5-氮雜胞苷對高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因水稻耐旱性的影響

嚴(yán) 婷，李 霞，3，4，5，曹 悅，吳博晗，王 凈，張嫚嫚

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014；3.江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；5.南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

干旱脅迫是所有的非生物脅迫中最復(fù)雜，并且是全球規(guī)模的脅迫，對水稻產(chǎn)量及質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅[1]。由于C4作物在高溫、強(qiáng)光以及干旱等條件下，較C3作物具有明顯的生長優(yōu)勢、水分以及營養(yǎng)利用效率，生物學(xué)產(chǎn)量也較高[2]，因此，科學(xué)家利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將玉米等C4植物中C4光合途徑關(guān)鍵基因?qū)隒3植物中，達(dá)到增強(qiáng)光合效率和提高產(chǎn)量的目的[3]。玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31)是C4光合途徑的關(guān)鍵酶[4]，已發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因水稻在高光強(qiáng)[5]、高溫[6]、干旱[7]和低氮[8]等逆境條件下表現(xiàn)出高光合效率和高產(chǎn)量的特性，因此，提高水稻的C4光合特性將是提高水稻抵御非逆境的有效策略之一[9]。

表觀遺傳機(jī)制調(diào)控植物應(yīng)答外界脅迫是近年來發(fā)現(xiàn)的重要機(jī)制之一，其中DNA甲基化是表觀遺傳的重要形式之一，在調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)和植物脅迫耐受中也起重要作用[10]。植物DNA甲基化機(jī)制又是非常復(fù)雜的，因物種、基因型、組織以及作用元件而異，但是很多研究都來自擬南芥的研究成果[11]。實(shí)際上，水稻基因組具有復(fù)雜性質(zhì)，其不連續(xù)的異染色質(zhì)和廣泛分布的DNA甲基化也為了解植物DNA甲基化研究提供了更豐富的資源[12]。已繪制了水稻秈粳亞種在基因表達(dá)、生長發(fā)育以及脅迫響應(yīng)中的DNA甲基化圖譜[13]。前人研究表明，高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC水稻植株的外源導(dǎo)入基因C4-PEPC啟動子在干旱條件下也存在甲基化現(xiàn)象，而且通過C4-PEPC的去甲基化，上調(diào)C4-PEPC的表達(dá)和其酶活性，共同參與了轉(zhuǎn)基因水稻植株對干旱的早期響應(yīng)[7]，提示DNA甲基化可能也是水稻響應(yīng)干旱的機(jī)制之一。為此，本研究以高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)為材料，通過施用不同濃度的DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-azaC)，研究不同生育期DNA甲基化在水稻響應(yīng)干旱中影響，并研究聚乙二醇模擬的干旱條件下，分析DNA甲基化在水稻干旱響應(yīng)的品種差異機(jī)制，為豐富水稻干旱響應(yīng)機(jī)制提供信息。

1 材料和方法

1.1 種植

本試驗(yàn)使用的材料最初來源于Ku等[14]將玉米C4-PEPC基因?qū)肴毡揪綤itaake，C4-PEPC基因在野生型中獲得高表達(dá)，獲得的T2轉(zhuǎn)基因材料，并經(jīng)過江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院光合生理實(shí)驗(yàn)室在南京的18代穩(wěn)定培養(yǎng)選育所得的轉(zhuǎn)基因水稻(PC)以及未轉(zhuǎn)基因原種水稻Kitaake(WT)。盆栽試驗(yàn)于2018年5-9月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所水稻示范基地網(wǎng)室中進(jìn)行。5月2日，將水稻種子使用75%的乙醇浸泡5 min，隨后使用50%次氯酸鈉浸泡15 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，保證無消毒液殘留，消毒后使用蒸餾水浸種，置于30 ℃黑暗條件下泡種3 d，待種子露白，放在濕潤的培養(yǎng)皿中催芽，當(dāng)種子長出約0.5 cm的芽后，選取生長一致的材料，于5月10日播種于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院網(wǎng)室中，常規(guī)水肥和病蟲害管理。

1.2 水稻發(fā)芽率試驗(yàn)

