下調(diào)miR-4295靶向CDKN1A調(diào)控膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和侵襲

王小言 夏鷹 金虎 陳偉明 陳曉東 聶柳 鄭忠濤

(?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570208)

膠質(zhì)瘤是常見的惡性腫瘤，有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、惡性程度高等特點，單純的手術(shù)治療難以徹底根治膠質(zhì)瘤，術(shù)后輔助放療、化療等是目前常見的膠質(zhì)瘤治療手段，基因治療是近年來受到廣泛關(guān)注的治療途徑，也是目前研究的熱點〔1〕。miRNA不僅參與機(jī)體正常生長發(fā)育，調(diào)控細(xì)胞的生長、分化等過程，還與人類的多種疾病發(fā)生有關(guān)，例如心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤〔2,3〕。miR-4295是最近研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的miRNA，在肺癌、膀胱癌等腫瘤中扮演促進(jìn)作用，miR-4295能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲〔3～5〕。miR-4295在膠質(zhì)瘤組織中過表達(dá)，并且其表達(dá)水平與患者的臨床分期有關(guān)〔6〕?，F(xiàn)階段對miR-4295在膠質(zhì)瘤中的作用尚不明確。本實驗探討下調(diào)miR-4295對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響和靶向調(diào)控機(jī)制，為基因靶向治療膠質(zhì)瘤及明確miR-4295在腫瘤中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購自美國ATCC；miR-4295 inhibitor、inhibitor control、miR-4295 mimics、mimics control均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；CDKN1A抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司；CDKN1A siRNA、siRNA control由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司構(gòu)建；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；熒光素酶報告載體由漢恒生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞分為control組(未轉(zhuǎn)染)、anti-NC組(轉(zhuǎn)染inhibitor control)、anti-miR-4295組(轉(zhuǎn)染miR-4295 inhibitor)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟同Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑。

1.2.2qRT-PCR檢測下調(diào)效果 取培養(yǎng)48 h后的control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細(xì)胞，添加Trizol試劑，分別提取細(xì)胞中的RNA，使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行qRT-PCR，PCR條件分成兩步，第1步為：95℃孵育30 s，第2步為：95℃孵育5 s，60℃孵育30 s，一共循環(huán)40次。利用Stepone Plus Realtime PCR System分析每個反應(yīng)的Ct值，依照2-△△Ct方法計算miR-4295表達(dá)變化。引物序列為：miR-4295正義鏈5′-UCCCUCCCCAGUUCAUUGCACUU-3′，反義鏈5′-AAGUGCAAUGAACUGGGGAGGGA-3′。內(nèi)參U6正義鏈5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′，反義鏈5′-AACGCTTCACGAATTGCGT-3′。

1.2.3四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定下調(diào)miR-4295后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力 將control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細(xì)胞接種到96孔板，每個孔內(nèi)加100 μl的細(xì)胞懸浮液(含有4×103個細(xì)胞)，培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)板取出，添加10 μl的MTT工作液，放在37℃繼續(xù)反應(yīng)4 h。把孔內(nèi)的上清溶液棄掉，依次添加二甲基亞砜(DMSO)溶液(每孔150 μl)，孵育反應(yīng)10 min。測定酶標(biāo)儀波長為490 nm的OD值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)測定下調(diào)miR-4295后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡水平 取control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細(xì)胞，常規(guī)方法培養(yǎng)48 h，以胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸浮液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，最后將各組細(xì)胞懸浮在400 μl的結(jié)合緩沖液中，在細(xì)胞中添加PI及AnnexinV-FITC染色液(各5 μl)，充分混合后，立即用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡水平。

1.2.5Transwell小室測定下調(diào)miR-4295后膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力 取轉(zhuǎn)染后的control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細(xì)胞，按照每孔中添加8×104個細(xì)胞種植到8 μm的Transwell小室中，細(xì)胞培養(yǎng)液為不含血清的DMEM，同時在下室內(nèi)補(bǔ)充600 μl的含有10%胎牛血清的DMEM。培養(yǎng)48 h后，用甲醇將遷移的細(xì)胞固定，使用棉簽把沒有遷移的細(xì)胞擦掉。用0.1%的結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野分析計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞侵襲實驗步驟同遷移實驗，在實驗前用基質(zhì)膠將小室濕化。

1.2.6靶基因預(yù)測和鑒定 利用在線靶基因預(yù)測軟件分析miR-4295同CDKN1A的3′UTR端有結(jié)合位點，合成含有野生型(WT)和突變型(MUT)CDKN1A的3′UTR端寡聚核苷酸的熒光素酶報告載體(pmiRGLO)。使用Lipofectamine2000將miR-4295 mimics、mimics control分別同WT、MUT共轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，在培養(yǎng)48 h后，使用熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶的活性。

1.2.7Western印跡檢測下調(diào)miR-4295后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDKN1A蛋白表達(dá) 取control組、anti-NC組、anti-miR-4295組細(xì)胞，常規(guī)方法培養(yǎng)48 h，在細(xì)胞中加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA蛋白提取試劑，置于低溫(4℃)中收集細(xì)胞，使用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行定量。采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。把收集的蛋白樣品添加到1/4體積的5×上樣緩沖液內(nèi)均勻混合，然后放在沸水浴中反應(yīng)5 min。在每個孔中添加30 μg蛋白樣品，濃縮膠中以90 V電壓電泳，分離膠中以120 V電壓電泳，等到溴酚藍(lán)已經(jīng)到達(dá)凝膠底部之后關(guān)閉電源。把NC膜剪成合適大小，置于80 V、冰浴條件下電轉(zhuǎn)膜45 min，用5%脫脂奶粉封閉后，同1∶1 200稀釋的CDKN1A一抗結(jié)合反應(yīng)2 h，再與1∶3 000稀釋后的二抗結(jié)合2 h，最后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)。根據(jù)條帶的灰度值分析CDKN1A蛋白水平，內(nèi)參為GAPDH。

