SPME-GC-MS與電子鼻結(jié)合分析不同酵母混菌發(fā)酵獼猴桃酒的揮發(fā)性香氣物質(zhì)

王鐵儒，郭 麗，馬 曼，王冰宜，魏新元，樊明濤

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）

獼猴桃富含VC、VB、VE等維生素和精氨酸、谷氨酸等氨基酸[1]，具有很高的營養(yǎng)價值。中國獼猴桃資源豐富，種植廣泛、產(chǎn)量大。陜西省是我國獼猴桃生產(chǎn)第一大省，獼猴桃也是陜西省的優(yōu)勢農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)[2]。獼猴桃鮮果上市時間集中，貯藏成本高，易腐爛[3]，因此加快加強其深加工產(chǎn)品研發(fā)有重要意義。獼猴桃酒的附加值高[4]，開展獼猴桃酒的研發(fā)可以解決一定范圍內(nèi)獼猴桃的滯銷腐敗問題，對產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有極大的推動作用。

獼猴桃酒營養(yǎng)豐富，有較強抗氧化功能，但仍存在揮發(fā)性香氣含量不足、特征不典型的問題[4]。酵母的選擇對酒體風味物質(zhì)有重要影響，而目前應用于獼猴桃酒生產(chǎn)的酵母菌株多為葡萄酒釀酒酵母[5]，因此仍需不斷探索獼猴桃酒釀造專用酵母。研究發(fā)現(xiàn)，相比釀酒酵母，非釀酒酵母可產(chǎn)生豐富的利于水解香氣前體物質(zhì)的糖苷酶[6]，同時，非釀酒酵母的某些代謝產(chǎn)物（如甘油、酯類等）能增加果酒獨特風味[7?8]，對其感官品質(zhì)有積極的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同酵母混合發(fā)酵的葡萄酒香氣成分組成及含量不同[9]，例如，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵葡萄酒，提升了酒體酯類的含量，增強了果香風味[10]；與單一釀酒酵母發(fā)酵相比，異常畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵顯著提高了葡萄酒中乙酸酯類的含量[11]；畢赤克魯維酵母混合發(fā)酵酒樣中揮發(fā)酸含量降低，高級醇和酯類物質(zhì)含量顯著提高[12]。目前，混菌發(fā)酵多應用于葡萄酒中，關(guān)于不同非釀酒酵母與釀酒酵母混菌釀造獼猴桃酒中的香氣成分差異相關(guān)的研究鮮有報道。

香氣特征是評價獼猴桃果實及其果酒品質(zhì)的重要指標之一，其影響著獼猴桃果酒的品質(zhì)和市場接受度[13]。固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）是研究果酒中揮發(fā)性香氣成分的主要方法。GC用于含復雜揮發(fā)性成分物質(zhì)的分離和分析，適用于定量分析；MS靈敏性高、定性強，適用于定性分析[14]。電子鼻也是一種常用的香氣檢測技術(shù)，它由特異性電子化學傳感器組成[15]。與其他技術(shù)相比，電子鼻無損、簡單、快速，并能提供足夠的數(shù)據(jù)來建立模式識別系統(tǒng)，應用于食品的鑒定和分析[16]。在香氣檢測研究方面，電子鼻可提供被測樣品的整體氣味信息，而GC-MS提供了樣品具體香氣化學成分。

因此，本研究利用三種不同非釀酒酵母（戴爾有孢圓酵母、耐熱克魯維酵母、發(fā)酵畢赤酵母）分別與釀酒酵母混合發(fā)酵獼猴桃酒，以這四種菌的單菌種發(fā)酵作為對照組，采用SPME-GC-MS和電子鼻技術(shù)結(jié)合的方法檢測其揮發(fā)性香氣物質(zhì)，并進行香氣感官評定。通過主成分分析（principal component analysis，PCA）探索不同非釀酒酵母釀造獼猴桃酒香氣特征的差異，利用偏最小二乘回歸分析（partial least square，PLS）探究GC-MS與電子鼻結(jié)合分析的擬合模型的準確性，旨在為適宜混菌釀造獼猴桃酒的非釀酒酵母菌株的選擇、酒體香氣的改善及快速檢測提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徐香獼猴桃 陜西省楊凌農(nóng)貿(mào)市場；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae）菌 株WLP775西北農(nóng)林科技大學食品學院；戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii，T. delbrueckii）菌株A25、耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans，K.thermotolerans）菌株R69、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans，P. fermentans）菌株Z9Y-3西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院；YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母浸出粉、蛋白胨、瓊脂粉、果膠酶（Macerozyme R-10）北京索萊寶科技有限公司； 2-辛醇（純度≥98%）上海麥克林生化科技有限公司。