將消毒的水稻種子分組，試驗(yàn)包括對照組( 清水發(fā)芽培養(yǎng))，以下簡稱處理A，模擬干旱組(10% 聚乙二醇6000 ，10% Polyethylene glycol 6000，簡稱10% PEG，處理B)以及5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-azaC)聯(lián)合模擬干旱組(5-azaC+10% PEG)，5-azaC (A2385)購自Sigma公司。芽期5-azaC 聯(lián)合模擬干旱組設(shè)置7 個(gè)處理濃度，分別為C：2.5 μmol/L+10% PEG、D：5.0 μmol/L+10% PEG、E：7.5 μmol/L+10% PEG、F： 10.0 μmol/L+10% PEG、G：30.0 μmol/L+10% PEG、H： 50.0 μmol/L+10% PEG和I：100.0 μmol/L+10% PEG。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每次100 粒，試驗(yàn)材料培養(yǎng)4 d，每天記錄發(fā)芽率(發(fā)芽率=當(dāng)天內(nèi)總發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%)。

1.3 水培試驗(yàn)處理

消毒的水稻種子浸種催芽，待長出約0.5 cm的芽后，將種子按間隔插入黑色的水稻培養(yǎng)板上培養(yǎng)，在長出第2片葉子之前均用清水培養(yǎng)，水稻長到2葉期時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)移到用國際水稻所(International Rice Research Institute)標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液中，置于 30 ℃/25 ℃ (晝/夜)、14 h/10 h(光/暗)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[15]。待水稻長到 5～6 葉期后，選擇株型、長勢和葉片均一的植株作為試驗(yàn)材料，將材料分組，以國際標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液作為對照，藥劑處理采用根吸入法，在處理前一天，將植株移入含不同濃度5-azaC的營養(yǎng)液，暗中預(yù)處理12 h，次日再用光下適應(yīng)2 h，之后將植株轉(zhuǎn)移到含有10%(m/V) PEG-6000的培養(yǎng)液中(以下稱模擬干旱脅迫，Drought stress，DS)，在光下處理2 h 后。之后取下倒二葉，迅速在-80 ℃液氮中保存，用于測定各項(xiàng)生理指標(biāo)，同時(shí)測定處理前后相對含水量(Relative water content，RWC)，在苗期并以RWC 作為耐旱性指標(biāo)。

1.4 盆栽試驗(yàn)處理

盆栽里裝的土為稻田黏壤土，每1種處理的PC和WT分別種植9盆，盆缽提前做好隨機(jī)區(qū)組分布，將發(fā)芽的水稻種植在盆缽中，日常水肥和病蟲管理。待水稻幼苗長至4～5葉期時(shí)，挑選長勢均一的幼苗移栽至僅施加了基肥(即復(fù)合肥，含15%的N，15%的P，15%的K)的盆中，每盆栽5穴，每穴栽1株，盆栽試驗(yàn)所用的器皿均為底部直徑25 cm，高25 cm的陶瓷盆缽。盆栽試驗(yàn)總施氮量為300 kg/hm2，分別以基肥(35% N)、分蘗肥(20% N)和穗肥(45% N)等按時(shí)期施加，移栽后所施加的氮肥均為尿素。隨機(jī)分成2組，一組正常灌溉(對照，CK)，一組自然干旱(Drought stress，DS)。其中自然干旱處理在水稻孕穗期對試驗(yàn)組PC和WT停止正常澆灌，進(jìn)行自然干旱處理，將盆缽排水自然落干，頂部用透明薄膜覆蓋防雨水，自然干旱組又隨機(jī)分為3組，另外2組為5-azaC聯(lián)合干旱組，其中5-azaC設(shè)置了2個(gè)濃度，分別為50，100 μmol/L，該處理每5 d分別噴施2種濃度5-azaC溶液1次，共處理5次，每株共噴施50 mL溶液(DS+5-azaC)；單獨(dú)自然干旱組則噴施同樣體積的清水(以下稱干旱脅迫，DS)。5 次處理結(jié)束后，所有處理均恢復(fù)正常灌溉，開花后50 d 收獲，考察產(chǎn)量及其構(gòu)成因子。

