擬南芥轉錄因子MYB54的體外純化及功能初探

鄭藝超，張 昊，，趙 丹，3，王鳳茹，劉西崗，郭 琳

(1.河北師范大學 生命科學學院，分子細胞生物學教育部重點實驗室，河北 石家莊 050000； 2.河北農業(yè)大學 生命科學學院，華北作物改良與調控國家重點實驗室，河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071001；3.衡水學院 生命科學學院，河北 衡水 053000)

MYB(v-MYB avian myeloblastosis viral)是一類在植物中普遍存在的轉錄因子。30 a前，人們從玉米(Zeamays)中鑒定出了第一個植物MYB基因-COLORED1(C1)，C1基因編碼的MYB結構域蛋白是合成玉米糊粉中花青素所必需的蛋白[1]。從那時起，植物MYB基因的功能得到了人們的廣泛關注。20 a前，擬南芥基因組序列發(fā)表，首次對植物MYB基因進行了全面的描述和分類[2]。之后MYB基因在擬南芥、玉米、水稻、矮牽?；ā⒔痿~草、葡萄、白楊、蘋果和番茄等植物中的功能也通過遺傳和分子分析得到了證實[3-4]。

MYB基因表達的蛋白具有高度保守的DNA結合結構域：MYB結構域，該結構域通常由至多4個重復序列(R1、R2、R3、R4)組成，每個重復序列包含52個氨基酸，能夠形成3個α螺旋。并且每個重復序列的第二和第三螺旋會與3個規(guī)則間隔的色氨酸殘基形成螺旋-轉角-螺旋(HTH)結構，其中色氨酸殘基構成了三維HTH結構中的疏水核心[5]。MYB蛋白可分為1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB(4個R1/R2的重復)4種不同的亞類[6-7]。迄今分離出的大多數植物MYB基因編碼的DNA結合域由2個重復序列構成，這2個重復序列與動物c-MYB蛋白的R2和R3重復序列最相似[8-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，MYB基因是microRNA(miRNAs)和ta-siRNA(ta-siRNAs)的靶點[11]，同時MYB轉錄因子也是其他調控因子的直接靶點[12]。MYB轉錄因子在植物中可以發(fā)揮很多功能，例如調控初級和次級代謝，影響細胞生命活動，控制花青素和黃酮醇的生物合成[13]，調控植物生長發(fā)育[14]，參與植物對生物和非生物脅迫的響應等[15]。

迄今為止，人們已經研究和報道了很多MYB家族基因在擬南芥中的功能：AtMYB30被證明在控制下胚軸細胞伸長的油菜素內酯途徑中發(fā)揮重要作用[16]；AtMYB60和AtMYB96能夠通過ABA信號級聯(lián)調控氣孔運動[17]、干旱脅迫和抗病性[18]；AtMYB23與AtMYB5聯(lián)合調控毛狀體的伸長和分支[19-20]，AtMYB5還調控外種皮分化[21]；AtMYB16/MIXTA控制花瓣表皮細胞的形狀[22]，和AtMYB17一起作為早期花序發(fā)育和種子萌發(fā)的調控因子[23]；MYB28和MYB29參與植物胺脅迫響應的調節(jié)[24]；AtMYB103調控纖維素的生物合成[25]；AtMYB61發(fā)揮多效作用，影響木質素沉積[26]、黏液生成[27]和氣孔孔徑[28]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，AtMYB54參與了鹽脅迫響應，在抗逆中發(fā)揮了一定功能。闡明MYB蛋白在生長發(fā)育和干旱脅迫的功能和調控作用，能夠為預測MYB蛋白在小麥等其他植物物種中的功能提供堅實的基礎。

