小桐子磷酸葡萄糖變位酶cPGM與pPGM基因的克隆及原核表達(dá)分析

王海波，李芙蓉，楊金翠，高 永，郭俊云

(1.曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院，云南 曲靖 655011；2.曲靖師范學(xué)院 云南省高校云貴高原動(dòng)植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 曲靖 655011)

在植物體內(nèi)，蔗糖主要在細(xì)胞質(zhì)中合成，催化的酶為蔗糖合成酶(Sucrose synthase，SS)與磷酸蔗糖合成酶(Sucrose phosphate synthase，SPS)，其葡萄糖基供體都為尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)[1]，而淀粉合成主要在葉綠體中完成，催化的酶為淀粉合成酶(Soluble starch synthase，SSS)與淀粉磷酸化酶(Starch phosphorylase，SP)，其葡萄糖基供體分別為腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)與1-磷酸葡萄糖(1-P-G)[2]。1-P-G是UDPG與ADPG合成的共同底物，而1-P-G又來自于上游糖酵解(EMP)或光合作用(Photosynthesis)生成的6-磷酸葡萄糖(6-P-G)，其中，磷酸葡萄糖變位酶(PGM)可以催化1-P-G與6-P-G的互相轉(zhuǎn)化，并使兩者處于動(dòng)態(tài)平衡中[3]，以維持1-P-G與6-P-G在細(xì)胞質(zhì)與葉綠體中的濃度平衡以及蔗糖與淀粉的合成。

磷酸葡萄糖變位酶(Phosphoglucomutase，PGM)屬磷酸己糖變位酶家族。根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同，PGM分為2種，胞質(zhì)型PGM(Cytosol PGM，cPGM)定位于細(xì)胞質(zhì)，質(zhì)體型PGM(Plastid PGM，pPGM)定位于葉綠體[4]。PGM蛋白一般以單亞基存在，少數(shù)物種以同型雙亞基發(fā)揮功能，如豌豆[5]，其單亞基分子量約為60 ku，雙亞基分子量約為130 ku。對(duì)于同一物種，pPGM的氨基酸數(shù)量與分子量都較cPGM略大，所有報(bào)道的PGM最適pH值都偏堿性，在7.5～9.0。同時(shí)，不同來源的PGM對(duì)于同一底物的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax也表現(xiàn)出較大的差異，說明PGM的活性發(fā)揮具有組織特異性與底物濃度特異性[6]。