1.5 光合參數(shù)的測定

不同處理的盆栽水稻植株在開花后7～14 d測定劍葉的光合參數(shù)，方法參照Li等[16]的方法，使用美國LI-COR公司生產(chǎn)的LI-6400款便攜式光合測定儀，選擇晴天無云的8：30-11：30室外條件下進(jìn)行測定，葉片光合參數(shù)測定的條件：使用紅藍(lán)光源測定，光量子通量密度(PPFD，Photosynthetic photon flux density) 800 μmol/(m2·s)，流速500 μmol/s，待CO2和H2O開始穩(wěn)定后開始測量。測定供試材料的凈光合速率(Net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導(dǎo)度(Stomatal coductence，Gs)、胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration，Ci)和蒸騰速率(Transpiration rate，Tr)，通過WUE=Pn/Tr，計(jì)算出水分利用率(Water use efficiency，WUE)。通過CE=Pn/Ci，計(jì)算出羧化效率(Carboxylation efficiency，CE)。每個(gè)處理測定5張葉片，每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.6 相對含水量的測定

植株的水分狀態(tài)通過植株相對含水量(Relative water content，RWC)的測定決定[17]。試驗(yàn)包括對照組(清水處理，處理A)、模擬干旱組(10% PEG，處理B)以及5-azaC聯(lián)合模擬干旱組(5-azaC+10% PEG)，苗期5-azaC聯(lián)合模擬干旱組設(shè)置9個(gè)處理濃度，分別為C：2.5 μmol/L+10% PEG、D：5.0 μmol/L+10% PEG、E：7.5 μmol/L+10% PEG、F：10.0 μmol/L+10% PEG、G：30.0 μmol/L+10% PEG、H：50.0 μmol/L+10% PEG、I：100.0 μmol/L+10% PEG、J：250.0 μmol/L+10% PEG和K：500.0 μmol/L+10% PEG。植株在光下處理2 h后，剪取第4葉中間6 cm部分，測其鮮質(zhì)量(Fresh weight，F(xiàn)W)，然后將葉切片在室溫下漂浮在去離子水中6 h，測定其飽和水質(zhì)量(Turgid weight ，TW)，隨后在105 ℃烘箱中殺青15 min，70 ℃的烘箱中干燥過夜至恒質(zhì)量，再稱質(zhì)量以獲得干質(zhì)量(Drought weight，DW)。RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100%[17]，每個(gè)處理測定5 張葉片，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.7 丙二醛含量的測定

根據(jù)Velikova等[18]方法，測定樣品中丙二醛含量。

1.8 可溶性蛋白和脯氨酸含量的測定

參照考馬斯亮藍(lán)G-250法[19]測定苗期葉片的可溶性蛋白含量，脯氨酸含量參考Troll等[20]方法測定。

1.9 可溶性糖和各糖組分含量的測定

樣品中可溶性總糖、蔗糖、葡萄糖和果糖含量參照Ambavaram等[21]的方法進(jìn)行。

1.10 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的測定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的測定參考唐玉婷等[8]的方法。

1.11 總RNA提取和qRT-PCR

總RNA 的提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 根據(jù)等報(bào)道的方法制備總RNA和反轉(zhuǎn)錄[5]。在PCR 儀(ETC811，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)上進(jìn)行。根據(jù)制造商的說明書使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 試劑盒(TaKaRa Biotechnology(大連)有限公司)進(jìn)行qRT-PCR 分析，用Applied Biosystems Step One 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)分析。qRT-PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s 和68 ℃ 各 1 min，共32 次循環(huán)。重復(fù)3 次。在Primer 3 上設(shè)計(jì)引物，以水稻組成性表達(dá)的Actin基因?yàn)閮?nèi)部參照，引物序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.12 產(chǎn)量構(gòu)成因子的測定

在植株開花后50 d，收獲植株，在收獲取樣時(shí)各個(gè)處理取長勢和穗數(shù)平均值相近的10株測定其產(chǎn)量構(gòu)成因子，收獲后自然風(fēng)干，當(dāng)籽粒含水量≤14.5%后，再進(jìn)行室內(nèi)考種。測定每株株高、穗數(shù)、穗長、穗實(shí)粒數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量以及單株產(chǎn)量。

1.13 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述和作圖，P<0.05。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因引物Tab.1 Gene primes for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度5-azaC對水稻發(fā)芽率的影響

從表2可見，在模擬干旱條件下，小于30.0 μmol/L的5-azaC處理均促進(jìn)水稻快速萌動，而且在培養(yǎng)第4天具有較高的發(fā)芽率，而大于G處理(5-azaC濃度為30.0 μmol/L)緩解干旱抑制的效果不顯著，5-azaC對兩材料干旱緩解作用濃度有差異，其中WT為C處理、D處理和E處理(2.5～7.5 μmol/L)，而PC則在F處理(10.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合PEG)具有最高的發(fā)芽率，低濃度5-azaC對芽期水稻干旱有緩解效果，且材料之間有差異。

