具有良好風味嗜熱鏈球菌的篩選及其產(chǎn)香特性分析

丹 彤，喬少婷，田佳樂

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）作為酸奶的常用發(fā)酵劑之一，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品加工中[1?2]。嗜熱鏈球菌在牛乳發(fā)酵和貯藏過程中可賦予產(chǎn)品優(yōu)良的質(zhì)地、豐富的營養(yǎng)價值和獨特的風味。一般認為嗜熱鏈球菌在牛乳發(fā)酵過程中能產(chǎn)生乳酸和一些主要羰基化合物，如乙醛、雙乙酰、乙偶姻等，可賦予產(chǎn)品獨特的風味[3]。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)始于上世紀50年代。在食品香氣成分分析研究中發(fā)揮著巨大的作用[4]。近年來，一些研究學(xué)者采用這項技術(shù)從發(fā)酵乳乳制品中檢測出多種風味物質(zhì)。王偉君等采用GC-MS等技術(shù)在嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中鑒定出雙乙酰、2,3-戊二酮等13種風味成分[5]。任為一等采用相同的方法從嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳檢測出3-甲基丁醛、（E）-2-戊烯醛、辛醛、己醛、（E）-己烯醛、庚醛等16種關(guān)鍵性風味化合物，并發(fā)現(xiàn)這些化合物對產(chǎn)品的風味影響較大[6]。

酸奶是消費者非常喜愛的一類具有豐富營養(yǎng)價值和獨特風味的發(fā)酵乳制品，然而，關(guān)于嗜熱鏈球菌在牛乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風味物質(zhì)的報道較少。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，以科漢森公司提供的商業(yè)發(fā)酵劑為對照組，以分離自蒙古國和中國甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、青海等少數(shù)民族地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的7株具有良好發(fā)酵特性的嗜熱鏈球菌為實驗菌株，采用SPME-GC-MS技術(shù)篩選出一株具有良好風味的菌株，并分析該菌株在牛乳發(fā)酵和貯藏過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風味化合物，為酸奶發(fā)酵劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本次實驗用菌株及其來源見表1；脫脂乳粉 美國New Zealand公司；酵母粉 美國Biosharp公司；全脂乳粉 美國Fonterra LTD公司；MRS液體培養(yǎng)基 美國Becton公司。

表1 實驗用菌株及其來源Table 1 Experimental strainsand their sources

7890B GC-5977A MSD型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱：HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）美國Agilent公司；手動固相微萃取進樣手柄，50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 在10%（w/w）脫脂粉乳粉培養(yǎng)基中添加以重量計0.1%酵母粉，在溫度115℃下滅菌7 min，得到活化培養(yǎng)基；按照以活化培養(yǎng)基體積比2%的接種量，把在?80℃冷凍保藏的嗜熱鏈球菌菌株接種于所述的活化培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)24 h，然后按照MRS液體培養(yǎng)基體積比2%的接種量，連續(xù)傳代培養(yǎng)3次，使其活菌數(shù)達到108CFU/mL以上[7?8]。

1.2.2 活菌計數(shù) 利用平板菌落計數(shù)法對菌株活菌數(shù)進行測定。取1.2.1中活化三代的嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液500μL于4.5 mL無菌生理鹽水（0.85%，w/w）中，充分混勻后吸取500μL液體于另一支4.5 mL無菌生理鹽水，重復(fù)該操作使菌液稀釋至適當濃度，從各試管中分別取100μL稀釋菌液，采用MRS固體培養(yǎng)基傾注法，于37℃倒置培養(yǎng)48 h，選取菌落分布適當?shù)钠桨暹M行活菌計數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵乳制備

1.2.3.1 全脂乳粉培養(yǎng)基的制備 11.5%（w/w）全脂乳粉培養(yǎng)基中添加以重量計6.5%蔗糖，連續(xù)均質(zhì)（60℃，20 MPa）2次，95℃滅菌5 min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.3.2 發(fā)酵條件 按照5×106CFU/mL接種量將活化后的嗜熱鏈球菌接種于滅菌后的全脂乳粉培養(yǎng)基中，42℃發(fā)酵，直到發(fā)酵乳的pH降低到4.5時，停止發(fā)酵，冷卻樣品，?20℃保存。所有樣品在相同的條件下進行3次平行實驗。