動(dòng)物與人類PGM基因的研究要早于植物，早在20世紀(jì)30年代，就在兔子與青蛙肌肉提取物中發(fā)現(xiàn)了PGM[7]，人類PGM1基因于1993年被克隆出來[8]，而植物中第一個(gè)報(bào)道的PGM基因是1994年在菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆獲得的[9]。目前，PGM基因已經(jīng)從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10]、玉米(Zeamays)[11]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[12]、豌豆(Pisumsativum)[13]等多種植物中克隆、表達(dá)及純化出來。小桐子(JatrophacurcasL.)是木本能源植物，隸屬于大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)，其種子含油量高達(dá)35%～60%，且流動(dòng)性、與石化油摻和性好，品質(zhì)優(yōu)于國內(nèi)零號(hào)柴油，達(dá)到了歐IV標(biāo)準(zhǔn)，是理想的柴油替代品[14]。小桐子是原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)的喜溫植物，低溫冷害是影響小桐子地域分布、限制小桐子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素。可溶性糖是參與小桐子抗冷性的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而PGM基因是調(diào)節(jié)可溶性糖代謝途經(jīng)的關(guān)鍵基因。關(guān)于小桐子PGM基因的研究目前還沒有報(bào)道，本研究通過同源序列比對(duì)方法克隆得到小桐子cPGM與pPGM基因的全長(zhǎng)編碼框序列，利用qRT-PCR技術(shù)研究了兩者在低溫條件下的表達(dá)特性，并構(gòu)建了兩者的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)，為小桐子PGM活性分析以及過表達(dá)與突變功能鑒定積累了數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)所用的小桐子種子來自云南省元謀縣干熱河谷地區(qū)。經(jīng)過篩選的飽滿種子，用1.5% CuSO4消毒20 min，之后用蒸餾水潤洗5次去除殘余的CuSO4，消毒后的種子置26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，用蒸餾水浸泡吸漲24 h。取白瓷盤墊5層濾紙并用蒸餾水濕潤，將吸漲的種子播于其中，在溫度26 ℃、相對(duì)濕度75%、光周期16 h/8 h的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。將發(fā)芽的種子播種于培養(yǎng)土，放置在同上條件的恒溫培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)15 d直至第2片真葉完全展開[15]。之后將小桐子幼苗置于低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行12 ℃低溫處理，分別取低溫處理0.5，3，12，24，48 h與對(duì)照(CK，正常培養(yǎng))幼苗的第2片真葉與根，以及吸漲24 h的種子，液氮速凍后保存于1.5 mL離心管中，放置于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)試驗(yàn)RNA的提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小桐子cPGM與pPGM基因的鑒定及序列分析 根據(jù)Noir等[10]鑒定的擬南芥2個(gè)cPGM基因(At1g70730、At1g23190)與1個(gè)pPGM基因(At5g51820)，利用其蛋白質(zhì)序列(NP_177230、NP_173732、NP_199995)對(duì)GenBank小桐子蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(GenBank注釋版本101)進(jìn)行BlastP相似性檢索，經(jīng)過去除重復(fù)序列，下載得到非冗余的小桐子cPGM與pPGM的基因、mRNA、蛋白質(zhì)等序列數(shù)據(jù)。小桐子cPGM與pPGM蛋白的基本參數(shù)分子量(Mw)、等電點(diǎn)(pI)利用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)軟件進(jìn)行解析。通過GenBank數(shù)據(jù)庫下載其他植物的cPGM與pPGM蛋白序列，與鑒定的小桐子cPGM與pPGM蛋白序列共同利用ClustalX軟件進(jìn)行相似性比對(duì)，并通過MEGA軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時(shí)，比對(duì)結(jié)果利用GenDOC軟件進(jìn)行cPGM與pPGM蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析。cPGM與pPGM基因結(jié)構(gòu)基于在線軟件GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行分析與繪制。染色體定位以Wu等[16]構(gòu)建的小桐子遺傳連鎖圖譜進(jìn)行錨定。

1.2.2 小桐子cPGM與pPGM基因的熒光定量表達(dá)分析 利用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取對(duì)照(CK)與不同低溫處理下的葉片、根以及吸漲種子的總RNA，之后利用DNase Ⅰ(TaKaRa公司)去除總RNA中的殘余基因組DNA，最終得到純化的總RNA。經(jīng)過濃度測(cè)定，分別取3 μg總RNA，利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司)合成第一鏈cDNA，進(jìn)行小桐子cPGM與pPGM的qRT-PCR表達(dá)分析。儀器為L(zhǎng)ightCycler96(Roche公司)，20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品重復(fù)3次。器官表達(dá)以β-Actin為內(nèi)參基因，低溫表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參基因[17]，所用引物見表1。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性10 s，53.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)，之后增加溶解曲線程序：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算。以葉片的表達(dá)量為基準(zhǔn)進(jìn)行器官差異表達(dá)分析，以對(duì)照(CK)的表達(dá)量為基準(zhǔn)進(jìn)行低溫差異表達(dá)分析。

