NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞黑素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

孫晶瑩 封 青 李 研 霍雪萍 孫麗君

陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，陜西西安，710068

白癜風(fēng)是皮膚黑素脫失后白斑為主要表現(xiàn)的皮膚性疾病，目前該疾病發(fā)病機(jī)制尚不明確，但該疾病和人體自身免疫力及遺傳因素有一定關(guān)系[1,2]。導(dǎo)致白癜風(fēng)的主要原因是人體黑素細(xì)胞遭到破壞，細(xì)胞中黑素顆粒不斷減少，進(jìn)而引起皮膚斑片狀色素脫失。近年來(lái)的研究表明，窄譜中波紫外線(narrow bound ultraviolet B light, NB-UVB)在臨床上治療白癜風(fēng)具有較好療效，其可促進(jìn)黑素細(xì)胞黑素的合成和增加酪氨酸酶活性，從而有效緩解白癜風(fēng)癥狀[3-5]，但其具體機(jī)制仍不清楚。

本研究使用上海西格瑪公司生產(chǎn)的SS型紫外線光療儀，波長(zhǎng)為311～313 nm，該波段的紫外線光毒性小，色素恢復(fù)較一致，色差小，療效好。用此光療儀作用黑素細(xì)胞，研究不同劑量的紫外線照射對(duì)黑素細(xì)胞的細(xì)胞活性、黑素含量以及黑素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討NB-UVB對(duì)黑素合成的影響及在白癜風(fēng)復(fù)色中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人來(lái)源的傳代穩(wěn)定的黑素細(xì)胞系PIG1，由芝加哥洛約拉大學(xué)Caroline Le Poole教授惠贈(zèng)。黑素細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基Medium 254及培養(yǎng)基添加劑HMGS-2 均購(gòu)自Gibco公司; 胎牛血清購(gòu)于Hyclone 公司; RNA 提取試劑盒購(gòu)自AG公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript RT reagent kit、熒光PCR酶SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit均購(gòu)自TaKaRa公司，引物由上海生工合成; Tyr、Tyrp2、GPNMB、MART-1抗體均購(gòu)于Abcam公司，Syntenin抗體購(gòu)自proteintech，β-actin、HRP羊抗鼠、HRP羊抗兔購(gòu)于康為試劑，NC膜購(gòu)自Pall Corporation公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于Heraeus公司; 核酸測(cè)定儀Nanodrop2000c和冷凍高速離心機(jī)均購(gòu)于Thermo Scientific公司;倒置熒光顯微鏡購(gòu)于Olympus公司;熒光PCR儀7500 購(gòu)于ABI公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于BIO-RAD，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech，紫外光療儀SS-03B型光療儀(上海希格瑪高技術(shù)有限公司，波長(zhǎng)311 nm)。

1.2 方法

1.2.1 黑素細(xì)胞的培養(yǎng) 液氮罐中凍存的PIG1細(xì)胞37℃復(fù)蘇，待完全融化后1200 rpm離心5 min，在超凈工作臺(tái)中棄掉凍存液上清，將細(xì)胞重懸于含8%胎牛血清及HMGS-2因子的M254培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 UVB照射 將PIG1細(xì)胞按每皿6×105/mL的量接種于直徑35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，于37℃，5%細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)液，1×PBS洗滌1次，加入少量1×PBS，采用紫外線光療儀以不同的時(shí)間照射PIG1細(xì)胞，照射時(shí)間以及對(duì)應(yīng)的輻照劑量見(jiàn)表1，照射完畢后棄掉PBS，加入2 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)置未照射組用于對(duì)照。

表1 不同照射時(shí)間對(duì)應(yīng)的輻照劑量

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，按細(xì)胞濃度2×103個(gè)/孔接種細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，分別以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)不同UVB劑量照射處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后每孔加入20 μL MTT溶液，37℃孵育4 h；去除上清后每孔加入100 μL DMSO溶解細(xì)胞，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.4 NaOH裂解法測(cè)定黑素含量 根據(jù)1.2.3中篩選的紫外線照射劑量，選擇400、800、1200 mJ/cm2劑量進(jìn)行照射。黑素含量的測(cè)定：UVB相應(yīng)劑量處理細(xì)胞48 h后，0.25%胰酶消化，離心后去上清，PBS清洗兩次，用PBS重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)管中加入200 μL濃度為1M NaOH(含100 g/L的DMSO)，80℃水浴鍋?zhàn)饔? h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)A475的吸光值。

1.2.5 RT-PCR方法檢測(cè)黑素合成相關(guān)基因的表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑素細(xì)胞消化重懸至6孔板內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，初始細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)/孔。UVB 1200 mJ/cm2劑量處理細(xì)胞，分別于24 h后收集細(xì)胞，采用RNA抽提試劑盒提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上述cDNA為模板，擴(kuò)增Tyr、Tyrp1、Tyrp2、OA1、MART-1、Pmel17、VAT-1、OCSP、syntenin、CHCHD3、flotillin-1、GPNMB 12個(gè)黑素合成相關(guān)基因以及內(nèi)參β-actin基因，計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列表

