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    茂名地區(qū)嬰幼兒G6PD缺乏癥基因突變分析

    2021-09-02 15:29:16陳紅玲譚滿勝謝清豐聶俊瑋劉沃滿
    醫(yī)學(xué)食療與健康 2021年28期
    關(guān)鍵詞:缺乏癥基因突變嬰幼兒

    陳紅玲 譚滿勝 謝清豐 聶俊瑋 劉沃滿

    【關(guān)鍵詞】葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶缺乏癥;基因突變;熒光PCR 熔解曲線法;流行病學(xué)調(diào)查

    葡萄糖- 6 - 磷酸脫氫酶( G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t edehydrogenase, G6PD) 缺乏癥俗稱蠶豆病,指的是紅細(xì)胞葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶活性降低和( 或) 酶性質(zhì)改變導(dǎo)致以溶血為主要表現(xiàn)的一種X 連鎖隱性或不完全顯性遺傳性疾病[1]。我國(guó)是G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū),由南至北發(fā)病率逐漸降低,以廣東、廣西、海南、貴州和臺(tái)灣等地區(qū)發(fā)病率較高[2]。G6PD 缺乏癥的臨床表現(xiàn)差異很大,多數(shù)為無(wú)癥狀者,部分患者表現(xiàn)為慢性溶血性貧血癥狀[3]。較嚴(yán)重者的表現(xiàn)為新生兒期重癥核黃疸,可造成死亡或神經(jīng)系統(tǒng)永久性損傷[4]。G6PD 缺乏癥一旦發(fā)病可導(dǎo)致嚴(yán)重后果且尚無(wú)有效的根治方法,因此,及早地篩查與基因診斷以便采取有效的預(yù)防措施和控制誘因,是減少G6PD缺乏癥發(fā)生最有效的措施[5]。茂名地處廣東省西部,是G6PD缺乏癥的高發(fā)地區(qū),據(jù)陳海玲等對(duì)茂名地區(qū)344763份新生兒血樣本進(jìn)行遺傳代謝病篩查結(jié)果分析指出G6PD缺乏癥發(fā)生率高達(dá)7.41%[6]。以往本地區(qū)對(duì)于G6PD 缺乏癥的相關(guān)研究主要以酶的活性檢測(cè)為主,涉及基因檢測(cè)的報(bào)道少見(jiàn)。本研究采用熒光PCR熔解曲線法對(duì)嬰幼兒外周血進(jìn)行基因檢測(cè),探討茂名地區(qū)G6PD基因突變的類型和分布特點(diǎn),為本地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查、臨床上診斷和預(yù)防G6PD缺乏癥提供參考依據(jù)。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 對(duì)象 從2018 年1 月至2019 年12 月因G6PD 活性檢測(cè)陽(yáng)性而召回茂名市婦幼保健院復(fù)診的嬰幼兒中抽取326 例進(jìn)行G6PD 缺乏癥基因突變檢測(cè),其中男性264 例、女性62例,年齡11 d ~3 歲?;虻臋z測(cè)均對(duì)嬰幼兒的法定監(jiān)護(hù)人進(jìn)行知情告知并簽署同意書(shū)。

    1.2儀器和試劑 ①儀器:實(shí)驗(yàn)中用到的儀器設(shè)備有:廈門(mén)致善Lab-Aid 820核酸提取儀、賽默飛世爾BIOMATE 3S紫外分光光度計(jì)和美國(guó)伯樂(lè)CFX-96熒光定量PCR儀。②試劑:Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測(cè)試劑均來(lái)源于廈門(mén)致善生物科技股份有限公司。

    1.3 方法 ①樣本采集:抽取上述患兒靜脈血1 mL 于EDTA 抗凝管中送檢,暫未檢測(cè)標(biāo)本置于4℃~8℃保存不超過(guò)一周。②試劑的準(zhǔn)備:在試劑準(zhǔn)備區(qū)將PCR 反應(yīng)液A 和B按要求配制并分裝于PCR 薄壁反應(yīng)管。將配制好的PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至標(biāo)本制備區(qū),貯存于-18℃以下直至樣本DNA提取完。③ DNA 的提取及加樣 用Lab-Aid 820 核酸提取儀提取樣本的DNA,用BIOMATE 3S 紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA 樣本的濃度和純度,DNA 樣本的OD260nm/OD280nm 均在1.6-2.0 范圍之間,且OD260nm/OD230nm ≥ 2.0。按試劑盒說(shuō)明書(shū)加樣,蓋上管蓋,瞬時(shí)離心后轉(zhuǎn)移至PCR 擴(kuò)增區(qū)。④ PCR擴(kuò)增、溶解曲線的分析和結(jié)果的判讀 在具有FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道多色熔解曲線分析功能的BIO-RAD CFX96PCR 擴(kuò)增儀上設(shè)置PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 2 min → 95℃ 10min → (95℃ 15 s → 65℃-56℃( 每個(gè)循環(huán)下降1℃)15 s → 76℃20 s)×10 個(gè)循環(huán)→ (95℃ 15 s→ 55℃ 15 s→ 76℃ 20 s)×50 個(gè)循環(huán)→ 95℃1 min → 35℃ 3 min → 40℃-85℃以0.4℃/5 s 的升溫速率進(jìn)行熔解曲線分析,且在此階段采集FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道熒光信號(hào)。結(jié)果的判讀通過(guò)比較待測(cè)樣本在A 和B 體系中共八個(gè)檢測(cè)通道的熔解峰與野生型對(duì)照對(duì)應(yīng)通道的熔解峰之間熔點(diǎn)(Tm 值) 的差異判斷樣本是否發(fā)生突變,當(dāng)樣本熔解峰與野生型對(duì)照對(duì)應(yīng)熔解峰差異(ΔTm 值)在±1℃以內(nèi)的即為野生型峰,差異超過(guò)±2℃的即為突變型峰[7]。本次檢測(cè)中國(guó)人群常見(jiàn)的12 種G6PD 基因突變的類型及各突變型在對(duì)應(yīng)通道的ΔTm值波動(dòng)范圍見(jiàn)表1。

