丙硫菌唑和肟菌酯混劑產(chǎn)品高效液相色譜分析方法

高 翀，王 怡，龐懷林

(1.上海泰禾化工有限公司，上海 201615；2.南通泰禾化工股份有限公司，南通 226407)

丙硫菌唑(prothionazole)，化學(xué)名稱為2-[2-(1-氯環(huán)丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羥基丙基]-2,4-二氫-3H-1,2,4-三唑-3-硫酮，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，是拜耳公司研制的一種新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑，主要用于谷物、大豆、油菜、水稻、花生、甜菜和蔬菜等，殺菌譜廣。該劑不僅能高效防治小麥赤霉病，而且能有效抑制赤霉病菌產(chǎn)生毒素；同時(shí)，還表現(xiàn)出良好的保綠防衰作用，增產(chǎn)效果明顯[1]。

肟菌酯(trifloxystrobin)，化學(xué)名稱為(2Z)-2-甲氧基亞氨基-2-[2-[[1-[3-(三氟甲基)苯基]亞乙基氨基]氧甲基]苯基]乙酸甲酯，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，是先正達(dá)公司研制，德國(guó)拜耳公司開(kāi)發(fā)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，是以天然產(chǎn)物strobilurins作為先導(dǎo)化合物成功開(kāi)發(fā)的一類新的含氟殺菌劑。它能被植物蠟質(zhì)層很好地吸附，對(duì)植物表面提供優(yōu)異的保護(hù)性，對(duì)幾乎所有真菌綱(子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、卵菌綱和半知菌類)病害均有良好的活性。此產(chǎn)品具有高效、廣譜、保護(hù)、治療、鏟除、滲透、內(nèi)吸活性，耐雨水沖刷、持效期長(zhǎng)等特性，主要用于葡萄、蘋(píng)果、小麥、花生、香蕉、蔬菜等進(jìn)行莖葉處理[2-3]。

圖1 丙硫菌唑(左)和肟菌酯(右)的結(jié)構(gòu)式

325 g/L丙硫菌唑·肟菌唑懸浮劑為低毒內(nèi)吸性殺菌劑，由新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑丙硫菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑肟菌酯復(fù)配而成，既具有保護(hù)作用又具有治療作用。該產(chǎn)品殺菌活性較高、內(nèi)吸性較強(qiáng)、持效期較長(zhǎng)、用于多種作物防治主要真菌病害，對(duì)黃瓜、番茄、大白菜和水稻的主要病害防效明顯，尤其對(duì)小麥赤霉病效果顯著。丙硫菌唑和肟菌酯的混配劑，既可以延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生，擴(kuò)大抗菌譜、提高藥效，又可以減少用藥量，降低成本[4]。

目前有關(guān)丙硫菌唑和肟菌酯單劑的分析方法有較多的文獻(xiàn)記載，例如NY/T 3575—2020肟菌酯懸浮劑，T/CCPIA 027—2020丙硫菌唑懸浮劑2項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于二者復(fù)配制劑的分析方法尚少報(bào)道。本文旨在建立一種可同時(shí)對(duì)丙硫菌唑·肟菌唑懸浮劑中2種有效成分進(jìn)行有效分離和定量的高效液相色譜法。該分析方法分離效果好，操作簡(jiǎn)單快速，適用于懸浮劑等混劑中丙硫菌唑和肟菌唑的定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀，具可調(diào)波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)器：島津 SPD-M20A二級(jí)管陣列檢測(cè)器(日本島津公司)，及島津配套色譜工作站Labsolution；MS205DU型電子天平(瑞士梅特勒托利多集團(tuán))；2200T型超聲波清洗儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；Direct 8純水超純水一體機(jī)(德國(guó)默克集團(tuán))；濾膜：0.45 μm (有機(jī)相，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

