基于高通量測序的設施連作果類菜根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

姜 偉，白紅梅，薛國萍，杜金偉，高 婧，李 杰，慕宗杰，胡玉珍，宋慶成

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.赤峰市農(nóng)牧科學研究院，內(nèi)蒙古 赤峰 024031；3.寧城縣農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古 寧城 024200)

土壤微生物作為溫室土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，土壤中80%～90%的反應中均有微生物參與，有助于作物的營養(yǎng)獲取，并承擔著養(yǎng)分循環(huán)、分解、作物生產(chǎn)及病蟲害防治的作用，同時與植物保持著十分密切的互作關系[1]，因此不同蔬菜連作生產(chǎn)中會引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[2]，細菌作為微生物中含量最多、豐富度最高的類群，在土壤生態(tài)過程中有著不可或缺的地位，因此加強對土壤細菌群落的研究就顯得極為重要。

截止到2016年我國設施蔬菜栽培面積達到370萬 hm2[3]。而隨著設施農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化和集約化的發(fā)展，許多地方出現(xiàn)了“一鄉(xiāng)一品”、“一村一品”的種植模式，蔬菜的種植種類單一，導致單一作物的復種指數(shù)增加[4-5]，加劇了土壤的連作障礙。作物的連作通常導致土壤微生物多樣性減少，使土壤細菌群落結(jié)構(gòu)趨于簡化，土壤微生態(tài)環(huán)境惡化[6]，最終降低作物產(chǎn)量[7]。目前，土壤連作障礙已經(jīng)成為限制設施蔬菜栽培可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一[8]。研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性除了受溫度、土壤養(yǎng)分、土壤類型和土壤管理等[9-10]的影響外，還包括植被類型的影響。關于土壤微生物群落多樣性與植被關系的研究主要在不同植被類型[11-12]、土地管理方式[13-14]、病害[14]、植被的不同演替階段[15]等方面，但關于設施連作不同果類菜對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響的研究較為鮮見。本研究以露地土壤為對照，分別對比連作5 a的番茄、黃瓜、茄子、辣椒等作物的根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，探討設施連作的不同果類菜是否會對土壤細菌群落造成影響，旨在從設施果類菜根際土壤微生物方面入手，為設施連作作物的生產(chǎn)實踐和可持續(xù)種植提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗土樣為內(nèi)蒙古設施蔬菜主產(chǎn)區(qū)赤峰市寧城縣大城子鎮(zhèn)萬畝番茄基地、一肯中鄉(xiāng)辣椒和茄子基地、大雙廟鎮(zhèn)黃瓜基地連續(xù)栽培5 a的日光溫室土樣，2018年3月在大城子鎮(zhèn)瓦南村采集連作番茄根際土壤，2018年6月在大雙廟鎮(zhèn)、一肯中萬家營子村和葛家窩村分別采集黃瓜、辣椒和茄子根際土壤，所有根際土壤均在果類菜拉秧前取樣，每種果類菜取3個根際土樣，露地土壤分別在4種果類菜相鄰露地各取1份土樣，供試土樣16份。

1.2 采樣點基本情況

寧城縣位于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市南部，地處燕山山脈東段北緣，處于東經(jīng)118°21′26″～119°55′25″，北緯41°16′17″～41°57′53″。該地屬于溫帶半干旱大陸性季風氣候，四季分明，冬季嚴寒少雪，夏季雨量集中，多在7，8月份，春秋兩季南北氣流交互劇烈，形成多風少雨的特點，日照時數(shù)2 800～3 100 h。年降雨量430～500 mm，蒸發(fā)量約1 517 mm。試驗地從2013-2018年種植同一個蔬菜，番茄一年兩茬，越夏茬每年3月底4月初開始種植，到9月初拉秧清棚；越冬茬9月底10月初種植，翌年3月拉秧清棚。黃瓜、辣椒、茄子一年一大茬栽培，每年9月中旬至10月初定植，翌年6月初拉秧清棚。4種果類菜基肥為農(nóng)家肥250 m3/hm2、氮磷鉀復合肥900 kg/hm2、抗重茬菌肥60 kg/hm2，番茄一年兩茬，追肥12次、黃瓜一年一大茬，追肥16次、茄子和辣椒一年一大茬追肥14次，盛果期每10 d追肥1次，每次施氮磷鉀復合肥和高鉀肥450 kg/hm2。