DH-600電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；2000JP離心果汁機南通金橙機械有限公司；GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；手動固相微萃?。?0/30μm DVB/CAR/SPME）進樣器 美國Supelco公司；DB-17MS毛細管柱（60 m×250μm，0.25μm）美國Agilent公司；PEN3型便攜式電子鼻 德國Airsense公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng) 酵母菌株在YEPD固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48 h進行活化。挑取單菌落接種至YEPD液態(tài)培養(yǎng)基，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h制成種子液。

1.2.2 獼猴桃酒釀造工藝流程 獼猴桃→分選清洗→破碎榨汁→裝罐（60 mg/L SO2、50 mg/L果膠酶）→接入酵母→酒精發(fā)酵→倒罐→自然陳釀→澄清過濾→成品酒

1.2.3 操作要點

1.2.3.1 獼猴桃果實原料處理 選擇成熟度較好（軟硬適中），無腐爛發(fā)霉的獼猴桃，利用榨汁機帶皮打漿，打漿后的果汁中加入60 mg/L SO2和50 mg/L果膠酶，處理24 h后接入活化后的酵母進行酒精發(fā)酵。

1.2.3.2 酒精發(fā)酵 酵母接種方式分為：單一接種和混合接種，具體接種量、方式及樣品編號如下。

單一接種發(fā)酵的接種量為2×106CFU/mL，分別為編號WLP：只接種釀酒酵母WLP775；編號A25：只接種戴爾有孢圓酵母A25；編號R69：只接種耐熱克魯維酵母R69；編號Z9Y：只接種發(fā)酵畢赤酵母Z9Y-3。

混合接種發(fā)酵：先以1×106CFU/mL的接種量加入非釀酒酵母，發(fā)酵48 h后再接種1×106CFU/mL釀酒酵母WLP775，分別為編號A25D2：先接種戴爾有孢圓酵母A25發(fā)酵48 h后，再接種釀酒酵母WLP775；編號R69D2：先接種耐熱克魯維酵母R69發(fā)酵48 h后，再接種釀酒酵母WLP775；編號Z9YD2：先接種發(fā)酵畢赤酵母Z9Y-3發(fā)酵48 h后，再接種釀酒酵母WLP775。每種處理設置3個平行。獼猴桃汁分裝于2.5 L玻璃發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度18～20℃，靜置發(fā)酵7～9 d，待酒樣可溶性固形物含量連續(xù)3 d不變、還原糖含量降至6 g/L以下后結(jié)束主發(fā)酵。

1.2.3.3 陳釀 酒精發(fā)酵結(jié)束后，取出部分酒樣進行香氣檢測。進行倒罐澄清并陳釀，倒罐時添加SO2以抑制發(fā)酵。

1.2.4 SPME-GC-MC測定香氣成分 SPME條件：添加1 g NaCl于15 mL的固相微萃取專用萃取瓶中，準確吸取各酒樣5 mL，添加6μL 2-辛醇（質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL）作為內(nèi)標，密封后于40℃下平衡15 min，插入已老化的萃取頭萃取30 min，攪拌速率300 r/min。萃取結(jié)束后將進樣器插入頂空瓶中（深度22 mm），在40℃下放置10 min，收集揮發(fā)物進行GC-MS分析。

GC-MS條件[17]：進樣口溫度250℃；離子源溫度230℃；連桿溫度230℃。升溫程序：40℃，保持3 min；以4℃/min升至120℃；以6℃/min升至240℃；保持12 min。分流方式：不分流；載氣為氦氣（He），體積流量為1.0 mL/min。電子電離（electronic ionization，EI）源，電離電壓70 eV，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍35～500 amu。