甲醇：色譜純(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；磷酸：分析純(國(guó)藥集團(tuán))；丙硫菌唑標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6% (上海泰禾化工有限公司提供，先正達(dá)定值)；肟菌酯標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù) 99.2% (上海泰禾化工有限公司提供，沈陽(yáng)化工研究院有限公司定值)；試樣：325 g/L丙硫菌唑·肟菌唑懸浮劑(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.不銹鋼柱，內(nèi)裝5 μm填充物)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(體積比70∶30)，經(jīng)濾膜過(guò)濾，并進(jìn)行脫氣；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：(35 ±2) ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。在上述色譜操作條件下，丙硫菌唑的保留時(shí)間：約17.8 min；肟菌酯的保留時(shí)間：約26.1 min。丙硫菌唑和肟菌酯標(biāo)樣及試樣的高效液相色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 丙硫菌唑·肟菌酯標(biāo)樣的高效液相色譜圖

圖3 混劑的高效液相色譜圖

1.3 溶液的配置

1.3.1 標(biāo)樣溶液的配制

分別稱取0.05 g (精確至0.000 01 g)丙硫菌唑和肟菌酯標(biāo)樣于100 mL容量瓶中，加入約30 mL甲醇，超聲波振蕩10 min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

1.3.2 試樣溶液的制備

稱取約0.32 g (精確至0.000 01 g)丙硫菌唑和肟菌酯混劑于100 mL容量瓶中，加入約10 mL純水，震蕩分散，再加入約30 mL甲醇至溶液澄清，超聲波振蕩10 min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

1.4 測(cè)定

在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，待相鄰2針的峰面積相對(duì)變化小于1.0%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.5 計(jì)算

將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中丙硫菌唑/肟菌酯峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中丙硫菌唑/肟菌酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(1)計(jì)算：

式中：X為試樣中丙硫菌唑/肟菌酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以%表示；為試樣溶液中丙硫菌唑/肟菌酯峰面積的平均值；m1為丙硫菌唑/肟菌酯標(biāo)樣的質(zhì)量的數(shù)值，單位為克(g)；P為標(biāo)樣中丙硫菌唑/肟菌酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以%表示；為標(biāo)樣溶液中丙硫菌唑/肟菌酯峰面積的平均值；m2為試樣的質(zhì)量的數(shù)值，單位為克(g)。

2 結(jié)果和分析

2.1 方法與討論

經(jīng)試驗(yàn)，在島津SPD-M20A二級(jí)管陣列檢測(cè)器液相色譜的全波長(zhǎng)數(shù)據(jù)采集功能中，可以清晰的獲得丙硫菌唑和肟菌酯在 190～600 nm的紫外吸收光譜信息。經(jīng)驗(yàn)證，兩者在254nm附近均有較大的紫外吸收，且能獲得良好地峰型，同時(shí)最大限度地避免了雜質(zhì)的干擾。因此本試驗(yàn)選定254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

為了保障快速準(zhǔn)確地分離、檢測(cè)2個(gè)有效成分，選擇使用了不同生產(chǎn)商、多種填料和長(zhǎng)度的色譜柱進(jìn)行了充分比較，并嘗試了乙腈-碳酸銨緩沖體系、乙腈-甲醇-水體系、甲醇-水體系、乙腈-乙酸水體系等，最終確認(rèn)在甲醇-0.1%磷酸水體系中丙硫菌唑、肟菌酯有效成分、懸浮劑獨(dú)有添加助劑和雜質(zhì)組分均可以有效分離，不存在其他干擾因素，且在體積比70∶30并柱溫恒定35 ℃時(shí)獲得最佳分析效果[5-11]。

在試驗(yàn)中，丙硫菌唑和肟菌酯的保留時(shí)間仍需20 min以上，在快速分析方面還有著很大地探索空間，有條件的可嘗試采用3.5 μm填料的色譜柱、提高流動(dòng)相流速至1.5 mL/min或分離效果更好地特定官能團(tuán)分析柱等方案進(jìn)一步提升分析效率。