1.2.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

1.2.4.1 樣品前處理 將5 mL發(fā)酵乳裝入15 mL樣品瓶中，在溫度55℃下平衡10 min，然后將萃取頭（50/30μm DVB/CAR/PDMS）老化后插入樣品瓶中，萃取50 min，再插入氣相色譜儀進樣口，在270℃下解吸附3 min。

1.2.4.2 氣質(zhì)聯(lián)用條件 起始溫度35℃，保持5 min；以5℃/min升溫至140℃，保持5 min；再以10℃/min繼續(xù)升溫至250℃，保持5 min。載氣為He，流速1 mL/min；不分流進樣。

1.2.4.3 質(zhì)譜條件 電離方式EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍35～500 m/z，發(fā)射電流100μA，無溶劑延遲。

1.2.5 揮發(fā)性風味物質(zhì)的定性及定量分析 利用GC/MS工作站軟件Masshunter中自帶的NIST1.1標準庫對各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果進行自動檢索，利用面積歸一化法計算各組分的相對峰面積百分比，對組分進行相對定量檢測。

1.2.6 發(fā)酵乳感官評定 由10名經(jīng)過感官分析培訓(xùn)的人員組成評定小組，以中國乳制品行業(yè)規(guī)范RHB 103-2004中酸牛乳感官質(zhì)量評鑒細則為評定標準，對發(fā)酵乳的色澤、滋味氣味、組織狀態(tài)做出評價。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel、MetaboAnalyst 3.0網(wǎng)站進行多維統(tǒng)計分析，包括成分分析（principal component analysis，PCA）圖、熱圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味化合物的鑒定分析

采用SPME-GC-MS檢測發(fā)酵終點（p H4.5）時對照組和7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味化合物，經(jīng)NIST 11標準庫檢索各組分揮發(fā)性成分，利用面積歸一化法計算各組分相對含量。根據(jù)檢測結(jié)果可知，對照組和7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味化合物種類繁多，包括酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、含氮類、雜環(huán)類及其它化合物等。其中，一些對發(fā)酵乳風味的形成有重要作用的揮發(fā)性化合物的種類和相對含量如表2所示[9?11]。

表2 發(fā)酵終點時發(fā)酵乳中的部分重要揮發(fā)性風味化合物Table 2 Some important volatileflavor compoundsin the fermented milk at the end of fermentation

比較對照組和7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中的一些重要的揮發(fā)性風味化合物后發(fā)現(xiàn)，不同菌株發(fā)酵乳中風味化合物的種類和含量有顯著區(qū)別。如G80-3發(fā)酵乳中乙酸的相對含量較高，而XJ17-7發(fā)酵乳中己酸的相對含量最高，達到44.74%。乙醛是發(fā)酵乳中的重要風味化合物，除QH38-6、S13-4和G80-2外，其余4株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中均未檢測出乙醛。庚醛具有強烈的油脂香味[12?14]，除G80-1、QH38-6和S13-4外，其余4株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中庚醛的相對含量接近或高于對照組。2-壬酮是由辛酸的β-氧化和癸酸的脫羧反應(yīng)生成[15]。對照組和7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中均檢測出2-壬酮，且其相對含量高于其他酮類化合物。3-甲基丁醇可以使發(fā)酵乳具有麥芽香味[5]。S13-4發(fā)酵乳中具有較高含量的3-甲基丁醇，其次是G80-2發(fā)酵乳。己酸乙酯能賦予發(fā)酵乳類似蘋果、香蕉氣味[16]。在7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中，僅在G80-3發(fā)酵乳檢出己酸乙酯，且含量高于對照組。

2.2 感官評定結(jié)果

圖1為對照組和7株實驗菌株發(fā)酵乳感官評定的結(jié)果。G80-2、S13-4、MGB82-2的感官評分接近于對照組，特別是G80-2的滋味和氣味得分（35.8）與對照組（35.9）最接近，因此，選擇G80-2作為實驗菌株進一步分析該菌株從牛乳發(fā)酵到貯藏期間產(chǎn)生的揮發(fā)性風味物質(zhì)的動態(tài)變化規(guī)律。

