異源過表達(dá)Atvip1基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因高粱對鹽堿脅迫的抗性

程欣然，蔡欣月，巖溫香，牛江帥，吳 榮，牛庭莉，穆云靜，戴凌燕

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000)

土壤鹽堿化是全球農(nóng)業(yè)的主要環(huán)境威脅，影響著全球約20%的耕地和近1/2的灌溉土地，導(dǎo)致土壤進(jìn)一步退化[1]。我國是世界鹽堿地大國，耕地鹽堿化面積為 7.6×106hm2，近 1/5 耕地發(fā)生鹽堿化，其影響正變得越來越嚴(yán)重。東北地區(qū)是我國土地鹽堿化最嚴(yán)重的地區(qū)之一，同時也是世界三大蘇打鹽堿土集中分布區(qū)之一[2]。鹽化土壤中含有大量的可溶鹽，鹽分的增加降低了土壤水勢，導(dǎo)致植物吸水困難，對植物造成氧化脅迫、離子毒性、滲透脅迫和代謝紊亂，從而影響植物的生長發(fā)育和光合作用[3-4]。除上述危害外，碳酸鈉和碳酸氫鈉等形成的堿化土壤，還會對植物造成堿環(huán)境的危害，即高pH值對植物的傷害[5]。目前，國內(nèi)外科學(xué)家在植物耐鹽分子機(jī)制研究方面進(jìn)行了大量工作，但多數(shù)研究集中在響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制，而對堿脅迫研究極少，由此很難分析天然鹽堿地綜合脅迫反應(yīng)背后的耐性機(jī)制。植物在遭受鹽堿脅迫時會產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，如不及時清除，會對自身正常的生長發(fā)育造成很大影響，包括抑制SOD、POD和CAT等的活性；降低葉綠素的含量，抑制植物的光合作用；破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使膜質(zhì)中不飽和脂肪酸過氧化作用產(chǎn)物 MDA過分累積，進(jìn)而降低植物的抗逆性[6]。

高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)具有耐旱、耐澇、耐鹽堿、耐瘠薄、耐高溫和耐干熱風(fēng)等特點(diǎn)，可在高溫、低洼和鹽堿等邊際性土地上進(jìn)行種植，具有糧飼、造酒、帚用、編織和替代能源等多種用途[7]。高粱的根系是攝取、運(yùn)輸和儲存土壤水分和養(yǎng)分的關(guān)鍵器官，也是抵御逆境脅迫的第一屏障[8]。根系結(jié)構(gòu)的變化會影響物質(zhì)運(yùn)輸、激素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此，良好的根系有利于高粱在鹽堿環(huán)境中提高自身的穩(wěn)定性，提高其對鹽堿脅迫的耐受性[9]。