2.2 噴施不同濃度5-azaC聯(lián)合10% PEG-6000 模擬干旱脅迫對水稻苗期的影響

2.2.1 葉片相對含水量 如圖1可知，較低濃度5-azaC處理對模擬干旱條件下水稻的保水能力有一定促進(jìn)效果，其中WT的5-azaC促進(jìn)作用濃度為2.5～50.0 μmol/L，而PC則為30.0～50.0 μmol/L，也呈現(xiàn)在該促進(jìn)的作用濃度下，隨著濃度的增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)，但是到50.0 μmol/L(H處理)出現(xiàn)閾值，其中苗期兩材料DNA抑制劑處理濃度的差異提示兩材料DNA甲基化水平不同。當(dāng)達(dá)到100.0 μmol/L 5-azaC時(shí)，水稻葉片的RWC則顯著下降，兩材料的保水能力沒有顯著差別，繼續(xù)增加濃度，則與100.0 μmol/L 5-azaC處理均沒有顯著差異，而500.0 μmol/L 5-azaC處理則抑制更顯著，均低于單獨(dú)模擬干旱處理的水平，提示，DNA甲基化過程也參與水稻苗期干旱響應(yīng)，其中兩材料DNA甲基化水平的差異可能是其耐旱差異表現(xiàn)的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)合供試水稻芽期和苗期的抑制劑作用濃度，可以看出，芽期<苗期。

表2 不同水稻材料在不同5-azaC濃度處理下發(fā)芽率的變化Tab.2 Germination rates of difference varieties at different concentrations of 5-azaC %

不同小寫字母表示0.05 水平上差異顯著(P<0.05)。圖2-8同。The different lowercase letters are significant difference at 0. 05 level (P<0.05)．The same as Fig.2-8.

2.2.2 葉片的C4-PEPC基因表達(dá)和PEPC酶活性 如圖2可知，小于50.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理，與單獨(dú)干旱處理相比，對PC的C4-PEPC表達(dá)沒有顯著影響，與單獨(dú)模擬干旱的水平類似，但是高于這個(gè)濃度，則顯著抑制了該基因的表達(dá)水平。而對水稻葉片的PEPC酶活性則也存在濃度閾值，其中PC葉片中PEPC酶活性在30.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理活性顯著高于單獨(dú)干旱的處理，50.0，100.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理的均顯著低于其單獨(dú)干旱處理，但是還是高于未處理的對照，而500.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理則顯著抑制了PEPC酶活性；與PC相比，不同處理WT的酶活性均較低，DNA甲基化抑制劑對其影響的趨勢與PC的類似，基因表達(dá)和酶活性的表現(xiàn)與葉片的含水量有一致的表現(xiàn)。很顯然，低濃度的5-azaC聯(lián)合干旱處理增加了水稻酶活性，而隨著處理濃度的增加減少了兩材料酶活性差值的幅度，500.0 μmol/L 5-azaC處理的抑制最大，顯著低于未處理對照，提示外源導(dǎo)入的C4-PEPC與水稻DNA甲基化水平的差異表現(xiàn)有關(guān)。

2.2.3 葉片丙二醛含量 進(jìn)一步選取了2個(gè)導(dǎo)致供試水稻葉片相對含水量差異表現(xiàn)的作用濃度(50.0，100.0 μmol/L 5-azaC)聯(lián)合模擬干旱處理，測定了植株倒二葉的丙二醛含量(圖3)。與B處理相比，H處理(DS+50.0 μmol/L 5-azaC)可以顯著降低相同水稻材料的MDA含量，其中PC的含量顯著小于WT的，而I處理(DS+100.0 μmol/L 5-azaC)則顯著增加了水稻MDA的含量，但兩材料含量不存在顯著差異，提示不同濃度的5-azaC處理造成了供試水稻膜脂過氧化水平差異，其中低濃度處理下PC的膜脂過氧化較低，傷害較少，有利于保持干旱脅迫下其葉片的水分。

圖2 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片C4-PEPC基因表達(dá)和PEPC酶活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of 5-azaC on the relative expression C4-PEPC and PEPC activities of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