1.2.5 香氣物質(zhì)的定性定量方法 定性定量：檢測出的未知化合物與NIST（national institute of standards and technology）質(zhì)譜庫和Wiley Library相匹配，選擇匹配度高的物質(zhì)作為有效香氣成分對比定性。使用內(nèi)標法進行半定量分析[13]，以2-辛醇為內(nèi)標物，通過比較待測組分與內(nèi)標物峰面積的比值，校正后計算出待測組分的質(zhì)量濃度。通過氣味活性值（odor active value，OAV）評價揮發(fā)性物質(zhì)對酒的香氣感官貢獻率，OAV=某香氣物質(zhì)濃度/該物質(zhì)感覺閾值。

1.2.6 電子鼻檢測 PEN3型電子鼻10個金屬氧化物傳感器的性能描述見表1。樣品稀釋50倍，量取5 mL置于30 mL專用進樣瓶瓶中，加蓋密封，室溫富集6 min后進行測試。電子鼻檢測時間60 s，預進樣5 s，清洗時間300 s，進樣流量300 mL/min，載氣流速300 mL/min[18]。

表1 PEN3電子鼻傳感器陣列及其性能描述Table 1 Sensors used in PEN3 electronic nose and their properties

1.2.7 香氣特征的感官分析 采用定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）方法，具體參照文獻方法[19]。由年齡在24～35歲之間的20名經(jīng)過培訓的釀酒專業(yè)人員（男女各半）對獼猴桃酒的香氣特征進行評價。每一供試酒樣重復分析2次。感官實驗中，樣品被隨機編碼并隨機分配。評價獼猴桃酒香氣的5個香氣感官屬性的描述定義為：花香（玫瑰，紫羅蘭，百合等），甜果（桃子，李子，杏等），酸果（蘋果，梨等），生青味（草，青豆味），脂肪（奶酪味）。品評員對香氣特征強度進行打分：0=無香氣特征，1=非常弱，2=弱，3=中等，4=強，5=非常強。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。使用SPSS 22.0進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），P<0.05表示差異顯著。使用GraphPad Prism 6.0軟件繪圖。使用Minitab 18.0對數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘（partial least square，PLS）回歸分析，使用逐一剔除法對回歸模型進行交叉驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME-GC-MS測定不同獼猴桃酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)

如表2所示，7種獼猴桃酒中共檢測出65種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括2種C6化合物、10種高級醇、3種苯乙基類化合物、5種乙酸酯、2種短鏈脂肪酸乙酯、6種中鏈脂肪酸乙酯、17種其他酯類、7種脂肪酸、3種萜烯類、1種呋喃物質(zhì)、2種酚類物質(zhì)、7種醛酮類物質(zhì)。其中，9種香氣成分的濃度與其嗅覺閾值的比值（OAV）大于1，13種香氣成分的OAV為0.1～1。7種獼猴桃酒中含量較高的前三類揮發(fā)性香氣物質(zhì)為：高級醇、中鏈脂肪酸酯、乙酸酯。因此，酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)對獼猴桃酒的整體香氣貢獻較大。

表2 獼猴桃酒中揮發(fā)性香氣成分測定結(jié)果Table 2 Determination results of volatile aroma components in kiwi wines

續(xù)表2

WLP酒樣檢測出52種香氣物質(zhì)，總質(zhì)量濃度為9618.52μg/L；A25、R69、Z9Y酒樣分別檢測出56、61、61種，總質(zhì)量濃度分別為8671.81、8295.67、6967.79μg/L；混菌發(fā)酵組A 25D2、R69D2、Z9YD2分別測出57、60、58種，總質(zhì)量濃度分別為9152.64、9687.96和8583.11μg/L（表3）；7種獼猴桃酒檢測出47種共有香氣物質(zhì)。不同非釀酒酵母的混合發(fā)酵酒樣中香氣化合物的種類、數(shù)量及含量不同，其中，R69D2香氣物質(zhì)含量最高。相比于WLP酒樣，非釀酒酵母及其混合發(fā)酵組的揮發(fā)性物質(zhì)種類、數(shù)量較豐富，包括正丁醇、正戊醇、乙酸異丁酯、丙酸乙酯、乳酸乙酯等。此外，相比于非釀酒酵母單一接種發(fā)酵，混合發(fā)酵均提高了酒體中香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