表1 qRT-PCR試驗(yàn)中所用的引物序列Tab.1 Primers used in the qRT-PCR experiment

1.2.3 小桐子cPGM與pPGM基因的克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建及目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 根據(jù)小桐子cPGM與pPGM基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)編碼框Coding sequence(CDS)擴(kuò)增引物，引物序列為cPGM-F：5′-TGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCATGGTAGTGTTCAAGGTTTC-3′(下劃線表示EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))，cPGM-R：5′-TCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGTAATAACAGTTGGTGCAG-3′(下劃線表示XhoⅠ酶切位點(diǎn))；pPGM-F：5′-TGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCATGGCGTCTTCTTCTTGTTTC-3′(下劃線表示EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，pPGM-R：5′-TCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGTGATGACTGTAGGCTTCTC-3′(下劃線表示XhoⅠ酶切位點(diǎn))。以1.2.2中對(duì)照葉片的cDNA為模板，利用KOD FX Neo DNA Polymerase(TOYOBO公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃后延伸5 min。將擴(kuò)增片段與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1經(jīng)EcoR Ⅰ與XhoⅠ雙酶切，切膠回收后利用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接，得到重組載體，之后通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TransGene公司Trans1-T1)，涂布LB抗性平板(含50 mg/L的Amp)，37 ℃過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR以及EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定陽性的菌落，搖菌提取重組載體分別命名為pGEX-4T-1-JccPGM、pGEX-4T-1-JcpPGM，送華大基因公司進(jìn)行片段測(cè)序。

將pGEX-4T-1空質(zhì)粒以及構(gòu)建的小桐子pGEX-4T-1-JccPGM、pGEX-4T-1-JcpPGM原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株，挑取單克隆接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L的Amp)，37 ℃ 200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。之后按體積比1∶100接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L的Amp)，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6，取1 mL誘導(dǎo)前菌液至1.5 mL離心管中，置于4 ℃保存。之后，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L，于恒溫16 ℃振蕩誘導(dǎo)表達(dá)，分別取誘導(dǎo)1，3，6，12 h的菌液1.0～1.5 mL離心管中于4 ℃保存?zhèn)溆?。將以上誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)不同時(shí)間的菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體沉淀利用200 μL PBS緩沖液(pH值7.4)重懸浮，加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，100 ℃沸水中保溫10 min，取出冷卻至室溫，12 000 r/min離心5 min，取20 μL上清蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)，檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 小桐子cPGM與pPGM基因的鑒定及序列分析

根據(jù)同源序列比對(duì)，在小桐子基因組中鑒定到1個(gè)cPGM基因(GenBank登錄號(hào)：105634093)、1個(gè)pPGM基因(105648538)?；蜷L(zhǎng)度分別為7 608，8 114 bp，mRNA長(zhǎng)度分別為2 214，2 347 bp，分別編碼582，637 aa的蛋白質(zhì)。ProtParam預(yù)測(cè)顯示，cPGM與pPGM蛋白分子量分別為63.2，69.5 ku，等電點(diǎn)分別為6.06，6.27?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，小桐子cPGM基因定位3號(hào)染色體，包含19個(gè)外顯子，且包含207 bp與258 bp的5′-UTR與3′-UTR非編碼區(qū)域(圖1-A)；pPGM基因定位5號(hào)染色體，包含22個(gè)外顯子，且包含258 bp與175 bp的5′-UTR與3′-UTR非編碼區(qū)域(圖1-B)。

A.cPGM基因；B.pPGM基因。cM.厘摩；LG.染色體。A.cPGM；B.pPGM.cM.Centi morgan;LG.Chromosome.

對(duì)72種植物cPGM與pPGM蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，定位細(xì)胞質(zhì)的cPGM與定位葉綠體的pPGM明顯聚類為兩大分支，且分支內(nèi)單子葉植物(Monocotyledons)與雙子葉植物(Eudicotyledons)也單獨(dú)聚類(圖2)，說明單、雙子葉植物的PGM是分別進(jìn)化的。氨基酸序列比對(duì)表明，所有pPGM都較cPGM長(zhǎng)，且pPGM蛋白都包括長(zhǎng)度為60～90 aa的N端葉綠體定位信號(hào)肽(圖3)。另外，從N端到C端，cPGM蛋白都較pPGM蛋白多4段氨基酸序列-V/S-G-A/V/L-D-G-S-、-S/E-G-P-E-、-G-K-S-N/S/D-S/T-E/N/G-、-S-L/I-G/S/P-E/D-V-N-，且富含側(cè)鏈R基團(tuán)較小的氨基酸如Gly、Ala,酸性氨基酸如Asp、Glu以及含有羥基的氨基酸如Ser、Thr，其中，小桐子cPGM蛋白較pPGM蛋白多4段肽鏈為-108VGVDGS113-、-183SGPE186-、-283GKSNSE288-、-470SLGEVN475-(圖4-A)。空間結(jié)構(gòu)分析顯示，cPGM較pPGM多余肽段都位于蛋白立體結(jié)構(gòu)的表面β-轉(zhuǎn)角區(qū)域，且空間位置一致(圖4-B)，推測(cè)可能是cPGM蛋白的磷酸化/去磷酸化共價(jià)修飾調(diào)節(jié)序列，與4段肽鏈序列都包含Ser或Thr一致。

