jù)工作站 美國(guó)Waters公司；KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SQP十萬(wàn)分之一天平 賽多利斯；AX124ZH萬(wàn)分之一天平 奧豪斯；純水機(jī) 密理博；TD-5M低速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；HH-ZK-4智能數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 對(duì)照品溶液：稱取咖啡堿20 mg，EC、GA、EGC、ECG、EGCG各10 mg置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。量取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各1.0 mL于10 mL容量瓶，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，作為對(duì)照品溶液，備用。

供試樣品溶液：稱取茶葉樣品0.2000 g置于10 mL離心管中，加入經(jīng)70℃預(yù)熱過(guò)的70%的甲醇5 mL，并于70℃水浴中浸提10 min，隔5 min攪拌一次，轉(zhuǎn)移上清液于離心管中，殘?jiān)? mL的70%甲醇溶液提取，合并兩次提取液放至室溫，于3500 r/min條件離心10 min，取上清液置10 mL量瓶中，加入70%甲醇定容，搖勻。取上述溶液2.0 mL置于10 mL量瓶，用70%甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，作為對(duì)照品溶液，備用[29]。

1.2.2 白茶指紋圖譜建立 取12批白茶樣品在“1.2.1”條件制備成供試樣品溶液，進(jìn)行高效液相色譜指紋圖譜的分析。色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.5%乙酸；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)60 min。洗脫程序見(jiàn)表2。以咖啡堿的色譜峰為參照峰計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值。保存樣品液相色譜圖，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”軟件進(jìn)行處理，生成相應(yīng)的白茶高效液相色譜指紋圖譜。

表2 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 2 Program of HPLCgradient elution

1.2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

1.2.3.1 咖啡堿線性關(guān)系考察 精密稱取咖啡堿20 mg于10 mL容量瓶用70%甲醇定容，作為咖啡堿儲(chǔ)備液。吸取咖啡堿250、500、750、1000、1250μL于10 mL容量瓶用70%甲醇定容至刻度，搖勻，制得含量為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g·L?1濃度的咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定。

1.2.3.2 儀器精密度 稱取白茶樣品G9白牡丹，在“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6針，選取其中峰面積大的10個(gè)峰作為共有峰（下同），記錄10個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，以咖啡堿為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

1.2.3.3 穩(wěn)定性考察 稱取白茶樣品G9白牡丹，在“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、18、24 h按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄10個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，以咖啡堿為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

1.2.3.4 重復(fù)性考察 稱取白茶樣品G9白牡丹6份，在“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄10個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，以咖啡因?yàn)閰⒄辗?，?jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

1.2.3.5 高效液相色譜法的白茶指紋圖譜相似度的計(jì)算12批白茶的樣品在“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄茶葉樣品在258 nm條件下的色譜圖，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”進(jìn)行色譜峰匹配，色譜峰匹配條件設(shè)置為平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.5，通過(guò)多點(diǎn)校正進(jìn)行峰匹配，并計(jì)算樣品之間的相似度。

1.2.3.6 聚類分析 為進(jìn)一步考察不同批次間的差異，采用系統(tǒng)聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）對(duì)12批次白茶的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，觀察不同批次白茶間的差異。在SPSS18.0軟件中導(dǎo)入12批樣品相對(duì)峰面積，聚類法采用組間均聯(lián)法，選用夾角余弦為刻度距離作為分類依據(jù)[30]，分析不同白茶樣品之間的親疏程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法與色譜條件選擇分析

2.1.1 提取溶劑的選擇 分別選擇50%、60%、70%、80%、90%甲醇和50%、70%乙醇進(jìn)行提取溶劑篩選，考察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)采用50%、60%甲醇和50%乙醇時(shí)，白茶易漂浮于液面，浸提效果較差，故對(duì)70%、80%、90%甲醇和70%乙醇提取的樣品進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果如圖1所示，提取溶劑選用70%乙醇時(shí)，色譜分離度和峰形欠佳，選用70%、80%、90%甲醇作為提取溶劑，其色譜圖分離度和峰形俱佳，無(wú)明顯差異，從提取成本和環(huán)保的角度考慮，未選用80%甲醇與90%甲醇，最終選用70%甲醇作為本方法的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑考察的色譜圖Fig.1 Chromatogramsof different extraction solvent