2.1.1 獼猴桃酒中醇類物質(zhì)分析 醇類是發(fā)酵酒風味物質(zhì)的主要來源，多為糖類或氨基酸經(jīng)酵母代謝產(chǎn)生，在適宜濃度下可以襯托酯香，促進香氣協(xié)調(diào)性[20]。本試驗將檢測到的醇類物質(zhì)具體分為高級醇、C6化合物、苯乙基類物質(zhì)，其中高級醇在各獼猴桃酒中種類最多、含量最高，質(zhì)量濃度在2676.45～4805.58 μg/L間（表3）。

表3 不同獼猴桃酒揮發(fā)性香氣成分的種類及含量Table 3 Types and contents of volatile aroma components in different kiwi wines

高級醇是果酒中重要的香氣物質(zhì)，在總量低于300 mg/L時能增加香氣的復雜性，賦予酒醇厚感。本研究中7種獼猴桃酒的高級醇含量均在300 mg/L以下。非釀酒酵母單菌發(fā)酵酒樣的高級醇含量低于釀酒酵母單一發(fā)酵，但在混合發(fā)酵后均有不同程度的提高，這與王媛等[21]的研究結(jié)果一致。與WLP相比，R69D2發(fā)酵酒的高級醇含量顯著提高（P<0.05），增強了酒體醇厚感。各酒樣中含量最高的高級醇為異戊醇，其具有蘋果白蘭地香氣[22]，是雜醇油的主要成分。A 25、A 25D2與WLP酒中3-甲硫基丙醇含量高（OAV>0.1），其被報道存在于水果、果酒、白酒中。Gil等[23]研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵酒中3-甲硫基丙醇的含量提高，賦予葡萄酒更強烈的果香。

C6化合物與萜烯類化合物均屬于品種香氣，其成分主要來源于果皮中香氣糖苷前體物質(zhì)的水解，對果酒的區(qū)域典型性起決定性作用[9]。獼猴桃酒中檢測到兩種C6化合物，分別為正己醇和反-3-己烯-1-醇。R69、R69D2發(fā)酵的獼猴桃酒中C6化合物含量顯著高于A25、A25D2（P<0.05），說明耐熱克魯維酵母和戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對品種香氣的影響有顯著差異，這與菌體代謝不同有一定關(guān)系。研究表明，發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵可提高己醇和（Z）-3-己烯-1-醇等C6化合物的含量[24]，本研究同樣證實了發(fā)酵畢赤酵母在混菌發(fā)酵中具有提高己醇含量的作用。

苯乙基類物質(zhì)賦予果酒花香和果香。獼猴桃酒中的苯乙基類物質(zhì)主要為苯乙醇，它是莽草酸衍生物，有玫瑰花香和薔薇香。多項研究表明，混合發(fā)酵對苯乙醇的形成有積極影響[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同非釀酒酵母混合發(fā)酵對獼猴桃酒中苯乙醇影響不同。其中，A25和A25D2酒樣苯乙醇含量顯著高于WLP和其他處理組（P<0.05），這可能是戴爾有孢圓酵母的β-葡萄糖苷酶與L-苯丙氨酸的代謝共同作用的結(jié)果[25]，且不同酵母產(chǎn)生的糖苷酶存在差異。