2.2 分析方法特異性

本試驗(yàn)采用 HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別丙硫菌唑和肟菌酯。

丙硫菌唑標(biāo)樣、肟菌酯標(biāo)樣和混劑樣品中的丙硫菌唑、肟菌酯主要成分的最小峰純度相似度均為1.000 0，最小峰純度閾值均為0.999 9，最小峰純度指數(shù)均為 0，說(shuō)明以上所述色譜峰中均不含有干擾成分。且標(biāo)樣與試樣的色譜峰保留時(shí)間差在1.0%以內(nèi)，如圖2和圖3所示。標(biāo)樣和試樣的峰純度圖如圖4-圖7所示。

圖4 丙硫菌唑標(biāo)樣中目標(biāo)峰純度

圖5 混劑試樣中丙硫菌唑目標(biāo)峰純度

圖6 肟菌酯標(biāo)樣中目標(biāo)峰純度

圖7 混劑試樣中肟菌酯目標(biāo)峰純度

2.3 分析方法的線性相關(guān)性的測(cè)定

分別稱取6個(gè)不同質(zhì)量的丙硫菌唑、肟菌酯標(biāo)樣，配制6個(gè)不同濃度的線性溶液。按照1.2、1.3節(jié)的色譜分析條件，試驗(yàn)可見(jiàn)：當(dāng)丙硫菌唑質(zhì)量濃度在298～809 μg/mL時(shí)，丙硫菌唑的質(zhì)量濃度與其峰面積響應(yīng)值之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=9 711.4x+12 341，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7；當(dāng)肟菌酯質(zhì)量濃度在300～806 μg/mL時(shí)，肟菌酯的質(zhì)量濃度與其峰面積響應(yīng)值之間亦呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=11 102x+6 627.9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，均完全可以滿足定量分析要求。以丙硫菌唑、肟菌酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 丙硫菌唑/肟菌酯峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

2.4 分析方法的精密度試驗(yàn)

對(duì)同一混劑準(zhǔn)確連續(xù)稱取6個(gè)試樣，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，分別測(cè)得丙硫菌唑、肟菌酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表 1。由表 1可見(jiàn)，得到丙硫菌唑和肟菌酯的標(biāo)準(zhǔn)偏差都為 0.02，二者的變異系數(shù)都為0.2%，說(shuō)明該方法精密度良好，能滿足日常的定量分析。

表1 丙硫菌唑和肟菌酯混劑的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6個(gè)丙硫菌唑和肟菌酯混劑試樣，加入一定量的丙硫菌唑和肟菌酯標(biāo)樣，按 1.2節(jié)的高效液相色譜操作條件分別進(jìn)行分析，測(cè)得丙硫菌唑的回收率為99.2%～100.3%，平均回收率為99.6%；肟菌酯的回收率為 100.5%～101.3%，平均回收率為100.9%(表2)。這說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好，能滿足日常的定量分析。

表2 丙硫菌唑和肟菌酯混劑的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 非分析物干擾試驗(yàn)

制劑空白為不含有效成分的樣品空白，按 1.2節(jié)的高效液相色譜操作條件進(jìn)行分析，采用4倍量20 μL進(jìn)樣，其高效液相色譜圖如圖9所示，與圖2、圖3對(duì)比可見(jiàn)，制劑空白中不含有效成分的干擾物質(zhì)[12]。

圖9 丙硫菌唑和肟菌酯混劑的空白高效液相色譜圖

3 結(jié) 論

本文建立了采用高效液相色譜法快速測(cè)定丙硫菌唑和肟菌酯混劑中有效成分丙硫菌唑與肟菌酯的方法。采用XDB-C18不銹鋼色譜柱(150 mm×4.6 mm i.d.×5 μm)和紫外檢測(cè)器，以甲醇-0.1%磷酸水溶液(體積比70∶30)為流動(dòng)相，測(cè)得有效成分的精密度和準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好。該方法具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)過(guò)程穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確，分離效果好等特點(diǎn)，可用于丙硫菌唑和肟菌酯混劑生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品的檢測(cè)。