白花丹素通過調(diào)控miR-218-5p/CNTN1表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及其機制

李愛玲 李虹 陳莉萍 (華中科技大學(xué)附屬武漢市第四醫(yī)院，湖北 武漢 430034)

子宮內(nèi)膜癌屬于女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變等多種因素均可導(dǎo)致子宮頸內(nèi)膜癌發(fā)生，由于女性內(nèi)分泌系統(tǒng)的復(fù)雜性導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制尚未完全闡明〔1〕。目前臨床常采用手術(shù)與激素治療等方法治療子宮內(nèi)膜癌，由于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移及侵襲能力較強導(dǎo)致患者治療效果差〔2〕。因此探尋子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展機制，并基于機制研究尋找可有效治療子宮內(nèi)膜癌的新型藥物對提高治療效果及改善患者預(yù)后均有重要意義。研究表明白花丹素可抑制宮頸癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲〔3，4〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)白花丹素能通過抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制膀胱癌發(fā)生及發(fā)展，同時可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力〔5〕。 但白花丹素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為的影響尚未不清楚。微小RNA(miR)-218-5p在膀胱癌等惡性腫瘤中呈低表達(dá)，并可通過調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑癌基因作用〔6〕。通過靶基因網(wǎng)站預(yù)測接觸蛋白(CNTN)1可能是miR-218-5p的靶基因，研究表明CNTN1在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高并能夠增強乳腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成及侵襲能力〔7〕。 但白花丹素及miR-218-5p、CNTN1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響，且白花丹素是否通過調(diào)控miR-218-5p/CNTN1表達(dá)影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲目前還尚未可知。因此，本研究觀察白花丹素對人子宮內(nèi)膜腺瘤細(xì)胞(HEC)-1A細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并初步分析其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞與主要試劑 HEC-1A購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑、熒光素酶檢測試劑均購自美國Promega公司；miR-218-5p mimic、 CNTN1 siRNA、miR-218-5p抑制物(anti-miR-218-5p)及其各自陰性對照序列均購自美國Ambion公司；實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購自美國ABI公司；兔抗人CyclinD1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、 p21抗體均購自美國Cell Signaling Technolgy公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國ThermoFisher公司；Transwell小室與Matrigel基質(zhì)膠均購自美國BD公司；凝膠試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光試劑盒與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1百花丹素處理、轉(zhuǎn)染及分組 HEC-1A細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、相對濕度為95%，收集對數(shù)生長期HEC-1A細(xì)胞接種于6孔板，采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將miR-NC、miR-218-5p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-218-5p、si-NC、si-CNTN1轉(zhuǎn)染入HEC-1A細(xì)胞，設(shè)置為miR-NC組、miR-218-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-218-5p組、si-NC組、si-CNTN1組，嚴(yán)格參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后6 h更換為新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。白花丹素處理及分組：分別用濃度為1.0、2.5、5.0 μmol/L的白花丹素處理HEC-1A細(xì)胞，將HEC-1A細(xì)胞分為對照組(不進(jìn)行任何處理)、白花丹素1.0 μmol/L組、白花丹素2.5 μmol/L組、白花丹素5.0 μmol/L組，同時篩選出白花丹素適宜處理濃度。為明確白花丹素是否通過調(diào)控miR-218-5p表達(dá)而發(fā)揮作用，在轉(zhuǎn)染anti-miR-218-5p、anti-miR-NC 12 h后使用白花丹素處理24 h，分別設(shè)置為白花丹素+anti-miR-218-5p組、白花丹素+anti-miR-NC組，收集HEC-1A細(xì)胞進(jìn)行下一步檢測。