    2 結(jié)果

    對(duì)茂名地區(qū)G6PD 活性篩查陽(yáng)性召回的326 例嬰幼兒( 男性264 例,女性62 例),采用熒光PCR 熔解曲線法進(jìn)行基因突變檢測(cè),共檢出基因突變301 例( 男性249 例,女性52 例),基因突變率92.33%。在301 例突變樣本中檢出10 種單一突變和5 種復(fù)合突變,占比由高到低以c.1388 G>A、c.1376 G>T、c.95 A>G、c.871 G>A 和c.392 G>T 這5 種突變?yōu)橹?,共?1.03%,未檢出c.383 T>C、c.592 C>T 兩種突變類型,突變類型和分布情況見(jiàn)表2。

    3 討論

    葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶(G6PD) 缺乏癥是最常見(jiàn)的一種遺傳性酶缺乏病,由位于X 染色上的G6PD 基因突變導(dǎo)致G6PD酶活性降低或缺乏,紅細(xì)胞不能抵抗氧化損傷而遭受破壞,從而引起溶血性貧血[8]。G6PD 基因定位于X 染色體長(zhǎng)臂2 區(qū)8 帶(Xq28)[9]。男性攜帶者稱為半合子;女性兩條X 染色體都帶有致病基因時(shí)稱為純合子,僅一條X 染色體帶有致病基因時(shí)稱為雜合子。女性雜合子因酶的活性缺乏程度不同而臨床表現(xiàn)差異較大,女性純合子和男性半合子則表現(xiàn)為酶的活性顯著缺乏,臨床癥狀較重。

    本研究采用的熒光PCR 溶解曲線法根據(jù)靶與探針雜交產(chǎn)物熔點(diǎn)的差異能夠一次性檢測(cè)12 種中國(guó)人群常見(jiàn)G6PD 基因突變類型,結(jié)果顯示茂名地區(qū)嬰幼兒的G6PD 基因突變類型以c.1388G>A、c.1376G>T 和c.95A>G 為主,占比分別為36.21%、30.90%、10.96%,這與國(guó)內(nèi)報(bào)道的中國(guó)人群的主要突變類型是相符的,但所占比例存在一定差異;另外,檢出的其他突變類型也與其他地區(qū)存在差異性。這表明茂名地區(qū)G6PD 基因突變類型既具有中國(guó)人群普遍的特征,也具有本地區(qū)的特征性。

    本研究326 例G6PD 缺乏癥患者中,有301 例樣本檢測(cè)出基因突變,包含10 種單一突變類型和5 種復(fù)合突變類型,在檢測(cè)范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)c.383T>C 和c.592C>T 兩種突變,這可能與檢測(cè)的標(biāo)本量存在一定的關(guān)系。另外有25 例樣本未檢測(cè)到基因突變,一方面原因可能是部分篩查的樣本是由外院采集后送至本院檢測(cè),標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間長(zhǎng)、保存不當(dāng)或處理等因素均可能造成G6PD 酶活性降低;另一方面原因可能是G6PD酶活性受某些疾病或者藥物的影響而降低;最后也可能是存在試劑盒檢測(cè)范圍以外的基因突變類型,這有待后續(xù)通過(guò)其他檢測(cè)試劑盒或使用基因測(cè)序等方法進(jìn)一步研究。因?yàn)槭軜?biāo)本質(zhì)量、疾病和藥物等因素影響,再加上部分女性雜合子G6PD 缺乏癥狀不明顯,所以臨床上單純依靠新生兒紙片法初篩和酶法檢測(cè)的結(jié)果來(lái)診斷G6PD 缺乏癥也還存在一定的缺陷。因此,進(jìn)行G6PD 基因突變檢測(cè)還是很有必要的,能夠在基因?qū)用鏋榕R床提供更為準(zhǔn)確的診斷依據(jù)。本研究采用的熒光PCR 溶解曲線法具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)覆蓋范圍廣等特點(diǎn),該技術(shù)在本地區(qū)的應(yīng)用,可為本地區(qū)進(jìn)行大規(guī)模的G6PD 缺乏癥的分子流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)保障。

    綜上所述,本研究對(duì)茂名地區(qū)嬰幼兒G6PD 基因突變的類型進(jìn)行分析,為本地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查、臨床上診斷和預(yù)防G6PD 缺乏癥提供了有價(jià)值的參考依據(jù)。在嬰幼兒群體中應(yīng)積極開(kāi)展G6PD 缺乏癥的基因突變檢測(cè),根據(jù)檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥和患兒家屬喂養(yǎng),從而預(yù)防溶血性疾病的發(fā)生,有利于提高本地區(qū)的人口素質(zhì)與健康。

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