研究者利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)了與VirE2(Type IV Secretion System Single-stranded DNA Binding Protein VirE2)相互作用的擬南芥蛋白并且命名為AtVIP1(ArabidopsisthalianaVirE2-interacting Protein 1)[10-12]。AtVIP1屬于擬南芥bZIP(Basic Leucine-Zipper)家族的IX亞家族，因具有2個拷貝的NLS(Nuclear Location Sequence)序列，表明此蛋白可以定位于細(xì)胞核中[13]。目前，針對VIP1轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究主要集中在模式植物擬南芥上，且重點(diǎn)關(guān)注核質(zhì)穿梭現(xiàn)象及機(jī)制。VIP1及其同系物可以與鈣調(diào)蛋白相互作用，它們的核質(zhì)穿梭需要鈣信號[14]；還可能通過14-3-3蛋白解離使VIP1去磷酸化誘導(dǎo)核定位[15]，或通過PP2A介導(dǎo)VIP1去磷酸化而入核[16]。研究表明，VIP1可能影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率[17]，還可能涉及硫的利用、淀粉積累、滲透脅迫信號傳導(dǎo)和觸摸誘導(dǎo)的根運(yùn)動[18-21]。但VIP1是否影響植物對蘇打鹽堿脅迫的抗性還未見報道。據(jù)此，本研究使用蘇打鹽堿脅迫液對異源過表達(dá)擬南芥Atvip1轉(zhuǎn)基因高粱進(jìn)行處理，通過表型和抗逆生理相關(guān)指標(biāo)分析來研究轉(zhuǎn)錄因子VIP1對高粱抵抗鹽堿脅迫的影響，為高粱耐鹽堿分子育種提供新的靶基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用沙培法，選用穴高40 mm、上口徑40 mm、下口徑15 mm、單容積40 mL 的72 孔穴育苗盤。高粱野生型資源為P898012，將擬南芥轉(zhuǎn)錄因子VIP1基因構(gòu)建35S-Atvip1過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以高粱幼胚為外植體通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得異源過表達(dá)Atvip1基因的轉(zhuǎn)基因高粱株系，經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR法檢測，轉(zhuǎn)基因高粱株系中已轉(zhuǎn)入外源擬南芥的Atvip1基因且過表達(dá)，后代經(jīng)純化后留種備用。本研究中所用轉(zhuǎn)基因種子為T4，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物基因功能實(shí)驗(yàn)室提供，命名為Atvip1-7-T4高粱。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 高粱幼苗培養(yǎng)與處理 挑選籽粒飽滿大小均一的種子，先用蒸餾水將種子洗2～3次，用75%酒精浸泡2～3 min，后用蒸餾水沖洗2～3次，再用2% 次氯酸鈉浸泡3～4 min，最后用蒸餾水沖洗5～6次，將消毒后的種子用蒸餾水萌動12 h。在培養(yǎng)皿中鋪入3 層濾紙，每皿加入10 mL蒸餾水，將萌動后的種子均勻擺放在濾紙上，每皿120 粒，25 ℃、16 h/8 h 人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑選發(fā)芽一致的種子移栽至72孔育苗穴盤中(一苗一穴)，每2 d用Hoagland營養(yǎng)液澆灌1次，培養(yǎng)條件為25 ℃、16 h/8 h。待幼苗長至三葉一心時，用Hoagland營養(yǎng)液配置NaHCO3∶Na2CO3為5∶1的脅迫液(75 mmol/L，pH 值9.63)進(jìn)行脅迫處理。在0，4，12，24，72，120 h時取樣進(jìn)行生長指標(biāo)測定，同時把部分根系用液氮速凍后置于-150 ℃冰箱凍存，用于生理指標(biāo)測定。試驗(yàn)中分為2組，野生型(WT)和過表達(dá)Atvip1轉(zhuǎn)基因株系(TR)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 高粱根系形態(tài)分析 利用單反照相機(jī)記錄每時間點(diǎn)的幼苗生長狀態(tài)。根系形態(tài)指標(biāo)用萬深LA-S系列植物圖像分析儀(根系分析獨(dú)立版)進(jìn)行掃描并分析指標(biāo)參數(shù)(根長、表面積、體積)。

1.2.4 高粱幼苗鹽堿脅迫差異轉(zhuǎn)錄組測序 取鹽堿脅迫0，4，24，72 h的TR和WT組高粱整株幼苗，利用TRIzol試劑提取總RNA，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，干冰儲存運(yùn)輸，送至上海拜譜生物科技有限公司轉(zhuǎn)錄組測序。對于具有生物重復(fù)的樣品，用DEseq對2個條件/組進(jìn)行差異表達(dá)分析。DEseq提供了利用基于負(fù)二項(xiàng)分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的統(tǒng)計例程。所得的P值使用Benjamini和Hochberg的方法進(jìn)行調(diào)整，以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。DEseq發(fā)現(xiàn)P<0.01的基因被分配為差異表達(dá)基因(DEG)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistic 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)(Independent-SamplestTest)，通過最小顯著性差異(LSD)檢驗(yàn)對2個處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P<0.05、P<0.01或P<0.001表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。利用WPS EXCEL 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計算，Prism 8軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對轉(zhuǎn)基因高粱表型及葉綠素含量的影響

大量研究顯示，在蘇達(dá)鹽堿脅迫下，植物生長發(fā)育緩慢，根系發(fā)育不良，新枝生長數(shù)少，影響植株的外部形態(tài)。鹽堿脅迫下2個處理組表型結(jié)果如圖1。在0 h，WT 組高粱只有主根，TR組高粱根系側(cè)根多，且在莖基部生出1～2條側(cè)根。從4～120 h，WT 組高粱主根在脅迫早期4 h就開始褐化，并逐漸加劇，根基部腐敗嚴(yán)重；而TR組高粱主根褐化出現(xiàn)較晚且癥狀輕。在24 h，WT組幼苗新葉出現(xiàn)卷曲，TR組新葉正常伸展；72 h，WT 組高粱生長被抑制，新葉蜷縮萎蔫；TR組新葉才開始出現(xiàn)卷曲。120 h后，WT組地上部底部葉片褐化，頂部葉片枯黃干縮；TR組老葉和新葉的伸展較好，葉片只有部分黃化。鹽堿脅迫對高粱葉綠素含量的影響如圖2，WT 組和TR 組的葉綠素含量均呈先上升后下降的變化趨勢，在24 h葉綠素含量達(dá)到最大值，但TR組葉綠素含量在各時間段內(nèi)均顯著高于WT 組?？梢婝}堿脅迫在24 h后對高粱光合作用的抑制效果較明顯，轉(zhuǎn)基因高粱可有效緩解鹽堿脅迫帶來的危害。