1.3 土壤樣品的采集

土壤樣品的采集采用抖根法。于2018年3，6月作物拉秧前采集各供試果類菜的根際土壤，每種蔬菜種類取3個重復，每個重復隨機取5個樣點，每樣點選取3株作物，先鏟去作物根際表層0～5 cm的土壤，取5～20 cm附著于根毛上的土壤裝入無菌自封袋后充分混勻后，裝進外旋凍存管保存液氮處理后保存在-80 ℃冰箱中，用于土壤微生物的測定。

1.4 土壤細菌的測序分析

土壤細菌DNA的提取：利用土壤DNA抽提微生物群落總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA，確保提取質(zhì)量，用NanoDrop2000超微量紫外分光光度計選取DNA純度和含量較高的樣品進行下一步的試驗。

PCR擴增及產(chǎn)物的純化：使用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對16S rRNA基因V3～V4 可變區(qū)進行 PCR擴增，PCR反應條件：預變性95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個循環(huán)；然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后10 ℃進行保存。用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA純化回收試劑盒回收。PCR回收產(chǎn)物后，并用QuantusTMFluorometer(Promega，USA)對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：①接頭鏈接；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR擴增進行文庫模板的富集；④磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。最后將PCR產(chǎn)物利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

高通量測序的結(jié)果分析：本研究進行的高通量測序數(shù)據(jù)分析均基于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司所提供的云服務(https：//www.https：//cloud.majorbio.com)進行，項目號為MJ20190704156. 所用到的數(shù)據(jù)分析軟件和算法參考上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司官方網(wǎng)站的說明。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果類菜根際土壤測序結(jié)果分析

利用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行 PCR 擴增測序，共得到有效序列768 560 條，平均長度447～525 bp，其中包含44個門、150個綱、364個目、575個科和1 046個屬。經(jīng)篩選后，露地(CK)、番茄(T)、黃瓜(C)、辣椒(P)、茄子(E)的根際土壤樣品分別得到44 331，57 647，49 424，48 616 和41 391條高質(zhì)量序列(表1)。其中稀釋曲線可以用來比較測序數(shù)量不同的樣本物種豐富度，也可說明樣本的取樣大小是否合理。由圖1可知，各處理土樣的稀釋曲線均趨于平緩，說明該測序深度包含了樣品中絕大多數(shù)細菌類型，表明測序量合理，可以用來研究細菌的群落結(jié)構(gòu)。

表1 不同作物根際土壤有效序列數(shù)Tab.1 Number of effective sequences in different crop rhizosphere soils

圖1 各樣本中OTU數(shù)的稀釋曲線圖Fig.1 Sparse graph of OTUs in each sample

2.2 不同果類菜根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 不同果類菜根際土壤OTU數(shù) 由圖2可知，露地(CK)、番茄(T)、黃瓜(C)、辣椒(P)和茄子(E)的OTU總數(shù)分別為4 715，4 136，4 128，4 362，3 983。5個樣本共有的OTU數(shù)為1 584個，露地(CK)、番茄(T)、茄子(E)、辣椒(P)和黃瓜(C)特有的OTU數(shù)分別為806，217，326，312，331，其余OTU為樣本兩兩共有的。其中露地(CK)土壤樣本中特有的OTU數(shù)最多，說明該樣本中含有較多的特有微生物種類。