本研究主要對擬南芥和小麥中MYB54在不同物種之間的保守性、蛋白結構、表達模式、高溫脅迫進行了研究分析，并在擬南芥中對MYB54蛋白的誘導表達，轉錄活性進行初步探究，為MYB54在植物中的功能研究提供理論基礎，以期能在作物產量應用中提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究選擇的植物材料為蘭茲貝格(Landsberg erecta)野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)，載體構建所用的菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，蛋白誘導所用的菌株為大腸桿菌BL21(DE3)，酵母菌株為Y2HGold，此材料都為劉西崗實驗室保存。限制性內切酶、RNA反轉錄試劑盒與RT-PCR mix為Thermo公司購買，膠回收試劑盒為Biomiga公司購買。酵母轉化試劑盒為北京Coolaber公司購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 MYB54的生物信息學分析 利用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)網站和TAIR網站(http：//www.arabidopsis.org)對MYB54的蛋白序列進行搜索，并將蛋白序列導入到https：//plants.ensembl.org/index.html網站中進行不同物種之間的同源對比，利用MEGA 10軟件對不同物種之間的MYB54蛋白進行進化學分析。同時利用DNAMAN軟件預測MYB54的蛋白質結構；利用同源模型服務軟件SWISS-MODEL(http：//www.swissmodel.expasy.org/)預測MYB54蛋白三維空間結構。

1.2.2MYB54在擬南芥中的不同部位的表達量分析 選取16 h光照/8 h黑暗條件下生長了40 d的野生型擬南芥植株，取全根、蓮座葉、莖生葉、花序以及果莢組織。利用TRIzol法提取總RNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA后進行RT-PCR檢測，內參基因為UBQ5。反應總體系為10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45個循環(huán)；72 ℃制備溶解曲線。所用引物為表1所示。

1.2.3 高溫和低溫處理下擬南芥幼苗MYB54的表達量分析 將野生型Ler的種子用75%乙醇消毒后，鋪在1/2MS培養(yǎng)基中，在22 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下生長8 d后，將幼苗分別放入4，30 ℃進行高溫和低溫處理，2 h后全苗取樣，進行RNA提取，反轉錄后利用RT-PCR測定MYB54的表達量。反應總體系為10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL，內參基因為UBQ5。反應程序為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45個循環(huán)；72 ℃制備溶解曲線。所用引物為表1所示。

1.2.4 熱脅迫下小麥中MYB54基因的表達量分析 將大小均一飽滿的KN9204小麥種子，用2.5%次氯酸鈉浸泡2 min，隨后再用蒸餾水沖洗3次，沖洗干凈后，均勻擺放在盛有蛭石的培養(yǎng)皿中，并將種子放入22 ℃培養(yǎng)箱中，在16 h光照，8 h黑暗條件中萌發(fā)，待小麥長至一葉一心時期在4 ℃進行春化處理28 d，隨后將幼苗移栽進培養(yǎng)土中(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)，在12 h光照(18 ℃)，12 h黑暗(13 ℃)進行培養(yǎng)，待幼苗長至兩葉一心時，分別進行4 ℃冷處理和30 ℃熱處理，處理2 h后全苗取材，隨后利用RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒獲取cDNA進行RT-PCR檢測，反應總體系為10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL，內參基因為GAPDH。反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45個循環(huán)；72 ℃制備溶解曲線。所用引物為表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 MYB54蛋白相關表達載體的構建 利用snapgene軟件對MYB54基因 CDS序列以及pGEX-4T-1，pGBKT7表達載體進行酶切位點分析，用EcoR Ⅰ和SalⅠ 2個酶切位點對目的基因和載體進行酶切回收，25 ℃條件下，用T4連接酶將MYB54基因 CDS序列與pGST-4T-1與pGBKT7載體連接，隨后將重組質粒轉入大腸桿菌DH5α中，加500 μL無抗LB培養(yǎng)液，并均勻涂布在氨芐霉素LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取20個單菌落進行PCR鑒定，對鑒定出的陽性菌落提取質粒，利用BamH Ⅰ進行酶切驗證，將酶切正確的重組質粒送金唯智公司(GENEWIZ)進行測序。

1.2.6 pGEX-4T-1-MYB54蛋白誘導純化 考馬斯亮藍染色以及Western Blot檢測 將構建好的pGEX-4T-1-MYB54重組質粒利用熱激法轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落加入5 mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中220 r/min培育12～14 h，后轉入250 mL的氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中擴培4～5 h，待菌液OD600值達到0.6時加入IPTG，使其終濃度為0.3 μmol/L，分別在18 ℃過夜誘導，30 ℃誘導6 h，37 ℃誘導4 h。誘導結束后收集菌液，利用超聲儀對菌液進行超聲破碎，將超聲后的上清加入GST凝膠樹脂進行蛋白純化，在4 ℃搖床中孵育4～6 h，將純化出的GST-MYB54蛋白進行SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍染色，并選取最適誘導條件下的純化蛋白進行Western Blot檢測。