1.2.2細(xì)胞增殖實驗 HEC-1A細(xì)胞接種于96孔板，密度為8×103個細(xì)胞/孔，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置陰性對照，分別加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄上清液，分別加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩溶解30 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔吸光度值(OD)，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/陰性對照OD值)×100%。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-218-5p、CNTN1 mRNA表達(dá)水平 用Trizol試劑盒提取HEC-1A細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，取10 ng RNA依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miR-218-5p以U6為內(nèi)參基因，CNTN1以GAPDH為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系包括SYBR Green real-time PCR Master Mix(10 μl/孔)、正反向引物各(1 μl/孔)、cDNA(2 μl/孔)，ddH2O補足體系至20 μl。通過95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，反復(fù)循環(huán)40次進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計算miR-218-5p、CNTN1 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4Western印跡檢測CNTN1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、 p21蛋白表達(dá)水平 收集各組對數(shù)生長期HEC-1A細(xì)胞，加入200 μl蛋白裂解液(RIPA、1%PMSF)，冰上裂解30 min，置于離心機離心15 min，離心機轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心后收集上清液，用考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度，取適量蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，4℃溫度下分別加入適量各蛋白一抗(1∶500)孵育過夜，次日用TBST洗滌3次，15 min/次，室溫下分別加入稀釋比為1∶2 000的二抗，孵育2 h后用TBST洗滌3次，15 min/次，ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影反應(yīng)，曝光后用Scion Image圖像分析系統(tǒng)分析各條帶光密度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶光密度值/GAPDH條帶光密度值。

1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測 收集未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并計數(shù)，將細(xì)胞以5×104/ml濃度接種于24孔板，待細(xì)胞生長匯合率達(dá)到60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將HEC-1A細(xì)胞分為：miR-218-5p mimic+WT-CNTN1、miR-218-5p mimic+MUT-CNTN1、miR-NC+WT-CNTN1、miR-NC+MUT-CNTN1，每組均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組CNTN1相對熒光素酶活性。

1.2.6Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲 細(xì)胞遷移實驗：用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加入Transwell小室上室備用，同時選取各組對數(shù)生長期HEC-1A細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(1×105/ml)，取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，Transwell小室下室加入500 μl含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，用PBS洗滌，棉簽擦拭微孔膜內(nèi)層細(xì)胞，酒精固定5 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機選取5～10個視野并計算轉(zhuǎn)移至微孔膜下層細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實驗：配制基質(zhì)膠與無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋比為1∶8的稀釋液，以此稀釋比稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取100 μl稀釋液包被Transwell小室底部的上室面，風(fēng)干后除去多余液體，并加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(50 μl/孔)，同時用胰蛋白酶消化各組HEC-1A細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用含不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(1×105/ml)，在Transwell小室上室加入200 μl細(xì)胞懸液，在Transwell小室下室加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，PBS洗滌，棉簽擦拭Transwell小室微孔膜內(nèi)面細(xì)胞，酒精固定5 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機選取5～10個視野觀察并計算移至Transwell小室微孔膜下層細(xì)胞。細(xì)胞遷移及侵襲實驗均設(shè)置3次重復(fù)，細(xì)胞遷移及侵襲能力均與細(xì)胞數(shù)呈正比。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0進(jìn)行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1白花丹素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(48 h) 與對照組比較，白花丹素不同濃度組HEC-1A細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)，白花丹素5.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L>白花丹素1.0 μmol/L組(P<0.05);Transwell實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，白花丹素不同濃度組HEC-1A細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，白花丹素1.0 μmol/L組<白花丹素2.5 μmol/L組<白花丹素5.0 μmol/L組(P<0.05);Western印跡實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，白花丹素不同濃度組HEC-1A細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，且白花丹素1.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L組>白花丹素5.0 μmol/L組,而p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且白花丹素5.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L組>白花丹素1.0 μmol/L組(P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

圖1 子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色，×100)

表明白花丹素可通過降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)及提高p21蛋白表達(dá)水平進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，且呈劑量依賴效應(yīng)。

2.2白花丹素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞中miR-218-5p、CNTN1表達(dá)的影響 白花丹素干預(yù)后子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞中miR-218-5p的表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，且白花丹素5.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L組>白花丹素1.0 μmol/L組(P<0.05)。白花丹素干預(yù)后子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞中CNTN1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯低于對照組(P<0.05)，白花丹素5.0 μmol/L組<2.5 μmol/L組<白花丹素1.0 μmol/L組，見圖3、表2。結(jié)果表明白花丹素可能通過上調(diào)miR-218-5p表達(dá)并下調(diào)CNTN1表達(dá)進(jìn)而參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展過程。由于白花丹素濃度為5.0 μmol/L時對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞的作用效果相對較強，因此后續(xù)研究選取白花丹素濃度5.0 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

圖2 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 CNTN1蛋白表達(dá)