2.2.2 不同果類菜根際土壤細菌門水平群落結(jié)構(gòu) 由圖3可知，各果類菜根際土壤優(yōu)勢細菌門基本相同，其中變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota)和芽單胞菌門(Gemmatimonadota)為優(yōu)勢菌門，優(yōu)勢菌門占各果類菜細菌群落總數(shù)分別為露地84.56%、番茄83.02%、黃瓜82.21%、辣椒80.67%、茄子79.25%。但各果類菜中細菌門所占相對豐度大小存在差異，如變形菌門在黃瓜(C)中相對豐度最高，為31.53%，在露地(CK)中最低，為22.34%，高低次序為：黃瓜>辣椒>茄子>番茄>露地；綠彎菌門在番茄(T)處理中最高，為20.37%，在露地(CK)處理中最低，為12.47%，高低次序為：番茄>茄子>黃瓜>辣椒>露地；酸桿菌門在露地(CK)中最高，為18.98%，在番茄(T)中最低，為5.16%，高低次序為：露地>辣椒>黃瓜>茄子>番茄；放線菌門在番茄(T)中最高，為23.56%，在黃瓜(C)中最低，為4.95%，高低次序為：番茄>露地>茄子>辣椒>黃瓜；擬桿菌門在黃瓜(C)中最高，為9.34%，在番茄(T)中最低，為4.87%，高低次序為：黃瓜>茄子>露地>辣椒>番茄；芽單胞菌門在黃瓜(C)中相對豐度最高，為8.21%，在辣椒(P)中最低，為5.01%，高低次序為：黃瓜>茄子>露地>番茄>辣椒。

圖2 細菌 OTUs 分布韋恩圖Fig.2 Venn graph of bacteria OTUs distribution

圖中柱子內(nèi)數(shù)據(jù)表示該物種所占百分比。The data in the column shows the percentage of the species.

2.2.3 不同果類菜根際土壤細菌屬水平群落結(jié)構(gòu) 在屬分類水平，露地和4種果類菜土壤細菌相對豐度排序前15的細菌屬，通過群落組成分析，物種和樣本間相似性的豐度會進行聚類，并將結(jié)果呈現(xiàn)在群落Heatmap圖上，可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化來反映不同分組。在屬水平上，土壤中細菌根據(jù)豐度高低共聚成3個大簇，豐度高低次序為：第Ⅰ簇>第Ⅱ簇>第Ⅲ簇(圖4)。第Ⅰ簇包含了高豐度細菌，主要種類為norank_f__Vicinamibacteraceae、norank_f__norank_o__vicinamibacterales、norank_f__norank_o__SBR1031、芽單胞菌屬(norank_f__Gemmatimonadaceae)和norank_f__A4b，這5個屬在不同果類菜根際土壤中豐富度高低次序為：辣椒>露地>茄子>黃瓜>番茄，由深紅色變?yōu)闇\粉。

第Ⅱ簇包含了中豐度細菌，不同果類菜的優(yōu)勢菌群明顯不同，如鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在番茄(T)和黃瓜(C)土壤中豐富度極低(白色～淺藍色)，其他果類菜根際土壤中豐富度較高(粉色)；RB41在露地(CK)和黃瓜(C)土壤中豐富度較高(淺粉色)，而其他果類菜根際土壤中豐富度極低(淺藍色～深藍色)；MND1在番茄(T)和茄子(E)土壤中豐富度極低(淺藍色)，其他作物土壤中豐富度相對較多(粉色)；norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96在露地(CK)土壤中豐富度較高(粉色)，其他作物土壤中豐富度極低(白色～藍色)。

第Ⅲ簇包含了微豐度細菌，茄子(E)土壤中優(yōu)勢菌群均存在一定程度的交疊，區(qū)域顏色相近，表明它們的群落結(jié)構(gòu)相似性高，而露地(CK)和其他果類菜根際土壤的顏色變化明顯不同，說明它們的群落結(jié)構(gòu)差異明顯。而且不同果類菜的優(yōu)勢菌群明顯不同，norank_f__JG30-KF-CM45在番茄(T)土壤中豐富度最高，茄子(E)土壤中豐富度相對較高，其他處理中極低(白色～深藍色)；

根據(jù)細菌群落豐度組成，露地土壤和4種果類菜根際土壤的細菌物種豐度(%)可以聚成兩類，番茄(T)和茄子(E)為一類，辣椒(P)、黃瓜(C)和露地(CK)為一類，相似度較高。