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 理想的流動(dòng)相可以更好地分離化合物，首先對(duì)比甲醇-水和乙腈-水兩種流動(dòng)相，如圖2所示，可以看出乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰多，分離度好，進(jìn)而在乙腈-水體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，采用乙腈?0.5%乙酸作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，該條件峰形得到了進(jìn)一步改善，最終確定本法流動(dòng)相為乙腈?0.5%乙酸體系。

圖2 不同流動(dòng)相考察的色譜圖Fig.2 Chromatograms of different mobile phases

2.1.3 流動(dòng)相梯度考察 由于白茶提取成分多且復(fù)雜，性質(zhì)差別較大，因此，實(shí)驗(yàn)選用梯度作為流動(dòng)相的洗脫方式。對(duì)比了下述幾種梯度條件，梯度條件見(jiàn)表3，結(jié)果如圖3所示，可以看到圖3d的色譜圖中的色譜峰較多，峰形較佳，確定為本實(shí)驗(yàn)的梯度條件。

表3 高效液相色譜梯度考察Table 3 Program of HPLCgradient study

圖3 不同梯度考察的色譜圖Fig.3 Chromatogramsof different gradients

2.1.4 波長(zhǎng)的選擇 白茶中多酚類和生物堿類成分液相色譜的最大吸收波長(zhǎng)多集中在270～280 nm之間，以270～280 nm為軸，選取240、258、270、280、300 nm幾個(gè)波長(zhǎng)，結(jié)果如圖4所示，258 nm時(shí)基線平穩(wěn)，色譜峰較多，容易分辨。經(jīng)綜合考慮確定以258 nm作為本方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖4 不同波長(zhǎng)考察的色譜圖Fig.4 Chromatograms of different wavelengths

2.1.5 不同流速的考察 選取0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min，考察了不同流速對(duì)分析方法的影響，結(jié)果如圖5所示，隨著流速升高，出峰時(shí)間整體前移，流速在0.8 mL/min時(shí)出峰早，峰分離度較好。因此，本實(shí)驗(yàn)的液相方法中主體流速選擇0.8 mL/min。

圖5 不同流速的色譜圖Fig.5 Chromatogramsof different flow rates

2.1.6 柱溫的確定 經(jīng)考察柱溫為25、30、35℃時(shí)，色譜圖如圖6所示，色譜圖未見(jiàn)明顯差異，考慮到環(huán)境溫度的變化等因素，最終確定柱溫為35℃。

圖6 不同柱溫的色譜圖Fig.6 Chromatograms of different column temperatures

2.1.7 參比對(duì)照峰的選擇 參比對(duì)照峰的選擇通常以保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)，在指紋圖譜的測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)咖啡堿保留時(shí)間居中，且峰面積較大，故選取咖啡堿作為參比對(duì)照峰。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 咖啡堿線性關(guān)系 以峰面積為y軸，質(zhì)量濃度為x軸求得回歸方程為y=21031x+77833，r=0.9999，線性關(guān)系良好。

2.2.2 儀器精密度 精密稱取樣品G9，在“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄10個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，并以咖啡堿為參照峰計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，選取的10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于3%，色譜圖在“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”對(duì)主要色譜峰進(jìn)行匹配，相似度在0.999以上，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性考察 精密稱取樣品G9，在“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、18、24 h按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄10個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，并以咖啡堿為參照峰計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明選取的10個(gè)主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于5%，色譜圖在“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”對(duì)主要色譜峰進(jìn)行匹配，相似度在0.999以上，表示穩(wěn)定性較好。

2.2.4 重復(fù)性考察 白茶樣品G9經(jīng)粉碎后精密稱取6份，在“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄10個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，并以咖啡堿為參照峰計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明白茶色譜圖中選取的10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于3%，色譜圖在“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”對(duì)主要色譜峰進(jìn)行匹配，相似度在0.999以上，表明重復(fù)性良好。