表2 白花丹素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞中miR-218a-5p、CNTN1表達(dá)的影響

2.3miR-218-5p靶向調(diào)控CNTN1的表達(dá) miRNA靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-218-5p可作用于CNTN1的3′UTR，見圖4A，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒WT-CNTN1、MUT-CNTN1與miR-218-5p mimic后，與MUT-CNTN1相比，WT-CNTN1與miR-218-5p mimic共轉(zhuǎn)染后CNTN1的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見表3。miR-218-5p組CNTN1蛋白表達(dá)水平(0.21±0.03)明顯低于miR-NC組(0.61±0.07，P<0.05);anti-miR-218-5p組CNTN1蛋白表達(dá)水平(0.93±0.08)明顯高于anti-miR-NC組(0.62±0.06，P<0.05)，見圖4B。表明miR-218-5p可影響CNTN1活性，CNTN1是miR-218-5p的靶基因，miR-218-5p可負(fù)向調(diào)節(jié)CNTN1表達(dá)。

A：CNTN1的3′UTR中含有與miR-218-5p互補的核苷酸序列；B：CNTN1蛋白表達(dá)圖4 miR-218-5p靶向調(diào)控CNTN1的表達(dá)

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4miR-218-5p過表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 miR-218-5p組HEC-1A細(xì)胞miR-218-5p表達(dá)水平明顯高于miR-NC組(P<0.05)，表明miR-218-5p mimic能顯著促進(jìn)HEC-1A細(xì)胞miR-218-5p表達(dá)。MTT檢測顯示，上調(diào)miR-218-5p表達(dá)能夠顯著增加細(xì)胞增殖抑制率(P<0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示miR-218-5p mimic能夠顯著減少HEC-1A細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)(P<0.05)，表現(xiàn)為進(jìn)入Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。Western印跡檢測結(jié)果顯示miR-218-5p組HEC-1A細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見表4、圖5。表明上調(diào)miR-218-5p表達(dá)可通過下調(diào)CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)及上調(diào)p21蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

組別miR-218-5p抑制率(%)遷移細(xì)胞數(shù)(個)侵襲細(xì)胞數(shù)(個)CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白miR-NC組0.99±0.085.17±0.49115.69±10.2392.47±9.230.81±0.080.25±0.030.79±0.070.80±0.08miR-218-5p組3.14±0.2133.27±3.1254.38±6.0246.31±4.250.42±0.040.68±0.060.33±0.040.36±0.04t值23.43521.79412.65211.12710.68115.70113.97612.050P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

圖5 Western印跡檢測增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5抑制CNTN1表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 Western印跡顯示si-CNTN1組HEC-1A細(xì)胞CNTN1蛋白表達(dá)顯著低于si-NC組(P<0.05)，表明CNTN1 siRNA能夠減少HEC-1A細(xì)胞中CNTN1表達(dá)。與si-NC組比較，MTT實驗結(jié)果顯示si-CNTN1組HEC-1A細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，表明沉默CNTN1表達(dá)可抑制HEC-1A細(xì)胞增殖能力；Transwell實驗結(jié)果顯示si-CNTN1組HEC-1A細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，表明沉默CNTN1表達(dá)可抑制HEC-1A細(xì)胞遷移及侵襲能力；Western印跡顯示si-CNTN1組HEC-1A細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖6、表5。表明沉默CNTN1后可通過上調(diào)p21蛋白表達(dá)及下調(diào)CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)進(jìn)而減弱子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。

圖6 Western印跡檢測CNTN1和增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

組別CNTN1蛋白抑制率(%)遷移細(xì)胞數(shù)(個)侵襲細(xì)胞數(shù)(個)CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白si-NC組0.63±0.066.09±0.61113.47±10.3497.53±9.460.82±0.080.22±0.030.78±0.070.76±0.07si-CNTN1組0.19±0.0329.47±2.6856.83±5.5249.38±4.250.45±0.040.67±0.060.31±0.040.34±0.04t值16.06720.83611.83711.37210.13316.43210.09712.761P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0010.000