1.2.7 MYB54在酵母中的轉錄激活活性分析 利用酵母雙雜交系統(tǒng)對MYB54的轉錄活性進行分析，構建重組質粒pGBKT7-MYB54用于轉化酵母菌株。首先將酵母菌株Y2HGold在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取直徑2～3 mm的單克隆于3 mL YPDA培養(yǎng)液中，30 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)8 h，吸取100 μL～10 mL YPDA中，30 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)12～16 h，直至OD600達到 0.5左右。提前將1.5 mL離心管，槍頭，ddH2O高溫滅菌。用1.5 mL的離心管1 000 r/min離心2 min收集菌體2次，倒去上清并用1 mL無菌ddH2O重懸酵母；目的是洗去殘留的YPDA培養(yǎng)液，再次室溫1 000 r/mim離心2 min收集菌體，倒去上清并加入 1 mL 10× TE/LiAc，500 μL PEG8000和10 μL Carrier DNA 溶液重懸酵母；同時加入pGBKT7-MYB54重組質粒或pADT7空質粒作為對照。振蕩混勻后30 ℃水浴 30 min，每 10 min 上下顛倒混勻1次。靜置過夜后在42 ℃水浴鍋中熱激30 min，每10 min上下顛倒混勻1次。3 000 r/min離心5 min后，倒掉上清加入100 μL無菌水，重懸菌體后鋪在SD-Leu/-Trp的培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后，轉接到SD-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后，觀察酵母生長狀況。

2 結果與分析

2.1 MYB54系統(tǒng)進化樹分析以及氨基酸序列對比

利用生物信息學軟件，將擬南芥中的MYB54蛋白序列與歐洲油菜(Brassicanapus)、芥藍(Brassicaoleracea)、白菜(Brassicarapa)、亞麻薺(Camelinasativa)、圓錐南芥(ArabisalpinaA)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianaattenuata)、水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalica)、小麥(Triticumaestivum)和番茄(Solanumlycopersicum)進行了蛋白同源性分析，如圖1所示，擬南芥中的MYB54蛋白與十字花科中的芥藍、白菜、亞麻薺等同源性比較接近，分別達到了87%，87%，81%，與禾本科植物高粱、谷子和水稻的同源性較低，分別為54%，57%，47%，與小麥和番茄的同源性為42%。同時，通過圖2中MYB54的氨基酸序列比對可以看出，在不同物種之間，MYB54具有非常保守的一段氨基酸序列，這段序列包含20個氨基酸片段，位于MYB-like DNA-binding 結構域之中。

圖1 系統(tǒng)進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis

2.2 MYB54氨基酸序列的生物信息學分析

小麥作為我國主要的糧食作物之一，其中基因功能的研究對小麥育種具有重要的意義和價值，隨后筆者利用 NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)網站對MYB54蛋白分別在擬南芥和小麥中的氨基酸序列進行分析比對，結果如圖3-5所示，擬南芥中MYB54蛋白具有243個氨基酸，相對分子質量為28.169 ku，等電點為10.17。小麥中MYB54蛋白具有275個氨基酸，相對分子質量為29.881 ku，等電點為10.005 4，對比圖3-A、B可以看出，MYB54在小麥和擬南芥中存在非常保守的蛋白結構域，例如MYB-like DNA-binding結構域，該結構域在小麥和擬南芥中都存在，包含MYB蛋白的DNA結合結構域，以及與核小體滑動相關的SANT(“SWI3，ADA2，N-CoR and TFIIB”)結構域[29]。用同源模型服務軟件 SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)分別對擬南芥和小麥中的MYB54蛋白進行三維空間結構的預測，結果如圖4-A和圖5-A所示。擬南芥中MYB54蛋白在第84位疏水性最高，峰值為2.15，在第157位親水性最高，峰值為-1.71，結合ProtPram預測的平均親水性為0.03，分析可知該蛋白為親水性蛋白。小麥中MYB54蛋白在第1位疏水性最高，峰值為2.83，在第82位親水性最高，峰值為-1.58，平均親水性為0.04，預測為親水性蛋白。同時對擬南芥和小麥中MYB54蛋白的二級結構進行預測，擬南芥MYB54蛋白包含96個螺旋，36個折疊，111個卷曲。小麥MYB54蛋白包含87個螺旋，48個折疊以及140個卷曲(圖4-B-D和圖5-B-D)。綜合以上數據，可以看出小麥中MYB54蛋白與擬南芥中MYB54蛋白在保守結構域、親水性、二級結構以及三級結構都十分相似，所以對擬南芥中MYB54蛋白的研究能夠為預測小麥中MYB54蛋白功能提供有力的理論依據。