2.1.2 獼猴桃酒中酯類物質(zhì)分析 大多數(shù)酯類化合物具有水果和甜香味，對果酒香氣有積極的影響[26]。本研究7種處理酒樣中共檢測到乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯、中鏈脂肪酸乙酯及其他酯類等共30種酯類物質(zhì)。其中WLP、A 25、R69、Z9Y分別檢出27、27、28、28種酯類化合物，A25D2、R69D2、Z9YD2分別檢出26、29、26種。除A25D2酒樣外，辛酸乙酯是酯類中濃度最高的物質(zhì)，其在WLP、R69D2、Z9YD2中分別占香氣化合物總量的18.00%、8.83%、10.54%。如表3所示，A 25D2酒樣中乙酸酯含量最高，Z9YD2的短鏈脂肪酸乙酯含量顯著高于其他處理組（P<0.05），而WLP酒樣中的中鏈脂肪酸乙酯和其他酯類物質(zhì)含量較高。因此，不同酵母因其特異的生理活性和代謝過程，對酯類化合物影響不同。

乙酸酯具有草莓味、香蕉味、梨等果香和甜花香味。不同非釀酒酵母混菌發(fā)酵對酒樣中乙酸酯的生成影響不同。A 25D2酒中乙酸酯質(zhì)量濃度（2226.0 μg/L）最高，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯的含量均顯著高于R69D2與Z9YD2（P<0.05），說明三種非釀酒酵母中，戴爾有孢圓酵母在獼猴桃酒中產(chǎn)乙酸酯的能力較強，這可能與酯酶活性有關(guān)。2-甲基丁基乙酸酯具有最高的OAV（45.10～120.08），可以為獼猴桃酒帶來濃郁的蘋果、香蕉香氣。此外，部分研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵能提高果酒中乙酸酯的含量[24]。而本研究中發(fā)酵畢赤酵母對乙酸酯的提高作用不顯著，這可能因為獼猴桃酒發(fā)酵體系與葡萄酒差異較大，且混合發(fā)酵中所用釀酒酵母也會對非釀酒酵母產(chǎn)生一定抑制作用。獼猴桃酒中所檢測到的短鏈脂肪酸乙酯主要為丁酸乙酯（OAV>1），其具有淡淡的果香（菠蘿和香蕉）。Z9YD2中的短鏈脂肪酸乙酯質(zhì)量濃度顯著高于WLP對照組和其他混菌發(fā)酵組（P<0.05）。檢測到中鏈脂肪酸乙酯含量豐富，感覺閾值較低，香氣OAV>1，如己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯賦予了獼猴桃酒水果香、青蘋果香、橙子香、玫瑰花香、甜香。釀酒酵母單接種發(fā)酵酒的中鏈脂肪酸乙酯和其他酯類含量顯著高于其他處理組（P<0.05），其中4種物質(zhì)OAV遠高于其他處理酒樣。這與Lee等[27]研究結(jié)果類似，證實了非釀酒菌株能高效生產(chǎn)乙酸酯，而釀酒酵母單菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙基酯類和雜酯類含量較高。

2.1.3 獼猴桃酒中酸類物質(zhì)分析 脂肪酸濃度較低時呈奶油和奶酪香，可與醇類物質(zhì)反應形成酯類，協(xié)調(diào)、平衡酒體香氣[28]。Z9YD2酒樣中脂肪酸含量（484.68μg/L）顯著高于WLP和其他混菌發(fā)酵酒樣（P<0.05），說明其具有更濃郁的奶酪香。所有處理酒樣中脂肪酸的質(zhì)量濃度均低于1 mg/L，且含量最高的脂肪酸均為辛酸，其次為己酸、癸酸、異丁酸。辛酸常呈油性霉味和腐臭味，但當其濃度較低時，具有令人愉悅的奶酪香和水果香。癸酸具有愉快脂肪氣味，三個混菌發(fā)酵組中，A25D2酒樣癸酸質(zhì)量濃度最高（65.05μg/L），其次是Z9YD2（54.98μg/L）。整體來說，戴爾有孢圓酵母和發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵有利于提高獼猴桃酒脂肪酸含量。