圖3 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片丙二醛的影響Fig.3 Effects of different concentrations of 5-azaC on MDA content of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.2.4 水稻葉片可溶性總糖、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量 從圖4-A可知，與B處理相比，H處理和I處理均顯著降低了PC水稻葉片可溶性糖的含量，但低濃度的H處理沒有改變兩材料的差異，PC仍大于WT，但是高濃度的I 處理下兩材料的含量不存在顯著差異；與DS處理相比，兩材料在低濃度的5-azaC+DS處理下的可溶性蛋白的含量不存在顯著差異，而高濃度則顯著降低了兩材料葉片的可溶性蛋白，且WT大于PC(圖4-B)；葉片中脯氨酸含量則與可溶性糖的含量變化趨勢相反，與DS處理相比，5-azaC+DS處理均顯著增加了脯氨酸含量，且5-azaC的濃度越高，其增幅越顯著，但是高濃度5-azaC+DS處理下兩材料的含量不存在顯著差異(圖4-C)，提示葉片中可溶性糖和脯氨酸含量的差異可能是兩材料干旱條件下DNA甲基化表現(xiàn)差異的重要物質(zhì)。

圖4 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of 5-azaC on soluble sugar，soluble protein and proline content of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.2.5 水稻葉片可溶性糖組分 從圖5水稻葉片可溶性糖組分可知，與B處理相比，H處理和I處理均顯著提高了PC中蔗糖含量，而低濃度5-azaC+DS處理則顯著降低了WT的蔗糖含量，而高濃度則顯著增加了WT的蔗糖含量(圖5-A)；與對照相比，B處理增加了WT的蔗糖含量而降低了PC的蔗糖含量。進(jìn)一步與B處理相比，2個(gè)5-azaC+DS處理均顯著增加了兩材料的葡萄糖含量，但是品種間沒有顯著差異，提示導(dǎo)致2個(gè)5-azaC濃度差異的水稻干旱表現(xiàn)可能與葡萄糖關(guān)系不大(圖5-B)；與對照相比，B處理，均導(dǎo)致兩材料葉片內(nèi)果糖含量的增加，但兩材料含量不存在顯著差異，H處理(50.0 μmol/L 5-azaC)則提高了PC果糖含量，而降低了WT的果糖含量，恢復(fù)到與未處理對照的水平，而高濃度5-azaC聯(lián)合干旱處理則顯著降低了兩材料果糖的含量，而且品種間不存在顯著性差異(圖5-C)。

2.2.6 水稻葉片SnRK1基因表達(dá) 蔗糖非發(fā)酵1(Sucrose nonfermenting-1，SNF1)蛋白激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的能量和逆境的樞紐，在水稻中SnRK1亞家族包括3個(gè)基因，分別是OsSnRK1A、OsK24和OsK35[22]，并且與蔗糖含量密切相關(guān)[23]。從圖6可以看出，水稻的3個(gè)SnRK1基因的表達(dá)無論在單獨(dú)模擬干旱處理還是在50.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合干旱處理均顯示了兩材料的差異，且PC大于WT，但在高濃度100.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合干旱處理則沒有顯著差異，提示蔗糖和糖信號基因表達(dá)的差異可能是導(dǎo)致水稻DNA甲基化水平差異的內(nèi)在機(jī)制。

圖5 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片蔗糖、葡萄糖和果糖含量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of 5-azaC on sucrose，glucose and fructose contents of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

圖6 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片SnRK1s基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different concentrations of 5-azaC on the relative gene expression of SnRK1s of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.2.7 水稻葉片甲基化酶基因的表達(dá) 作為最普遍類型的胞嘧啶甲基化，植物CG甲基化由主要的CG甲基化酶和甲基轉(zhuǎn)移酶1(MET1)保持，MET1基因的主要作用是保持CpG的甲基化[24]。水稻基因組中有2個(gè)MET1基因，分別為OsMET1a[25]和OsMET1b[26]。如圖7可知，與對照相比，DS處理降低了水稻的2個(gè)MET1基因的表達(dá)，而50 μmol/L 5-azaC+DS處理與DS處理下PC的OsMETIa表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但是進(jìn)一步降低了WT的基因表達(dá)水平，而高濃度5-azaC+DS干旱處理進(jìn)一步顯著降低了兩材料的基因表達(dá)水平，仍然可以看出，PC的表達(dá)大于WT(圖7-A)，而對于OsMET1b，與其單獨(dú)干旱處理(B)相比,低濃度5-azaC+DS處理(H)顯著誘導(dǎo)了供試水稻的OsMET1b增加，但是對于同一處理(H)，PC的誘導(dǎo)水平顯著大于WT，而高濃度則顯著降低了PC相關(guān)的基因表達(dá)；而對高濃度WT的表達(dá)，與其低濃度的相比，則仍顯示顯著增加趨勢(圖7-B)，看來，DNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)水平與其5-azaC處理的表現(xiàn)一致，PC顯著高于WT。