圖1 對照組和7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳感官評定結(jié)果Fig.1 Sensory evaluation results of control and 7 groupsof fermented milk

2.3 發(fā)酵乳中風味物質(zhì)的主成分分析

發(fā)酵終點時對照組和7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味化合物PCA分析結(jié)果如圖2所示。以發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味化合物種類和含量的相似度為聚集依據(jù)，根據(jù)圖中聚集度，可將對照組和7株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳大致聚為3個類群，分別為G80-2S13-4JD類群、G80-3MGB82-2類群以及QH38-6G80-1XJ17-7類群。G80-2S13-4JD類群中，G80-2與對照組之間的距離最近，說明G80-2發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味化合物組成及含量都最接近對照組，這一結(jié)果與2.2中感官評定的結(jié)果相一致。

圖2 發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味化合物的PCA分析Fig.2 PCA analysis of volatile compounds in fermented milk

2.4 G80-2發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味化合物及動態(tài)分析

以G80-2為實驗菌株，利用SPME-GC-MS檢測牛乳從發(fā)酵到貯藏期間發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味化合物的動態(tài)變化，一些重要的風味化合物如表3所示。

表3 嗜熱鏈球菌G80-2發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味物質(zhì)的SPME-GC-MS鑒定結(jié)果Table 3 Volatile flavor compounds in fermented milk of S.thermophilus G80-2 by SPME-GC-MS

2.4.1 酸類化合物鑒定分析 酸類化合物通常是由乳中脂肪被脂肪酶分解得到[17]。本實驗中檢測到的酸類化合物主要有乙酸、己酸、庚酸及辛酸。乙酸是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的重要酸類物質(zhì)之一，可以賦予發(fā)酵乳酸爽的風味[18]，在發(fā)酵（4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間其相對含量分別為0.23%、1.02%、1.93%、2.58%、1.47%、2.04%和1.38%，整體呈先上升后下降趨勢。辛酸具有微弱的水果淡酸味[19]，在發(fā)酵（2、4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間其相對含量分別為0.20%、0.82%、1.34%、1.30%、1.11%、1.15%、2.25%和1.68%，于貯藏中期（7 d）相對含量到達頂峰。此外，重要的酸類化合物還有己酸，己酸具有酸味、脂肪味以及乳酪味[19?20]，在貯藏期間具有較高的相對含量，對發(fā)酵乳的滋味影響較大。

2.4.2 醇類化合物鑒定分析 醇類化合物一般由醛、酮以及氨基酸作用產(chǎn)生[21]。本次實驗中測得的醇類化合物主要有3-甲基丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇等。在這些醇類化合物中，一些低分子醇在發(fā)酵（2、4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間的相對含量較高，如1-己醇相對含量分別為5.41%、4.01%、5.00%、5.16%、4.19%、3.88%、4.77%和4.17%；而1-庚醇的相對含量分別為7.41%、4.84%、5.48%、6.12%、4.82%、4.78%、5.82%和5.27%。盡管有很多關(guān)于醇類化合物的報道，但至今為止醇類化合物對發(fā)酵乳風味的影響機理還不清楚。

2.4.3 酮類化合物鑒定分析 酮類化合物的風味閾值很低，較低的濃度能對發(fā)酵乳的風味產(chǎn)生重要影響。本次實驗檢測得到的主要酮類化合物有雙乙酰、2-戊酮、乙偶姻、2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮等。大多數(shù)研究認為酮類化合物一般是由不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解以及微生物代謝幾個途徑形成[22?23]。本實驗檢測到雙乙酰和乙偶姻的相對含量較高，在發(fā)酵（2、4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間雙乙酰的相對含量分別為2.12%、10.26%、9.76%、20.29%、14.49%、13.89%、14.83%和11.34%，在發(fā)酵終點（0 d）時含量到達最高值，在貯藏期間相對含量下降較為明顯，這主要原因是雙乙酰在貯藏過程中容易被還原為3-羥基-2-丁酮[24]。