A.整株及地上部生長情況。B.地下部生長情況。WT.野生型；TR.過表達(dá)Atvip1基因植株。A.Growth of whole plant and aboveground parts. B.The growth of the underground part. WT. Wild type；TR.Plants with overexpression of Atvip1 gene.

2.2 鹽堿脅迫對轉(zhuǎn)基因高粱根系生長相關(guān)指標(biāo)的影響

在鹽堿脅迫下，根系生長形態(tài)的優(yōu)良決定植株的發(fā)育情況。鹽堿脅迫后WT和TR組高粱根系的表面積、體積、根尖數(shù)、分叉數(shù)動態(tài)結(jié)果如圖3。2組高粱根系生長隨脅迫時間延長出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0～12 h，TR組高粱的表面積、體積、根尖數(shù)呈上升趨勢，顯著高于WT 組高粱，但分叉數(shù)差異不顯著。在24 h，TR組高粱顯著優(yōu)于WT組高粱，各指標(biāo)達(dá)到最大值。在72～120 h，2組高粱的根系生長指標(biāo)降低，但TR組高粱生長指標(biāo)除分叉數(shù)外均顯著高于WT 組高粱。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖3-5同。The different small letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).The same as Fig.3-5.

圖3 鹽堿脅迫對高粱根系生長相關(guān)指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of saline-alkali stress on the growth indexes of sorghum roots

2.3 鹽堿脅迫對轉(zhuǎn)基因高粱根系抗氧化酶系統(tǒng)的影響

圖4 鹽堿脅迫下高粱根系抗氧化酶系統(tǒng)動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of antioxidant enzyme system in sorghum roots under saline-alkali stress

2.4 鹽堿脅迫對轉(zhuǎn)基因高粱根系MDA含量的影響

MDA是具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，能與膜結(jié)構(gòu)上的酶和蛋白質(zhì)相結(jié)合，發(fā)生交聯(lián)作用而使其失活，從而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)被破壞。由圖5可知，脅迫初期0，4 h，TR組根系MDA含量顯著高于WT組；在12 h，TR組根系MDA含量快速下降，且顯著低于WT 組；在 24，72，120 h，TR組高粱根系MDA含量開始增加，但仍顯著低于WT組?？梢?，在鹽堿脅迫24 h內(nèi)，異源過表達(dá)Atvip1基因高粱可將MDA控制在較低水平。

2.5 鹽堿脅迫差異轉(zhuǎn)錄組中DEGs的COG注釋

對差異轉(zhuǎn)錄中發(fā)現(xiàn)的DEGs進(jìn)行COG功能預(yù)測和分類。在1 413 個NR位點(diǎn)中，510 個 DEGs被歸為COG分類。因一個DEG可以被分配給多個COG功能，因此，共獲得611 個COG 功能注釋，這些注釋被分為25 個功能類別(圖6)。其中，防御機(jī)制類別中有62個COG功能注釋，占10.15%。在各個時間內(nèi)，防御機(jī)制所涉及的DEGs數(shù)量占比較大(圖6中紅色箭頭所示)，而在4 h，防御相關(guān)的差異基因最多。

圖5 鹽堿脅迫對高粱MDA含量的影響Fig.5 Effects of saline-alkali stress on MDA content of sorghum

2.6 鹽堿脅迫下差異轉(zhuǎn)錄組中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)分析

為進(jìn)一步分析在脅迫過程中，抗氧化酶在轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)情況，本研究從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選出這5類抗氧化酶差異表達(dá)基因共42 個，并針對基因表達(dá)量(FPKM值)采用TR組/WT組的差異倍數(shù)進(jìn)行熱圖分析(圖7)。結(jié)果顯示，7個SOD基因，包括Cu，Zn-SOD(Sb02g042170、Sb01g035350、Sb07g023950和Sb01g042660)和Fe，Mn-SOD(Sb10g002970、Sb09g011450和Sb06g025970)；22個POD基因、3個CAT基因、3個GR基因和7個GSH-PX基因在TR和WT 2組中不同時間上的表達(dá)量存在差異；與WT組相比，TR組同一類酶的各個相關(guān)基因表達(dá)水平在不同時間上有上調(diào)和下調(diào)2種方式，各基因轉(zhuǎn)錄水平上與抗氧化酶蛋白水平上在各時間表達(dá)不完全一致，它們之間沒有明顯的相關(guān)性。