圖7 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片OsMET1基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of different concentrations of 5-azaC on the relative gene expression of OsMET1 of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.3 水稻劍葉的光合參數(shù)

進(jìn)一步通過盆栽試驗(yàn)，在生育后期，自然干旱處理并聯(lián)合噴施50.0，100.0 μmol/L 5-azaC溶液，觀察不同處理下水稻劍葉的光合參數(shù)的變化。如圖8-A可知，兩濃度均顯著抑制了水稻的凈光合速率，并沒有觀察到與芽期和苗期低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的趨勢，但在兩濃度下PC的凈光合速率數(shù)值始終顯著高于同樣處理下WT的，無論是對照，還是單獨(dú)或聯(lián)合干旱處理，PC仍然高于WT；50.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理顯著降低了水稻的氣孔導(dǎo)度，而100.0 μmol/L 5-azaC則顯著提高兩材料的氣孔導(dǎo)度(圖8-B)；蒸騰速率也是類似的表現(xiàn)(圖8-D)；相應(yīng)地，降低了100.0 μmol/L 5-azaC處理下的水分利用率(圖8-E)，而只提高WT的羧化效率(圖8-F)，看來，DNA甲基化抑制劑對生育后期水稻植株光合特性的影響更復(fù)雜。

圖8 自然干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻開花后14 d劍葉的光合參數(shù)的影響Fig.8 Light parameters of the flag leaf in different varieties on 14th day after flowing at different 5-azaC concentrations under natural drought conditions

2.4 5-azaC對水稻產(chǎn)量構(gòu)成因子的影響

如表3盆栽試驗(yàn)結(jié)果所示，單獨(dú)干旱處理顯著降低了水稻的株高，50.0 μmol/L 5-azaC+DS處理對水稻株高沒有顯著影響，與DS的類似，而高濃度100.0 μmol/L 5-azaC+DS處理顯著降低了WT的株高；DS處理也減少了單株穗數(shù)，5-azaC+DS處理可以部分緩解單株穗數(shù)的減少，其中PC的效果顯著，而WT的并不顯著；DS和50.0 μmol/L 5-azaC+DS對穗長影響不顯著，高濃度5-azaC+DS顯著降低了WT的穗長；穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量的表現(xiàn)與穗長的類似；DS處理也顯著減少了水稻的單穗實(shí)粒數(shù)，而且WT顯著小于PC。值得注意的是，與對照相比，DS和50.0 μmol/L 5-azaC+DS處理降低了WT的結(jié)實(shí)率，而高濃度的5-azaC+DS處理則顯著增加了水稻的結(jié)實(shí)率，但是由于DNA甲基化抑制劑對產(chǎn)量構(gòu)成的其他因子均呈負(fù)效應(yīng)，因此，最終的單株產(chǎn)量，2個(gè)DNA甲基化抑制劑聯(lián)合干旱處理對干旱條件下水稻產(chǎn)量的下降沒有顯著的緩解效果，其中高濃度100.0 μmol/L 5-azaC+DS處理對WT的抑制效果更大，顯著低于其DS和50 μmol/L 5-azaC+DS，可見，DNA甲基化水平在生育后期的調(diào)控更復(fù)雜，產(chǎn)量和劍葉的凈光合速率的變化類似，均是負(fù)效應(yīng)。

表3 不同水稻材料在不同處理下產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的變化Tab.3 Yields and composition of different varieties at different treatments