2.2.4 不同果類菜根際土壤優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬組間差異性 基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù)進行露地(CK)土壤和番茄(T)、黃瓜(C)、辣椒(P)和茄子(E)等4個果類菜根際土壤進行前15種優(yōu)勢門(圖5-A)和優(yōu)勢屬(圖5-B)的組間差異顯著性檢驗分析，結(jié)果表明，在門水平，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、髕骨細菌門(Patescibacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota)、異常球菌門(Deinococcota)和Methylomirabilota在不同果類菜根際土壤之間有顯著或極顯著差異，其中異常球菌門(Deinococcota)差異極顯著(圖5-A)。在屬水平，norank_f__Vicinamibacteracea、norank_f__Vicinamibacterales、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、norank_f__JG30-KF-CM45、α變形菌屬(norank_f__norank_o__norank_c__Alphaproteobacteria)、RB41、norank_f__AKYG1722、norank_f__norank_o__S085和norank_f__norank_o__norank_c__S0134_terrestrial_group在不同果類菜根際土壤之間有顯著差異(圖5-B)。

圖4 不同果類菜根際根際土壤在屬水平的細菌類群比較Fig.4 Community heatmap analysis on genus level in rhizosphere soil of different treated soils

同組不同字母表示差異顯著(P<0.05) 。Different letters in the same group meant significant difference at 0.05 level.

2.3 不同果類菜根際土壤細菌多樣性分析

2.3.1 α-多樣性分析 α-多樣性指數(shù)能夠反映微生物群落的多樣性和豐富度。其中，ChaoI指數(shù)和ACE指數(shù)反映物種豐富度，Shannon指數(shù)反映群落多樣性，Simpson指數(shù)反映物種優(yōu)勢度。由表2可知，與露地(CK)相比，除黃瓜(C)種植后細菌豐富度和多樣性指數(shù)降低，其他3個蔬菜均升高。稀釋后的物種豐富度指數(shù)：ChaoI指數(shù)介于3 320.79～4 039.87，ACE指數(shù)介于3 357.06～4 037.38，其中辣椒(P)的ChaoI指數(shù)和ACE指數(shù)均最高，說明種植辣椒后土壤豐富度最高。香農(nóng)指數(shù)在露地(CK)和黃瓜(C)間存在顯著差異，辣椒(P)的香農(nóng)指數(shù)最高，為6.82，表明了種植辣椒的土壤細菌群落多樣性最高。優(yōu)勢度指數(shù)在露地和4個果類菜之間不存在顯著差異，其中黃瓜(C)處理的優(yōu)勢度指數(shù)最大，為0.004 3，說明種植黃瓜后土壤優(yōu)勢菌群最高，分布最為均勻。

表2 不同果類菜根際土壤細菌多樣性指數(shù)變化Tab.2 Changes of bacterial diversity index in rhizosphere soil of different fruit vegetables

2.3.2 β-多樣性分析 主坐標軸分析(Principal co-ordinates analysis)，是一種對數(shù)據(jù)進行降維的非約束性分析方法，可以反映不同樣本的群落組成相似性和差異性。由圖6可知，同種果類菜根際土壤的樣本聚在一起；而不同種類果類菜土壤的樣本分別分布在不同的區(qū)域，番茄(T)、黃瓜(C)和茄子(E)分布在PC1負方向，露地(CK)和辣椒(P)分布在正方向；此外，可以明顯看出露地和4種果類菜之間都有明顯的距離，說明土壤細菌群落組成結(jié)構(gòu)不同，表明4種果類菜之間和露地的細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。因此，該結(jié)果表明不同作物類型顯著影響土壤細菌群落構(gòu)成。

圖6 不同果類菜根際土壤細菌β-多樣性的二維主坐標分析(PCoA)Fig.6 Principal coordinate analysis(PCoA)two-dimensional diagram of bacterial diversity in rhizosphere soil of different fruit vegetables

3 結(jié)論與討論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及群落多樣性受作物類型影響[16]，由于不同作物的生長習性不同，對土壤養(yǎng)分的吸收及根系分泌的不同，導致不同作物根際土壤生態(tài)微環(huán)境發(fā)生變化，進而導致細菌組成和豐富度發(fā)生變化[17]。本研究表明，與露地相比，露地因其光照、雨水、栽培管理和地表植被豐富，向土壤中歸還有機物多，所以利于土壤微生物的繁殖，因而土壤微生物量高[12，18]。本研究中露地土壤OTU數(shù)最高，說明露地有較高的土壤微生物量，與相關學者的基本一致。