1.2.8CDKN1A siRNA對下調(diào)miR-4295的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移影響 利用Lipofectamine 2000將miR-4295 inhibitor、CDKN1A siRNA共轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，記為anti-miR-4295+si-CDKN1A組，同時將miR-4295 inhibitor、siRNA control共轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，記為anti-miR-4295+si-NC組，轉(zhuǎn)染后48 h，用Western印跡測定細(xì)胞中CDKN1A蛋白表達(dá)，MTT測定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Transwell小室測定細(xì)胞侵襲和遷移，步驟同上。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-4295水平檢測 膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組miR-4295水平(0.45±0.03)顯著低于control組(1.00±0.09)、anti-NC組(1.01±0.12，P<0.05)。表明miR-4295抑制劑抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-4295表達(dá)。

2.2細(xì)胞增殖能力及凋亡率檢測 膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組細(xì)胞OD值均顯著低于control組及anti-NC組 ，而凋亡率顯著高于control組、anti-NC組(均P<0.05)。表明下調(diào)miR-4295抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。見圖1，表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測定miR-4295抑制劑轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡變化

表1 miR-4295抑制劑轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡變化

2.3細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測 膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組遷移和侵襲數(shù)目均顯著低于control組及anti-NC組(均P<0.05),見表2。表明下調(diào)miR-4295抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲。

表2 miR-4295抑制劑轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力變化個)

2.4生物信息學(xué)軟件預(yù)測 miR-4295與CDKN1A的3′UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點，熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN1A為miR-4295的靶基因，見圖2。miR-4295 mimics組WT顯著低于mimics control組(P<0.05)，見表3。表明miR-4295靶向調(diào)控CDKN1A。

圖2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-4295與CDKN1A的3′UTR端結(jié)合位點

表3 熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系

2.5CDKN1A蛋白檢測 膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-4295抑制劑后，anti-miR-4295組CDKN1A蛋白水平(0.85±0.09)顯著高于control組(0.51±0.06)及anti-NC組(0.49±0.06，均P<0.05),見圖3。表明下調(diào)miR-4295促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDKN1A蛋白表達(dá)。

圖3 Western印跡檢測miR-4295抑制劑轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDKN1A蛋白表達(dá)

2.6CDKN1A siRNA和miR-4295抑制劑轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力及CDKN1A蛋白檢測 anti-miR-4295+si-CDKN1A組CDKN1A蛋白水平、凋亡率顯著低于anti-miR-4295+si-NC組，而細(xì)胞OD值、侵襲和遷移數(shù)目均顯著高于antimiR-4295+si-NC組(均P<0.05)，見圖4、圖5、表4。表明CDKN1A siRNA逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-4295對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響。

1～2：anti-miR-4295+si-NC組,anti-miR-4295+si-CDKN1A組圖4 Western印跡檢測CDKN1A siRNA和miR-4295抑制劑轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDKN1A蛋白表達(dá)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測CDKN1A siRNA和miR-4295抑制劑轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡變化

3 討 論

miRNA是一類在人體組織中廣泛存在的非編碼RNA，有很多生物學(xué)作用，在組織修復(fù)、細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育等生理過程中扮演關(guān)鍵角色〔7〕。miRNA還與人類疾病的發(fā)生有關(guān)，其可通過調(diào)控心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長、凋亡影響心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生，miRNA還與關(guān)節(jié)炎、糖尿病等疾病關(guān)〔8，9〕。miRNA異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、凋亡有關(guān)，miRNA也是目前基因靶向治療關(guān)注的熱點〔10〕。本實驗提示下調(diào)miR-4295有抵抗膠質(zhì)瘤惡性生長的作用，靶向miR-4295可能是抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展的途徑。miR-4295可促進(jìn)鼻咽癌、胰腺導(dǎo)管癌等細(xì)胞的惡性增殖，miR-4295在腫瘤組織中高表達(dá)〔5,11,12〕。本實驗提示miR-4295在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中也扮演類似癌基因的作用。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤的基礎(chǔ)，而腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤是腫瘤患者死亡的重要原因〔13,14〕。miR-4295參與調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過程，在甲狀腺未分化癌和膀胱癌等腫瘤中已經(jīng)證實miR-4295有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的作用〔5,11,12〕。本實驗提示下調(diào)miR-4295能抵抗膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移和浸潤，miR-4295在膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中也可能扮演抑制作用。

miRNA參與多種病理及生理進(jìn)程與靶向調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)，并且同一個miRNA在不同的組織或病理過程中可能同時有多個不同的靶基因〔15～17〕。目前對于miR-4295的研究顯示，miR-4295作用機(jī)制與PTEN、BTG1等靶基因的表達(dá)有關(guān)〔4,5〕。本實驗發(fā)現(xiàn)miR-4295能靶向負(fù)調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDKN1A的表達(dá)。CDKN1A是一個與細(xì)胞生長有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，其能降低細(xì)胞生長速度。CDKN1A與腫瘤發(fā)生有關(guān)，其在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，CDKN1A過表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長〔18～20〕。本實驗結(jié)果提示下調(diào)CDKN1A可靶向負(fù)調(diào)控CDKN1A表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和誘導(dǎo)凋亡。

綜上，miR-4295在膠質(zhì)瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，靶向下調(diào)miR-4295表達(dá)可能是膠質(zhì)瘤治療的有效途徑，下調(diào)miR-4295能夠在體外降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，作用機(jī)制與靶向負(fù)調(diào)控CDKN1A的表達(dá)有關(guān)。miR-4295在膠質(zhì)瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的具體機(jī)制還需要在以后的實驗中深入探討。