1.2.6 Western blot方法檢測(cè)黑素合成相關(guān)蛋白的表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑素細(xì)胞消化重懸至6孔板內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，初始細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)/孔。UVB 1200 mJ/cm2劑量處理細(xì)胞，于48 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液(含RIPA)提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，加入2×上樣緩沖液混合加熱變性，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后，將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)至NC膜上，200 mA 2 h濕轉(zhuǎn)，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃搖床振蕩過(guò)夜孵育一抗，PBST洗3次，5 min/次，室溫孵育二抗45 min，PBST洗3次，5 min/次，凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的條帶。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射不同劑量對(duì)細(xì)胞活性的影響 培養(yǎng)黑素細(xì)胞，分別以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)的不同UVB照射劑量處理細(xì)胞，24 h后MTT檢測(cè)細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示400、800和1200 mJ/cm2三組照射劑量對(duì)細(xì)胞活力影響不大，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的選擇，而輻射強(qiáng)度>1200 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞活性明顯下降(圖1)。

圖1 紫外線照射不同劑量對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.2 紫外線照射對(duì)黑素合成的影響 分別選擇400、800、1200 mJ/cm2三個(gè)不同的紫外照射劑量處理PIGI細(xì)胞，48 h后檢測(cè)不同處理組的黑素含量，結(jié)果顯示隨著照射劑量的增加，黑素含量增加，與對(duì)照組相比，800、1200 mJ/cm2照射劑量的細(xì)胞黑素含量明顯升高，表明紫外線照射增加了黑素合成(圖2)。

2.3 紫外線照射對(duì)黑素合成相關(guān)基因的影響 選擇UVB劑量1200 mJ/cm2處理黑素細(xì)胞，24 h后收細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)12種黑素合成相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，紫外線照射后，tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB這五種基因的表達(dá)顯著升高，有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

(*表示與對(duì)照組相比，P<0.05)

圖3 紫外線照射對(duì)黑素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響(*P<0.05) 圖4 紫外線照射對(duì)黑素合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 紫外線照射對(duì)黑素合成相關(guān)蛋白的影響 根據(jù)2.3的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果， western blot檢測(cè)tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，紫外線照射48 h后，tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

黑素細(xì)胞是位于表皮基底層(皮膚的最外層)的特化細(xì)胞[6]，其新陳代謝是一個(gè)精確調(diào)控的生物學(xué)行為，受到外環(huán)境(紫外線等)和內(nèi)環(huán)境(細(xì)胞間相互作用等)的共同影響[7]。黑素的合成在黑素細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，黑素細(xì)胞上有光受體，紫外線照射能引起黑素細(xì)胞的黑素合成，因此當(dāng)皮膚受到紫外線照射或體內(nèi)激素發(fā)生變化時(shí)，局部皮膚黑素細(xì)胞產(chǎn)生的黑素量增加，從而在皮膚上發(fā)生色素沉著。

目前已知有12種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是黑素體特異性蛋白，分別是Tyr(tyrosinase)、Tyrp1(tyrosinase-related protein 1)、Tyrp2(tyrosinase-related protein 2)、OA1(ocular albinism type 1 protein)、MART-1、gp100/Pmel17、VAT-1(vesicle amine transport protein 1 homolog)、OCSP(oculospanin)、syntenin、FLJ20420或稱(chēng)CHCHD3、flotillin-1/2和GPNMB (Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b)[8]。這些黑素體特異蛋白按照其特性及功能大致可以分為三大類(lèi)：酶組分、結(jié)構(gòu)組分和未知組分。Tyr、Tyrp1和Tyrp2是黑素形成中具有關(guān)鍵作用的酶組分，其在黑素合成中的功能已較為清楚，而在黑素體結(jié)構(gòu)蛋白中，Pmel17是迄今為止唯一被證明參與黑素體中纖維狀結(jié)構(gòu)形成的蛋白[9]。GPNMB也是一種黑素小體特異性結(jié)構(gòu)蛋白，它與Pmel17/gp100在結(jié)構(gòu)上高度相似，在各個(gè)時(shí)期的黑素小體中都有表達(dá)[10,11]。

本研究以這12種黑素體蛋白為檢測(cè)對(duì)象，明確紫外線照射對(duì)這12種黑素體蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫外線照射細(xì)胞后，RT-PCR方法檢測(cè)到Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB這5種蛋白的基因表達(dá)明顯升高，western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表達(dá)升高。Tyr、Tyrp2被UVB上調(diào)的結(jié)果已經(jīng)在很多既往研究里面被證實(shí)[12]；另外張萍研究發(fā)現(xiàn)GPNMB也可以被UVB上調(diào)[13]；syntenin和MART-1被上調(diào)的現(xiàn)象在我們的研究中首次被報(bào)道。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)GPNMB和Pmel17雖同為黑素體的結(jié)構(gòu)蛋白且氨基酸序列高度同源，UVB照射極大的促進(jìn)GPNMB基因的表達(dá)，但是對(duì)Pmel17基因的影響并不明顯，分析原因可能是由于Pmel17的PKD結(jié)構(gòu)域和 RPT結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特性導(dǎo)致UVB對(duì)兩者產(chǎn)生不同的變化。MART-1蛋白是黑素體成熟所必需的，Syntenin蛋白對(duì)黑素合成的影響在我們之前的研究中也已經(jīng)明確[14]，UVB對(duì)這兩種蛋白表達(dá)的上調(diào)也進(jìn)一步驗(yàn)證了其在黑素合成中的重要作用。

紫外線照射可以造成色素沉著，但是過(guò)量的紫外線又會(huì)損傷黑素細(xì)胞，影響細(xì)胞活性。本研究發(fā)現(xiàn)輻射強(qiáng)度>1200 mJ/cm2UVB時(shí)，細(xì)胞活性明顯下降。本研究為UVB治療白癜風(fēng)時(shí)照射劑量的選擇及白癜風(fēng)復(fù)色的機(jī)制探討提供了依據(jù)。