通過Illumina MiSeq高通量測序技術，研究設施連作5 a的番茄、黃瓜、辣椒、茄子果類菜的根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，探討設施連作的不同果類菜對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。共獲得768 560條有效序列，其中包含44個門、150個綱、364個目，575個科和1 046個屬。對5組土樣細菌群落在門和屬分類水平上的優(yōu)勢菌分布特征進行分析，發(fā)現(xiàn)變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門為各處理豐度較高的優(yōu)勢菌，這些菌群在其他一些研究中也被認為是優(yōu)勢種群[19]，這說明設施連作根際土壤具有一般土壤微生物優(yōu)勢菌群組成的共性，只是占比不同。已有研究表明，變形菌門的微生物多為兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活微生物，該門的鞘氨醇單胞菌屬有去除難降解污染物的能力[20]，酸桿菌門是土壤中的一類重要菌群，在土壤中可降解植物殘體，參與鐵循環(huán)、單碳化合物代謝以及光合作用等物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)環(huán)境構(gòu)建過程[21]，可以作為較貧瘠土壤環(huán)境的指標[22]，其豐度越低，土壤質(zhì)量越高。本研究中種植黃瓜處理變形菌門最高，酸桿菌門最低，分別占所有細菌群落總數(shù)31.53%和4.95%，不同果類菜的酸桿菌門豐度高低順序為：番茄>露地>茄子>辣椒>黃瓜；說明連作黃瓜根際土壤有益菌群高于其他蔬菜和露地。生產(chǎn)中瓜果類蔬菜連作障礙嚴重，但本研究中黃瓜的優(yōu)勢菌群高于其他果類菜，這可能與試驗布置前當?shù)厍? a采用秸稈反應堆技術改變優(yōu)勢菌豐度有關。放線菌能夠分解纖維素和木質(zhì)素，豐富的放線菌有利于土壤中植物有機殘體的分解[23]，本研究中連作番茄處理酸桿菌門豐度最高，放線菌風度最低，說明連作番茄土壤質(zhì)量相對最差，這可能與番茄栽培模式有關，由于番茄一年兩茬次，中間沒有休閑時間導致某些菌群富集，降低土壤菌群質(zhì)量。同時，各細菌門和屬分類在不同果類菜中的相對豐度存也在顯著性差異，根據(jù)露地土壤和4種果類菜細菌群落豐度組成可以聚成兩類，番茄和茄子為一類，辣椒、黃瓜和露地為一類，相似度較高，可能因為番茄和茄子根系要比其他作物根系發(fā)達，從土壤吸收養(yǎng)分差異導致整個土壤均屬豐度發(fā)生變化。經(jīng)Alpha多樣性和Beta多樣性分析，不同果類菜的根際土壤細菌群落豐富度和多樣性存在一定的差異，與露地土壤相比種植番茄、辣椒、茄子后土壤中細菌香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均有所提高，而黃瓜作物根際土壤與露地土壤的群落多樣性存在顯著性差異。群落豐富度和多樣性高低次序為：辣椒>番茄>茄子>露地>黃瓜，4個作物類型中群落豐富度和多樣性有差異但不顯著。從細菌在門和屬分類水平上的組成可以得知，雖然4種個果類菜群落豐富度和群落多樣性差異不大，但在細菌群落構(gòu)成有顯著性差異，這可能是由于不同果類菜的根系分泌物不同，從而導致細菌群落結(jié)構(gòu)的變化。上述結(jié)果與孫倩等[12]對谷子(Setariaitalica)、藜麥(Chenopodiumquinoa)、黑豆(Glycinemax)及休閑地研究結(jié)果一致，均表明不同作物根際微生物多樣性存在差異。導致的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的原因有很多方面，例如栽培管理、土壤質(zhì)地、種植模式等，都會造成微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[24]。近些年，許多研究認為不同作物根系分泌物導致細菌群落組成發(fā)生變化的主要原因之一[25]。

因此，與露地相比，設施連作可以改變微生物多樣性，且不同設施連作果類菜對土壤根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性影響不同。該項研究的微生物多樣性在對常規(guī)種植的設施連作的果類菜的相關研究尚屬首次，能夠為設施連做在內(nèi)的許多農(nóng)作物領域提供參考和可持續(xù)種植提供理論基礎。