2.2 小桐子cPGM與pPGM基因的差異表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析小桐子cPGM與pPGM的器官與低溫表達(dá)特性。結(jié)果顯示，cPGM與pPGM基因都在葉片中高表達(dá)，而在根與種子中表達(dá)量較低(圖5-A、C)，與已報(bào)道PGM主要存在于綠色組織及光合器官的結(jié)論一致。低溫脅迫條件下，在葉片中，cPGM與pPGM基因都表現(xiàn)出2次降低-升高的表達(dá)變化特性，表達(dá)量波動(dòng)幅度較大，且分別在低溫處理12，3 h達(dá)到最大表達(dá)量，較對(duì)照分別提高1.69(P<0.05)，1.84倍(P<0.05)(圖5-B、D)。

2.3 小桐子cPGM與pPGM原核表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)

通過EcoR Ⅰ與XhoⅠ雙酶切，將小桐子cPGM與pPGM基因的編碼框序列連接至pGEX-4T-1，構(gòu)建了兩者的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-JccPGM、pGEX-4T-1-JcpPGM，通過測(cè)序驗(yàn)證均未出現(xiàn)突變。之后，分別將大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株、轉(zhuǎn)pGEX-4T-1空質(zhì)粒的菌株、轉(zhuǎn)pGEX-4T-1-JccPGM與pGEX-4T-1-JcpPGM重組質(zhì)粒的菌株經(jīng)裂解后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)(圖6)。在IPTG誘導(dǎo)的不同時(shí)間，cPGM與pPGM分別出現(xiàn)1條約90.7，97.0 ku的融合蛋白條帶，且分子量與預(yù)期大小一致，說明小桐子cPGM與pPGM基因在大腸桿菌中正確表達(dá)，而對(duì)照BL21(DE3)表達(dá)菌株(CK-1)、轉(zhuǎn)pGEX-4T-1空質(zhì)粒的菌株(CK-2)以及轉(zhuǎn)pGEX-4T-1-JccPGM與pGEX-4T-1-JcpPGM重組質(zhì)粒但未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株(0 h)都沒有出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的蛋白條帶。另外，cPGM與pPGM蛋白都在IPTG誘導(dǎo)1 h后即開始高效表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)(3，6，12 h)，cPGM表達(dá)量也在逐漸增加(圖6-A)，而pPGM表達(dá)量則保持穩(wěn)定(圖6-B)。

3 討論與結(jié)論

在植物體中，cPGM與pPGM分別催化細(xì)胞質(zhì)與葉綠體中1-P-G與6-P-G的可逆互變，以控制蔗糖和淀粉的濃度保持動(dòng)態(tài)平衡。以積累蔗糖為主的農(nóng)作物如甘蔗、甜菜等，光合作用中間產(chǎn)物或淀粉水解產(chǎn)物6-P-G主要由葉綠體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，在cPGM作用下轉(zhuǎn)化為1-P-G，進(jìn)而形成UDPG，用以合成蔗糖，而以積累淀粉為主的禾本科作物如水稻、小麥等，蔗糖降解產(chǎn)物6-P-G主要由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至葉綠體，在pPGM作用下轉(zhuǎn)化為1-P-G，進(jìn)而形成ADPG，用以合成淀粉[3]。小桐子屬多糖多酚類植物，低溫條件下，與積累蔗糖和淀粉的農(nóng)作物不同，碳素同化總量下降，可溶性糖增加，尤其會(huì)積累更多的棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharides，RFOs)[18]，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)以抵抗低溫環(huán)境，同時(shí)，也可作為糖信號(hào)參與植物低溫信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。本研究中pPGM較cPGM的低溫誘導(dǎo)表達(dá)響應(yīng)更加迅速，在低溫脅迫3 h即達(dá)到最大表達(dá)量，另外，推測(cè)小桐子在低溫條件下，pPGM較cPGM活性也較高，以加快可溶性寡糖的合成，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，提高抗冷性。