圖2 MYB54氨基酸序列同源對比Fig.2 MYB54 amino acid homology comparison

A.擬南芥MYB54蛋白序列；B.小麥MYB54蛋白序列。A. Arabidopsis MYB54 protein sequence；B. Wheat MYB54 protein sequence.

A.蛋白質三級結構預測；B.疏水性預測；C.親水性預測；D.蛋白質二級結構預測。圖5同。A.Prediction of tertiary structure of proteins；B.Hydrophobicity prediction；C. Hydrophilicity prediction；D. Protein secondary structure prediction；The same as Fig.5.

圖5 小麥MYB54蛋白質生物信息學分析Fig.5 MYB54 protein bioinformatics analysis in wheat

2.3 MYB54基因在擬南芥不同組織的表達量分析

以擬南芥野生型(Ler)為材料，利用RT-PCR分別對根、蓮座葉、莖生葉、花、果莢中的MYB54表達量進行分析，結果如圖6所示，在這些組織中MYB54均有表達，但在果莢中的表達量最高，在花序和根中的表達量次之，在蓮座葉和莖生葉中的表達量最少。綜合以上結果，猜測MYB54可能在生殖發(fā)育過程中起著重要的作用。

2.4 擬南芥MYB54基因在高溫和低溫處理下的表達量分析

對野生型幼苗進行高溫和低溫處理，2 h后檢測MYB54基因的表達量，結果如圖7所示，高溫處理后，MYB54基因的表達顯著降低，表明MYB54能夠響應高溫脅迫，而在低溫處理后，MYB54基因的表達量與對照組沒有顯著差異，這與前人在熱脅迫中MYB54功能的研究相印證。

2.5 小麥MYB54基因在高溫和低溫處理下的表達量分析

隨后對兩葉一心時期的小麥幼苗進行高溫和低溫處理，2 h后檢測了MYB54基因的表達變化，結果如圖8所示，高溫處理之后，MYB54的表達量與對照組相比下降1/2，低溫處理之后，MYB54的表達量與對照組相比沒有顯著差異，這些結果與擬南芥中MYB54基因的變化趨勢一致，表明MYB54對熱較敏感，高溫可以抑制MYB54的表達。

n=3，采用t檢驗分析數據的顯著性；不同字母表示數據之間差異顯著(P<0.05)。圖7-8同。

圖7 高溫和低溫脅迫下擬南芥MYB54基因的表達Fig.7 Expression of MYB54 gene under high and low temperature stress in Arabidopsis

圖8 高溫和低溫脅迫下小麥MYB54基因的表達Fig.8 Expression of MYB54 gene under high and low temperature stress in wheat

2.6 MYB54蛋白的誘導純化以及Western Blot分析

為了探索pGEX-4T-1-MYB54融合蛋白的最適誘導純化條件，分別在18，30，37 ℃對該蛋白進行誘導，之后通過凝膠電泳和考馬斯亮藍染色對誘導純化結果進行分析。MYB54蛋白分子量大小約為27 ku，GST蛋白分子量大小約為26 ku，故融合蛋白分子量大小約為53 ku。結果如圖9所示，18，30，37 ℃條件下，蛋白都可以被正常誘導(泳道2-4)，并且在超聲后的上清液(泳道5-7)和沉淀中(泳道8-9)都可以檢測到融合蛋白，隨后將蛋白利用GST凝膠樹脂進行純化，結果發(fā)現(xiàn)，在37 ℃條件下純化出的蛋白數量更多(泳道13)。隨后對37 ℃條件下純化出的融合蛋白利用GST抗體進行Western Blot檢測，結果如圖10所示，pGEX-4T-1-MYB54融合蛋白可以正確的表達翻譯。