3 討論

DNA甲基化可通過調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響植物生長發(fā)育過程[27]。水稻在胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)和苗的生長等不同的生育期均具有不同的DNA甲基化動態(tài)變化[28]。水稻不同組織的DNA甲基化水平也有差異，如水稻胚乳中全基因組DNA 甲基化程度比胚中的低，主要表現(xiàn)為胚乳中儲存蛋白和淀粉合成相關(guān)基因的甲基化水平較低[29]。栽培稻遼粳944、藥用野生稻以及它們雜交后代的葉片和小穗DNA甲基化水平出現(xiàn)相同的趨勢，且隨著生長發(fā)育的進(jìn)行，DNA甲基化水平均呈下降趨勢，雜種的總甲基化水平高于雙親[30]。本研究進(jìn)一步通過DNA甲基化抑制劑(5-azaC)聯(lián)合干旱處理觀察到，在不同生育期，5-azaC對水稻干旱脅迫作用濃度不同，呈現(xiàn)芽期<苗期，且在同一生育期，表現(xiàn)為低濃度緩解干旱的抑制，而高濃度則加重干旱的抑制；本研究設(shè)置的5-azaC作用濃度對水稻生育后期效應(yīng)不顯著，高低濃度的5-azaC均顯著降低了干旱脅迫下水稻株高、劍葉的凈光合速率和單株產(chǎn)量，呈負(fù)效應(yīng)，其中5-azaC 作用于PC濃度均高于WT，顯示其具有較高的DNA甲基化水平。

逆境脅迫常常會引發(fā)植物DNA甲基化狀態(tài)的改變，這種改變會啟動植物體內(nèi)與逆境相關(guān)基因的表達(dá)以及某些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座，從而使植物能夠應(yīng)對外界不良環(huán)境[31]。水稻在干旱脅迫下DNA甲基化動態(tài)水平因品種、年份以及組織而異，而且部分基因的甲基化位點(diǎn)可以穩(wěn)定遺傳后代。如以中旱3號、汕優(yōu)63和矮仔占為材料，在10% PEG6000模擬干旱處理下研究其DNA甲基化動態(tài)變化表明，不同水稻品種的DNA甲基化程度存在品種間差異，其中中旱3號和汕優(yōu)63葉片中活性甲基循環(huán)過程受干旱脅迫誘導(dǎo)增加(甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)增加)，而矮仔占葉片中這一過程受到干旱脅迫的抑制(抑制了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá))[32]。在干旱脅迫處理下，降低水稻葉和根的甲基化程度有利于激活基因的表達(dá)，從而提高水稻耐旱性[33]。秈稻多基因聚合系DK151及其輪回親本IR64進(jìn)行了連續(xù)3個(gè)季節(jié)的DNA甲基化水平測定，結(jié)果表明：干旱脅迫可以使水稻DNA甲基化發(fā)生變化，啟動抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，使水稻抗旱性增強(qiáng)，這些干旱脅迫誘導(dǎo)的甲基化變化中約有四分之一的去甲基化位點(diǎn)在復(fù)水后不能恢復(fù)到原始狀態(tài)，而甲基化位點(diǎn)中約有一半不能恢復(fù)，可以遺傳給下一代[34]。在真核細(xì)胞中，5-氮雜胞苷(5-azaC)是一種抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性到基因組DNA低甲基化的類似物[35]。本研究結(jié)果表明：在干旱條件下，降低了水稻苗期葉片的甲基化酶基因的表達(dá)，低濃度的5-azaC施用繼續(xù)降低了內(nèi)源甲基化酶基因的表達(dá)，但是高濃度的施用則進(jìn)一步降低了水稻苗期葉片的保水能力，顯著低于單獨(dú)干旱處理下葉片的相對含水量，提示該濃度可能嚴(yán)重干擾了水稻內(nèi)源DNA甲基化的動態(tài)平衡。需要注意的是這種濃度的調(diào)節(jié)效應(yīng)對水稻生育后期影響不大，表明水稻DNA甲基化水平調(diào)節(jié)很復(fù)雜，短期的干旱響應(yīng)與長期的干旱耐性的作用也不同。5-azaC在芽期和苗期的干旱脅迫調(diào)節(jié)效果存在品種間差異，耐旱性較強(qiáng)的PC具有較高的5-azaC增益作用濃度。