2.4.4 醛類化合物鑒定分析 和酮類化合物類似，醛類化合物一般閾值較低，對發(fā)酵乳風味構(gòu)成有重要影響[24?26]。本次實驗檢測得到的主要醛類化合物有乙醛、正戊醛、庚醛、苯甲醛等。乙醛是發(fā)酵乳中重要的特征風味物質(zhì)，一定濃度范圍內(nèi)的乙醛可以賦予酸奶清爽的香味[27?28]。目前國內(nèi)大部分發(fā)酵乳都是以乙醛為主要風味的醛香型發(fā)酵乳[29?30]。本實驗在發(fā)酵（4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間均檢測到乙醛，且乙醛的相對含量較高，分別為5.45%、4.56%、3.45%、2.25%、2.78%、2.61%和1.84%。乳酸菌可通過多種代謝途徑生成乙醛，本實驗中乙醛的相對含量呈逐漸降低的趨勢，這可能是因為受到貯存條件的影響，低溫及乙醛生產(chǎn)相關(guān)的基因表達降低，影響發(fā)酵乳中乙醛的產(chǎn)量。

2.4.5 酯類化合物鑒定分析 酯類化合物是發(fā)酵乳中的重要揮發(fā)性化合物，主要通過脂肪酸水解和微生物代謝產(chǎn)生。一般來說，一些分子量較低的酯對發(fā)酵乳的風味影響較大，如本次實驗檢測到的甲酸乙烯酯，具有水果和花香味，能極大限度地降低脂肪酸和胺帶來的苦味[31?32]。

2.5 不同時期發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味化合物的熱圖聚類分析

利用熱圖對G80-2在牛乳發(fā)酵和貯藏過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)熱圖的垂直方向，將所有樣品分為兩大類，發(fā)酵期（2、4、6 h）與貯藏期（0 d）樣品聚為一類，而貯藏期（1、3、7、14 d）聚為一類。在貯藏期樣品中，貯藏期（1、3、7 d）樣品聚為一類，而貯藏14 d樣品單獨聚為一類。這可能是因為貯藏14 d樣品中嗜熱鏈球菌大量死亡，樣品中風味化合物的種類和相對含量與貯藏期（1、3、7 d）有明顯區(qū)別。在發(fā)酵期樣品中，發(fā)酵初期（2 h）樣品單獨聚為一類，發(fā)酵中后期（4、6 h）及貯藏期（0 d）聚為一類，說明發(fā)酵初期（2 h）樣品中揮發(fā)性風味化合物的構(gòu)成明顯不同于發(fā)酵中后期（4、6 h）及貯藏期（0 d）樣品。這可能是因為發(fā)酵初期（2 h）發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌活菌數(shù)較低，產(chǎn)生的風味化合物的種類和相對含量相對較少，而發(fā)酵中后期（4、6 h）及貯藏期（0 d）隨著發(fā)酵乳中活菌數(shù)的增加，產(chǎn)生的風味化合物的種類和含量逐漸增加，較多的香氣成分帶給發(fā)酵乳更好的風味和感官質(zhì)量。

圖3 不同時期發(fā)酵乳的熱圖及聚類分析Fig.3 Heat map and cluster analysis of fermented milk in different periods

3 結(jié)論

以科漢森公司提供的商業(yè)發(fā)酵劑為對照組，從分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的7株嗜熱鏈球菌中篩選出一株具有良好風味的菌株G80-2，并對該菌株在牛乳發(fā)酵和貯藏期間產(chǎn)生的風味化合物進行檢測分析。結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌G80-2在牛乳發(fā)酵和貯藏期間產(chǎn)生多種風味化合物，其中酸類化合物4種、醇類化合物10種、酮類化合物12種、醛類化合物6種、酯類化合物1種，且一些主要特征風味物質(zhì)如乙酸、乙醛、雙乙酰、乙偶姻、2-庚酮、1-庚醇等相對含量較高，對發(fā)酵乳風味的形成發(fā)揮了重要的作用。熱圖聚類分析的結(jié)果表明，發(fā)酵和貯藏期間發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味物質(zhì)差異較大，說明隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味物質(zhì)差異顯著。