圖6 DEGs的COG注釋分類統(tǒng)計Fig.6 DEGs COG annotated classification chart

3 討論

鹽堿危害是導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低的主要因素之一，對植物的生長發(fā)育具有明顯的抑制效應(yīng)，生物量的積累也會下降。為了適應(yīng)鹽堿環(huán)境，植物通常改變自身形態(tài)和生理代謝來維持生存[23-24]。根是首先接觸鹽堿脅迫的器官，在鹽堿感應(yīng)中起重要作用[25-26]。植物受鹽堿脅迫后，大量失水或吸水困難，導(dǎo)致植物滲透系統(tǒng)失控，從而大量減產(chǎn)[27]。VIP1是bZIP轉(zhuǎn)錄因子，是MPK3的靶標(biāo)，被認(rèn)為與植物防御反應(yīng)有關(guān)[16]。Lapham等[28]發(fā)現(xiàn)，vip1突變體植株對鹽生長的耐受性發(fā)生改變，表明vip1在鹽脅迫中起作用，但其具體作用機(jī)制未知。本研究中，與野生型WT組相比，過表達(dá)Atvip1基因的TR組無論是地上部還是地下部均對蘇打鹽堿脅迫具有較強(qiáng)抗性，體現(xiàn)為根系表面積和體積增大，根尖數(shù)及分叉數(shù)增多，根部褐化晚且根基部腐敗較輕。地上部幼苗新葉伸展及生長受抑制較小，葉綠素含量顯著高于野生型?？梢姡^表達(dá)Atvip1基因可通過降低鹽堿脅迫對植株光合作用和生長發(fā)育的影響，從而提高高粱抗性。

圖7 高粱抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵酶基因量差異倍數(shù)表達(dá)熱圖Fig.7 Heat map of key enzyme gene expression in antioxidant system of sorghum

分析鹽堿脅迫下WT組和TR組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，DEGs的COG功能顯示，脅迫4 h，參與防御機(jī)制的差異基因所占的比重大幅度增加，在24，72 h時仍保持較高占比。篩選獲得了42個與SOD、CAT、POD、GR和GSH-PX等抗氧化酶相關(guān)的差異基因，TR組酶活性動態(tài)變化有上調(diào)、下調(diào)2種調(diào)節(jié)方式，這與張貝貝[35]研究甜瓜對鹽堿脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果類似。本研究中抗性酶在基因水平和蛋白水平表達(dá)情況存在差異，原因可能有2種：一方面是取樣不同，差異轉(zhuǎn)錄組測序是針對整個植株開展，而抗性酶活性測定僅針對根系進(jìn)行；另一方面是分子調(diào)控機(jī)制，基因的表達(dá)存在短時間應(yīng)激高表達(dá)，但大部分基因在應(yīng)激過后還會下降，而蛋白可能維持一個相對長時間的上調(diào)；同時一個基因可能會有多個轉(zhuǎn)錄本，且還存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后修飾等過程。

從鹽堿脅迫的時間節(jié)點(diǎn)可以看出，鹽堿脅迫4 h后，高粱已啟動了基因表達(dá)、抗氧化酶活性升高和防御機(jī)制增強(qiáng)等過程，且該過程一直持續(xù)至24 h。鹽堿脅迫24 h是一個重要節(jié)點(diǎn)，在這之前植物通過積極調(diào)控體內(nèi)各種生理生化代謝過程來抵御脅迫造成的傷害，從而保障生長發(fā)育順利進(jìn)行；24 h之后，由于脅迫的持續(xù)影響，導(dǎo)致代謝過程和生長發(fā)育均受到嚴(yán)重抑制。過表達(dá)Atvip1基因高粱在整個脅迫過程中無論在代謝過程還是生長發(fā)育方面均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，表明該基因的轉(zhuǎn)入提高了高粱對氧化脅迫的耐受力，在響應(yīng)鹽堿脅迫中發(fā)揮著重要的作用，但該基因具體作用的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。