糖作為信號分子參與了植物對非生物脅迫的過程，其中SnRK作為聯(lián)系糖和非生物逆境的樞紐而發(fā)揮重要的作用[40]。在植物SnRK家族基因根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可以分為3個(gè)亞家族，分別為SnRK1、SnRK2和SnRK3[22]。干旱條件下，PC水稻葉片中可溶性糖積累增強(qiáng)了其糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)[41]，并觀察到SnRK1[7]、SnRK2[38]和SnRK3[42]的參與，有利于其耐旱性的增強(qiáng)。本研究結(jié)果看出，與DS處理相比，50 μmol/L 5-azaC+DS處理使PC的OsMETIb表達(dá)顯著增加，而且也伴隨著其內(nèi)蔗糖、果糖含量和OSK24表達(dá)的顯著變化，其中蔗糖和果糖含量增加，OSK24表達(dá)顯著下降，而WT呈相反的變化趨勢，且與PC呈顯著差異，提示PC內(nèi)源可能通過糖信號的差異參與調(diào)節(jié)DNA甲基化對干旱的響應(yīng)，低濃度5-azaC處理誘導(dǎo)PC的DNA甲基化增強(qiáng)，但是當(dāng)5-azaC濃度提高到100 μmol/L，則均顯著抑制了兩材料的OsMETI基因的表達(dá)以及其他內(nèi)源組分差異，加劇干旱脅迫，且兩材料的耐旱表現(xiàn)差異均消除。植物DNA的甲基化和與之拮抗的去甲基化，共同決定了基因組總的甲基化水平及其分布模式，對維持正常的基因轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。而植物中主動去甲基化是通過一個(gè)雙功能糖基化酶和裂解酶直接將甲基化胞嘧啶從DNA上堿基切除修復(fù)來實(shí)現(xiàn)的[43]。需要關(guān)注的是植物中DNA甲基化過程是可逆的，會因高代而恢復(fù)逆境處理前水平。研究表明：去甲基化酶基因ROS1敲除導(dǎo)致子一代整體DNA甲基化的平衡破壞，并出現(xiàn)異常表型，如矮化和葉片變小，但該材料種植到第4代，植株總的DNA甲基化水平又可恢復(fù)到未處理水平，提示植物可能存在某種機(jī)制修復(fù)維持相對穩(wěn)定的DNA甲基化水平，從而有利于植物基因組和染色體狀態(tài)的穩(wěn)定[44]。本研究也觀察到無論是低濃度還是高濃度5-azaC均對生育后期水稻產(chǎn)生了不良影響，如矮化、凈光合速率下降和單株產(chǎn)量下降等，但對PC的影響似乎小于WT。PC對低濃度DNA甲基化抑制處理有部分耐受性，提示其內(nèi)源的DNA甲基化水平較高或者存在某種機(jī)制維持其體內(nèi)總DNA甲基化水平穩(wěn)定。PC糖信號表達(dá)差異是否參與水稻ROS1調(diào)節(jié)，有利于維持其基因組的穩(wěn)定性，值得深入研究。

低甲基化/去甲基化和誘變試劑5-azaC主要是通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性防止DNA甲基化[35]，已在不同的植物中應(yīng)用，但是因物種、劑量、時(shí)間和過程等導(dǎo)致了對植物發(fā)育的不同影響[45-52]，以往研究多用于處理離體細(xì)胞[48-49]、種子[28，37，50]或者植株發(fā)育早期如小孢子[51]以及愈傷組織[47，52]等，并可建立高頻的雙單倍體技術(shù)[51]、抗病[47，52]、抗除草劑[47]等新資源。本研究進(jìn)一步研究了其在模擬干旱條件下水稻芽期和苗期的效應(yīng)，觀察到低濃度促進(jìn)，而高濃度抑制，而且存在品種差異。但是，本研究進(jìn)一步試圖將促進(jìn)水稻芽期和苗期干旱脅迫緩解的5-azaC濃度處理生育后期水稻，期望獲得干旱緩解的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)，但是在生育后期均是負(fù)效應(yīng)，由此可知，水稻DNA甲基化水平的調(diào)節(jié)很復(fù)雜，未來要實(shí)現(xiàn)人工調(diào)節(jié)，還需要今后更多的濃度和更多的品種進(jìn)行探索。無論如何，DNA甲基化作為表觀遺傳標(biāo)記提供了一種新的變異來源，通過調(diào)節(jié)其水平增強(qiáng)非生物逆境的潛力已經(jīng)顯現(xiàn)，相關(guān)研究將為科學(xué)家和育種者從提高作物抗性和減少產(chǎn)量損失方面帶來新的研究方向。

綜上，DNA甲基化參與了水稻干旱響應(yīng)，但不同生育期表現(xiàn)不同。其中糖信號在調(diào)節(jié)DNA甲基化機(jī)制以增強(qiáng)PC水稻干旱耐性中起重要作用。