橫線表示N端葉綠體定位信號(hào)肽。The line indicates chloroplast localization signal peptide in N-terminal.

圖4 小桐子cPGM與pPGM蛋白序列與空間結(jié)構(gòu)Fig.4 Protein sequence and 3D-dimensional structure of J.curcas cPGM and pPGM

A與C分別表示cPGM與pPGM基因的器官表達(dá)特性；B與D分別表示cPGM與pPGM基因在葉片中的低溫表達(dá)分析。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Organ expression characteristics of cPGM and pPGM are indicated by A and C，respectively；Chilling expression analysis of cPGM and pPGM in leaves are showed by B and D，respectively. Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

A.cPGM基因；B.pPGM基因。CK-1.大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株；CK-2.轉(zhuǎn)pGEX-4T-1空質(zhì)粒的菌株；轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株用0 h表示；轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)1，3，6，12 h分別用1，3，6，12 h表示。M.蛋白質(zhì)Marker。

現(xiàn)有報(bào)道表明，單一野生型的等位基因已能夠滿足糖代謝的需要[19]，但從基因型顯示，cPGM包含較多等位基因，對(duì)應(yīng)多種同工酶，且功能是冗余的，同時(shí)，cPGM的表達(dá)與活性具有積累性，共同互補(bǔ)發(fā)揮細(xì)胞質(zhì)糖類合成作用。另外，本研究中蛋白序列比對(duì)表明，cPGM較pPGM多4段肽鏈，表現(xiàn)出更多樣的活性調(diào)節(jié)方式如磷酸化共價(jià)修飾調(diào)節(jié)，以適應(yīng)細(xì)胞質(zhì)中多樣糖類合成的需要。Egli等[1]獲得了擬南芥pgm2與pgm3單突變體和pgm2與pgm3雙突變體，糖類濃度測(cè)定表明，單突變體與雙突變體的蔗糖、葡萄糖及果糖濃度較野生型沒有顯著變化，且單突變體的植株表型也與野生型無異，但雙突變體的雌雄配子發(fā)育及受精能力都受到嚴(yán)重影響。另外，完全喪失cPGM活性的擬南芥的生長(zhǎng)也受到顯著抑制，植株矮小，根系不發(fā)達(dá)，生物產(chǎn)量明顯降低[20]。在小桐子基因組中僅鑒定到1個(gè)cPGM基因，較其他植物如擬南芥少，暗示其表達(dá)與功能不可替代，突變將導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷[21]，但也為后期功能驗(yàn)證提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)，過表達(dá)cPGM基因可提高小桐子蔗糖及其他可溶性糖的含量，對(duì)于培育小桐子抗冷新品種也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[19]。pPGM的等位基因則較為單一，同工酶較少，決定其功能具有不可替代性和不積累性。擬南芥pPGM突變體中淀粉的含量較野生型降低了85%，而可溶性糖如淀粉合成底物ADPG的含量則上升顯著[22-23]。Tauberger等[12]反義表達(dá)pPGM的馬鈴薯，其塊莖中淀粉含量也顯著降低，而蔗糖的含量明顯上升。另外，pPGM突變百脈根的葉片中根本無法積累淀粉，也不能發(fā)生淀粉的碘染色反應(yīng)[24-25]。以上研究結(jié)果表明，突變或反義表達(dá)pPGM都可表現(xiàn)出極顯著的淀粉含量降低，也暗示以積累淀粉為主的農(nóng)作物，通過過表達(dá)pPGM基因可能會(huì)顯著提高淀粉的積累和生物學(xué)產(chǎn)量。