2.7 MYB54轉錄激活活性分析

MYB54作為轉錄因子來發(fā)揮功能，轉錄因子具有轉錄激活或轉錄抑制活性，為了驗證MYB54的轉錄激活活性，利用了酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)進行驗證，GAL4含有DNA結合結構域(DNA-Binding domain)BD和轉錄激活結構域(Transcription-activating domain)AD。將MYB54基因的CDS連接到pGBKT7載體上，構建了MYB54-BD，如果MYB54蛋白具有轉錄自激活活性，即使沒有與其他蛋白質相互作用也可以啟動下游報告基因的表達。將構建好的MYB54-BD與不帶有其他表達蛋白的空AD共同轉入酵母中，在四缺培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，結果如圖11所示，MYB54-BD與空AD依然能夠在四缺培養(yǎng)基上生長，空AD和空BD不能在四缺培養(yǎng)基上生長，這一結果表明MYB54在酵母中具有轉錄激活活性。

M.蛋白Marker；1.蛋白誘導前；2-4.分別在18，30，37 ℃條件下誘導后的蛋白；5-7.分別在18，30，37 ℃條件下誘導后蛋白的超聲上清；8-10.分別在18，30，37 ℃條件下誘導后蛋白的超聲沉淀；11-13.分別在18，30，37 ℃條件下純化的蛋白。

M.蛋白Marker；1.GST凝膠樹脂；2.純化的GST-MYB54蛋白。M.Protein Marker；1.GST gel resin；2.Purified GST-MYB54 protein.

圖11 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測MYB54基因自激活活性Fig.11 Yeast two-hybrid system to detect the self-activating activity of MYB54 gene

3 結論與討論

MYB蛋白包含了非常保守的MYB DNA-binding結構域，該結構域通常由至多4個重復序列(R1、R2、R3、R4)組成，植物中MYB相關蛋白通常包含2個螺旋-轉角-螺旋(HTH)結構，即R2和R3重復序列[30]。據估計，擬南芥含有超過100個R2R3-MYB基因。功能數據表明，這些基因在次級代謝的調節(jié)、細胞形狀的控制、抗病性和激素反應中發(fā)揮重要作用。對擬南芥中MYB蛋白家族的MYB54蛋白進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的MYB54蛋白與十字花科的同源性比較接近，與禾本科植物的同源性較低。MYB54蛋白在小麥和擬南芥中的保守結構域、親水性、二級結構以及三級結構都十分相似，因此，探明模式植物擬南芥中MYB54蛋白的功能對小麥等農作物的研究具有重要的參考意義。MYB54基因在根、蓮座葉、莖生葉、花、果莢中均有表達，暗示該基因在植物各個部位的生長發(fā)育都可能起到一定的調控作用，但在果莢中的表達量最高，因此，猜測MYB54可能在生殖發(fā)育過程中起著重要的作用。擬南芥和小麥中，經過高溫處理后，MYB54的表達量都顯著降低，這也暗示著MYB54在對熱脅迫的響應中發(fā)揮著重要功能。MYB54蛋白的誘導條件并不嚴格，在18，30，37 ℃溫度條件下，都可以被成功誘導，但在37 ℃溫度下純化的蛋白數量更多，Western Blot檢測表明MYB54蛋白可以在體外正確翻譯表達。利用酵母GAL4體系發(fā)現(xiàn)MYB54作為轉錄因子，具有轉錄激活活性。擬南芥MYB基因家族中依然有90%的MYB基因功能尚未被完全了解，對MYB54蛋白進行了基礎的研究和初步的探索，以期為發(fā)掘更多的MYB蛋白家族功能提供理論基礎和參考指導。