2.3 指紋圖譜的建立

將白茶樣品所得的色譜圖以AIA的格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”，以G9為參照峰，進(jìn)行色譜圖疊加（圖7），選擇90%以上樣本中的共有峰為樣本的共有峰，在實(shí)驗(yàn)中以保留時(shí)間為18.23 min的11號(hào)峰（咖啡堿）為參照峰確立了28個(gè)共有峰（圖8），各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，但各共有峰相對(duì)峰面積的值較大，說(shuō)明不同品種、年份的白茶之間的差異較大（表4）。與對(duì)照品色譜圖對(duì)比，指認(rèn)出6個(gè)峰分別是峰2：GA；峰7：EGC；峰11：CAF；峰13：EC；峰14：EGCG；峰21：ECG（圖8）。

圖7 12份茶葉樣品的HPLC指紋圖譜Fig.7 HPLCfingerprints of 12 tea samples

圖8 茶葉樣品對(duì)照色譜峰Fig.8 Chromatographic peaks of tea sample control

2.4 相似度分析

將12批白茶樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”相似度軟件，均值法生成指紋圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜。12批白茶樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度在0.980～0.999之間，如表5，表明不同批次白茶成分組成一致，無(wú)顯著性差異。

表5 茶葉樣品的相似度Table 5 Similarity of tea samples

2.5 基于樣品28共有峰相對(duì)面積的聚類分析

如圖9所示，采用系統(tǒng)聚類分析法（HCA）對(duì)12批次白茶的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以峰11為參照峰計(jì)算28個(gè)峰的相對(duì)峰面積（見(jiàn)表4），將28個(gè)共有峰相對(duì)峰面積導(dǎo)入SPSS18.0軟件，觀察不同批次的白茶間的差異。聚類分析法采用組件均聯(lián)法，選用夾角余弦為刻度。結(jié)果表明，聚類分析將12個(gè)樣品分成了兩類，其中G1和G2為一類，其他10個(gè)樣品聚為一類。聚類分析表明各批次總體差異性較小，不同批次茶葉成分相對(duì)一致，差異較小，為白茶的研究奠定質(zhì)量控制的基礎(chǔ)，便于白茶及白茶相關(guān)產(chǎn)品的研究。

圖9 12批茶葉樣品系統(tǒng)分析樹(shù)狀圖Fig.9 Dendrograms of cluster analysis on 12 batches of tea samples

表4 12批茶共有峰的相對(duì)峰面積Table 4 Relative area of common peaks in 12 batches of tea

3 結(jié)論與討論

本文建立了白茶HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，經(jīng)對(duì)12批不同品種、不同年份白茶進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，12批白茶樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度在0.98以上，說(shuō)明12批白茶組成及含量基本一致，對(duì)圖譜中GA、CAF、EC、ECG、EGCG、EGC六個(gè)峰進(jìn)行成分確認(rèn)。該方法準(zhǔn)確、可靠，可為白茶的質(zhì)量控制和深度開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。研究之初，同時(shí)考察了壽眉的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)壽眉的某些兒茶素類成分如EGCG含量明顯低于其他三種白茶。故本指紋圖譜方法不適用于壽眉的鑒別。同時(shí)，本方法中共有峰多為茶多酚類物質(zhì)，今后的研究中應(yīng)關(guān)注到成分的廣譜性加以進(jìn)一步的考察。

通過(guò)對(duì)12批白茶樣品相對(duì)峰面積的聚類分析中發(fā)現(xiàn)G1和G2在檢測(cè)中被分為一類，分別為2013年的牡丹王和2014年的白牡丹，其他10種被分為一類。同時(shí)觀察不同批次、種類白茶外觀的差異，年份越久遠(yuǎn)白茶顏色越深，近幾年的白茶多為青綠色，陳年白茶多為棕褐色，與聚類分析的結(jié)果具有一定的相關(guān)性。筆者推測(cè)，茶葉中的茶多酚在存放過(guò)程中逐漸被氧化，使其中一些兒茶素類成分含量降低，生成茶黃素，故外觀相應(yīng)發(fā)生變化。