2.1.4 獼猴桃酒中萜烯類物質(zhì)分析 萜烯類化合物由萜烯類香氣糖苷在酒精發(fā)酵過程中酶解釋放。本研究7種獼猴桃酒均檢出3種萜烯類物質(zhì)，具體為桉葉油醇、蘇合香烯、香茅醇，其中桉葉油醇含量在各處理組中均最高且其OAV>1。桉葉油醇賦予獼猴桃酒薄荷香氣和熱帶水果的甜香，香茅醇具有檸檬味、青草味、濃郁的薔薇香。趙寧等[20]研究表明，三種獼猴桃酒（徐香酒、海沃德酒、黃金果酒）中蘇合香烯僅存在于徐香酒中。王倩倩等[9]研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵顯著增強了葡萄酒的果香與花香，而且發(fā)酵畢赤酵母的接種比例升高有利于增加萜烯類化合物的含量。Z9YD2酒中萜烯類物質(zhì)總量最高，說明發(fā)酵畢赤酵母混菌發(fā)酵對獼猴桃酒萜烯類物質(zhì)具有積極的貢獻，這可能由于菌體產(chǎn)生了含量較高的糖苷酶，從而促進萜烯類糖苷前體酶解。相比于A 25，A25D2酒樣萜烯類化合物增加，提高了酒體的香氣復雜性和層次感，與祝霞等[29]研究結(jié)果一致。這可能因為不同的酵母混合后，混菌間互利作用，使酶系比例協(xié)調(diào)，產(chǎn)酶能力高于單一菌株。

2.1.5 獼猴桃酒中醛酮類、酚類和呋喃類物質(zhì)分析7種酒中共有醛酮化合物為乙醛，其可賦予獼猴桃酒果香味。WLP酒中檢測出乙醛和2-辛酮2種物質(zhì)，A 25、A25D2均檢出4種醛酮類物質(zhì)，R69、R69D2分別檢出6種、4種，Z9Y、Z9YD2分別檢出6種、4種。非釀酒酵母單菌種發(fā)酵酒中醛酮類化合物含量高于釀酒酵母。相比于釀酒酵母單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵在一定程度上提高了酒中醛酮類物質(zhì)的種類和含量。獼猴桃酒中檢測到對乙烯基愈瘡木酚和3,5-二叔丁基苯酚兩種酚類物質(zhì)，較高濃度苯酚類化合物具有類似藥的香氣[30]。對乙烯基愈瘡木酚具有香辛料香。此外，僅檢出2,3-二氫苯并呋喃一種呋喃類物質(zhì)，且其在A25和Z9Y酒樣中的含量顯著高于WLP（P<0.05）。

2.1.6 獼猴桃酒特征香氣分析 氣味活性值（odor activity value，OAV）是評價揮發(fā)性物質(zhì)對酒的香氣感官貢獻率的方法，當OAV>0.1時能夠一定程度增加酒體的香氣及協(xié)調(diào)性，當OAV>1時，說明該物質(zhì)可能對酒體香氣有直接影響，被確定為特征香氣物質(zhì)[31]。如表4所示，利用已報道的感覺閾值和香氣描述計算[12,20,24,32?35]，本實驗發(fā)酵獼猴桃酒共得到9種特征香氣物質(zhì)，分別為乙酸異戊酯、乙酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、桉葉油醇。這些物質(zhì)多為乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯和中鏈脂肪酸乙酯，具有花香和果香特征，與Zhao等[13]研究結(jié)果一致，證明果香、花香和甜味是獼猴桃酒的特征香氣。A 25和A25D2中乙酸異戊酯、乙酸己酯的OAV>1，且遠高于WLP，賦予了獼猴桃酒更濃郁的蘋果、草莓、梨等果香。2-甲基丁基乙酸酯、己酸乙酯、辛酸乙酯的OAV在WLP中相對較高，賦予酒體更強烈的玫瑰花香和果香。丁酸乙酯和桉葉油醇在Z9YD2中的OAV較高，賦予獼猴桃酒濃郁的薄荷香和果香。

表4 不同獼猴桃酒特征香氣成分OAV分析Table 4 OAV analysisof aroma characteristicsof kiwifruit wines