2.6抑制miR-218-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了白花丹素對HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示白花丹素預(yù)處理后HEC-1A細(xì)胞miR-218-5p表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，當(dāng)轉(zhuǎn)染入anti-miR-218-5p時HEC-1A細(xì)胞miR-218-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；Western印跡結(jié)果顯示白花丹素預(yù)處理后HEC-1A細(xì)胞CNTN1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染入anti-miR-218-5p后CNTN1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。表明白花丹素可上調(diào)miR-218-5p表達(dá)進(jìn)而促使靶基因CNTN1蛋白表達(dá)下調(diào)。MTT檢測顯示HEC-1A細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)，Transwell實驗檢測結(jié)果顯示遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)，Western印跡顯示HEC-1A細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，而 p21蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。表明抑制miR-218-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)白花丹素對HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。見圖7，表6。

1～4：對照組、白花丹素組、白花丹素+anti-miR-NC、白花丹素+anti-miR-218-5p圖7 CNTN1和增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌惡性程度高、遷移及侵襲能力強等特點導(dǎo)致患者死亡率逐年上升，目前臨床采用的治療手段已不能有效延長患者生存時間〔9〕。隨著生物信息學(xué)不斷發(fā)展，靶向治療成為提高子宮內(nèi)膜癌患者生存率的重要手段，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展過程涉及多種癌基因激活或抑癌基因失活等，因而尋找合適分子靶向治療的靶點及有效治療藥物對殺傷子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及控制疾病進(jìn)展等均具有研究價值。研究表明miRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)而抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化功能進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移及侵襲〔10〕。

白花丹素可通過抑制p38MAPK信號通路及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)而抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及遷移能力〔11〕。白花丹素是中藥白花丹根部提取物，可有效抑制非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力，并可發(fā)揮抗腫瘤作用〔12〕。田林強等〔13〕研究表明白花丹素可能通過下調(diào)MMP-2/MMMP-9蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲。Huang等〔14〕研究表明白花丹素可通過誘導(dǎo)ROS引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果說明白花丹素具有顯著抑制BEAS-2B細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用。研究表明通過抑制MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移及侵襲，上調(diào)p21蛋白表達(dá)可抑制CyclinD1蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖〔15，16〕。結(jié)果證實白花丹素可明顯減弱BEAS-2B細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。提示白花丹素可通過上調(diào)p21蛋白表達(dá)及降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)進(jìn)而減弱子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。然而，關(guān)于白花丹素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制作用還需進(jìn)行深入研究。

miR-218-5p在前列腺癌患者血清中呈高表達(dá)并可作為評估疾病進(jìn)展的有效標(biāo)志物〔17〕。Xu等〔18〕研究表明miR-218-5p可通過調(diào)控LYN/NF-κB信號通路勁兒抑制宮頸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。Zhu等〔19〕研究表明miR-218-5p可通過抑制EGFR表達(dá)進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及遷移。然而，miR-218-5p在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)變化尚未可知。通過靶基因網(wǎng)站預(yù)測到CNTN1可能是miR-218-5p的靶基因，研究表明CNTN1可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖及遷移進(jìn)而促進(jìn)癌癥進(jìn)展過程〔20〕。趙冀等〔21〕研究表明肝細(xì)胞癌患者癌組織中CNTN1呈高表達(dá)并可能參與肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲過程，同時可作為臨床評估患者預(yù)后的重要分子標(biāo)志物。陳楠等〔22〕研究表明上調(diào)CNTN1表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果提示miR-218-5p可通過調(diào)控靶基因CNTN1表達(dá)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，其可能作用機制與下調(diào)CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)及上調(diào)p21蛋白表達(dá)有關(guān)。

白花丹素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用是否通過miR-218-5p/CNTN1軸而實現(xiàn)的，本研究結(jié)果提示白花丹素可通過上調(diào)miR-218-5p表達(dá)并下調(diào)CNTN1表達(dá)進(jìn)而減弱HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。

綜上，白花丹素可通過上調(diào)miR-218-5p表達(dá)可通過靶向CNTN1而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，白花丹素可能作為一種新型藥物治療子宮內(nèi)膜癌，可為子宮內(nèi)膜癌抗腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的臨床治療提供理論支撐。但還需進(jìn)一步采用體內(nèi)研究來明確白花丹素的抗腫瘤活性是否與抑癌基因miR-218-5p激活、促癌基因CNTN1失活有關(guān)，關(guān)于其通過何種信號通路傳遞信號均需深入研究。