2.2 獼猴桃酒揮發(fā)性成分的主成分分析

為進一步分析不同酵母發(fā)酵的獼猴桃酒中香氣化合物的差異，對7種獼猴桃酒的不同類型香氣化合物進行PCA分析。PCA累計貢獻率越大，越能反映樣品的信息，樣品間坐標上距離越大，則差異越大[17]。由圖1可知，前兩個主成分累積貢獻率為63.2%（PC1占32.2%，PC2占31.0%），且不同處理酒樣能被很好地區(qū)分開。WLP與中鏈脂肪酸及其他酯類物質(zhì)相關(guān)，這與上述結(jié)論一致。PC1很好地將A25、A 25D2與R69、R69D2區(qū)分開，即A25和A 25D2分布在PC1的正向端，與苯乙基類化合物、乙酸酯、酸類、萜烯類物質(zhì)相關(guān)性高；R69與R69D2分布在PC1的負向端，與C6化合物及高級醇含量相關(guān)，同時，由圖可知，它們分離程度不高，說明耐熱克魯維酵母單一菌種發(fā)酵與混菌發(fā)酵的酒樣香氣差異不顯著，可能是由于耐熱克魯維酵母對釀酒酵母的某些代謝產(chǎn)物如乙醇等不耐受，導致菌體糖苷酶含量下降。Z9Y及Z9YD2分布于PC2負向端，與短鏈脂肪酸、萜烯類、呋喃及醛酮類物質(zhì)相關(guān)。

圖1 獼猴桃酒揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析Fig.1 Principal component analysisof volatile compoundsin kiwi wine

2.3 電子鼻傳感器響應值的主成分分析

對7種獼猴桃酒的電子鼻檢測結(jié)果進行PCA分析，如圖2A所示，PC1與PC2的貢獻率分別是54.8%、24.4%，前兩個主成分的總貢獻率為79.2%，表明這兩個主成分可代表酒樣揮發(fā)性風味的主要特征。各酒樣在坐標系上分離程度大，說明不同處理之間的差異較大。樣品的重復組存在小范圍波動，但整體重復效果好，每組樣品的數(shù)據(jù)均能獨立聚集成團。分值圖（圖2A）可體現(xiàn)不同酵母發(fā)酵獼猴桃酒間的差異，PC1上Z9Y、Z9YD2、R69D2位于正向端，WLP、R69、A 25、A25D2位于負向端；PC2上R69、Z9Y、A 25D2位于正向端，R69D2、Z9YD2、A 25位于負向端。結(jié)果表明，PCA方法可將電子鼻測得的風味物質(zhì)區(qū)分，不同非釀酒酵母發(fā)酵的酒樣風味差別明顯，混菌發(fā)酵與單一菌種發(fā)酵的風味物質(zhì)可明顯區(qū)分開。

圖2 獼猴桃酒的電子鼻主成分分析分值圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 Principal component analysis scorediagram (A)and load diagram (B)of electronic nose of kiwiwine

由圖2B與表1可知，Z9Y、Z9YD2香氣特性和其他酒樣的差異主要體現(xiàn)在烷烴、氫類和芳香型化合物上，R69、R69D2與其他酒樣的差異主要體現(xiàn)在甲基類物質(zhì)上，A 25、A25D2則主要體現(xiàn)在無機硫化物和萜烯類物質(zhì)上。結(jié)果表明不同非釀酒酵母所釀造獼猴桃酒的揮發(fā)性香氣特征差異明顯。因此，電子鼻可作為果酒香氣物質(zhì)的快速分析工具，可通過測定揮發(fā)性化合物的濃度來區(qū)分不同樣品，且與GCMS分析結(jié)果基本一致，證實了電子鼻作為獼猴桃酒揮發(fā)性物質(zhì)鑒定工具的有效性。

2.4 PLS回歸模型分析電子鼻預測獼猴桃酒揮發(fā)性成分的能力

如圖3所示，為進一步探究GC-MS與電子鼻所測定揮發(fā)性成分間的聯(lián)系，采用偏最小二乘回歸分析方法分析了電子鼻預測6類主要香氣物質(zhì)（高級醇、乙酸酯、短鏈脂肪酸酯、中鏈脂肪酸酯、脂肪酸及苯乙基類化合物）的能力。以揮發(fā)性物質(zhì)真實濃度為橫坐標，電子鼻響應值為縱坐標，根據(jù)電子鼻響應數(shù)據(jù)計算的PLS模型，得到6類香氣化合物的真實濃度與估計濃度之間的關(guān)系。響應圖中包含了真實值、驗證點、線性擬合方程與交叉驗證方程。據(jù)文獻報道，如果R2>0.7，校正模型可認為是穩(wěn)健模型[36]。6個PLS模型的R2均大于80%，因此，利用電子鼻數(shù)據(jù)計算的6類香氣物質(zhì)模型是可靠的。其中，乙酸酯（R2=94.1%）、短鏈脂肪酸酯（R2=94.8%）、中鏈脂肪酸酯（R2=88.4%）模型的R2val較高。結(jié)果表明，電子鼻對獼猴桃酒中揮發(fā)性成分尤其是酯類物質(zhì)濃度有良好的預測作用。

圖3 基于電子鼻數(shù)據(jù)模擬的PLS模型中6種主要揮發(fā)性成分的真實濃度與擬合濃度之間的關(guān)系Fig.3 Relationship between observed concentrationsand concentrationsestimated based on the PLS modelscalculated from e-nosedata

2.5 獼猴桃酒的香氣感官分析

如圖4所示，QDA結(jié)果進一步揭示了獼猴桃酒揮發(fā)性香氣成分與感官品質(zhì)的關(guān)系?；ㄏ愫凸悖ㄋ峁吞鸸┨卣髦?，A 25D2酒樣評分最高，其次是Z9YD2，這可能與酯類物質(zhì)（乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯）和苯乙基類化合物的增加有關(guān)。此外，相較于單一菌種發(fā)酵，混合發(fā)酵酒樣增強了獼猴桃酒的花香和果香特征。研究證實，花香和果香有利于提高果酒香氣復雜性[37]。C6化合物是果酒生青味的主要來源，R69和R69D2酒中C6化合物含量較高，而引入了不良的生青味。Z9YD2脂肪香氣特征評分高，與較高的脂肪酸含量濃度一致。因此，香氣感官差異可以歸因于獼猴桃酒中的某些芳香族化合物的種類和含量差異。

圖4 不同獼猴桃酒的感官Q(mào)DAFig.4 QDA analysis of sensory profiles of different kiwi wines

3 結(jié)論

本文主要研究不同非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對獼猴桃酒中揮發(fā)性成分的影響?？傮w來看，獼猴桃酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)中高級醇、乙酸酯、中鏈脂肪酸乙酯占比較高，混菌發(fā)酵進一步增強了酒體的醇香、酯香特征。在香氣物質(zhì)的數(shù)量上，非釀酒酵母的接種有利于酒體更多香氣化合物的生成；在香氣物質(zhì)的含量上，混菌發(fā)酵對不同種類揮發(fā)性成分的增強作用不同，其中，R69D2酒樣中香氣化合物總量最高（9687.96μg/L）。

不同酵母對獼猴桃酒揮發(fā)性成分影響差異較大。A25和A25D2酒中苯乙醇、乙酸酯含量高，對酒中花香、果香有重要貢獻；R69D2酒樣高級醇、C6化合物含量顯著提高，增強了酒體醇厚感；Z9Y、Z9YD2酒樣短鏈脂肪酸乙酯、萜烯類、呋喃類、酚類物質(zhì)、脂肪酸含量高，增加了酒體香氣復雜性和層次感；WLP酒樣中鏈脂肪酸乙酯和其他酯類含量高。這種酒體香氣特征差異性可能與酵母代謝有關(guān)，需進一步研究菌體特性。感官分析表明混合發(fā)酵增強了獼猴桃酒的花香和果香特征，提高了香氣復雜性。

主成分分析方法能很好地將不同酵母發(fā)酵的獼猴桃酒區(qū)分開?；赟PME-GC-MS及電子鼻的PLS回歸模型表明兩種檢測方法結(jié)合能夠更加快速、準確地評價獼猴桃酒的風味，這將為獼猴桃酒釀造酵母的選擇、揮發(fā)性香氣品質(zhì)的提升及檢測提供理論依據(jù)。