Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響

閆磊 周宏博 崔紅 梁軍 孫曉冬 朱梅 佟雷

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011；2紅旗醫(yī)院；3干細(xì)胞研究所；4藥劑學(xué)教研室)

膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、對(duì)放療和化療抵抗并容易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)〔1〕。新的治療方式例如中藥聯(lián)合腫瘤抑制基因治療越來越被關(guān)注。Rab23屬于小GTP 酶，是Ras致癌基因家族的一名成員，位于染色體 6p12.1，最早是1994年從小鼠腦部分離得到，Rab23基因在肝癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用〔2〕。人參皂甙Rg3是人參二醇類四環(huán)三萜皂甙，具有顯著的抗腫瘤作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)選取膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對(duì)U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1材料 細(xì)胞 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，購自美國ATCC公司。試劑Rab23質(zhì)粒，購自中國質(zhì)粒載體細(xì)胞基因保藏中心；人參皂甙Rg3(純度99%)，購自天津馬克生物有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；儀器5417R臺(tái)式高速離心機(jī)購自德國Ep-pendorf生命科學(xué)有限公司產(chǎn)品；JYH27020電泳儀購自美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品；ELX800酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1U251細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染〔4〕將U251細(xì)胞培養(yǎng)至含10%胎牛血清、含100 U/L青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔1～2 d 用胰蛋白酶?jìng)鞔?次。將U251細(xì)胞以2.5×104個(gè)/ml的密度接種在鋪有蓋玻片的24孔板中。細(xì)胞80%融合后，按說明書操作轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒終濃度：25 mol/L。6 h后終止轉(zhuǎn)染，用含10%小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2分組與給藥方法〔4〕將膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞分為4組，空白對(duì)照組，Rab23轉(zhuǎn)染組，人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3組。Rab23轉(zhuǎn)染組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Rab23質(zhì)粒過表達(dá)Rab23。人參皂甙Rg3組給予25 mg/L人參皂甙Rg3處理，Rab23+人參皂甙Rg3組給予轉(zhuǎn)染Rab23質(zhì)粒和25 mg/L人參皂甙Rg3處理。

1.2.3Western印跡檢測(cè)Rab23蛋白的表達(dá)〔5〕用RIPA細(xì)胞解液提取總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，各取40 μg取蛋白行Western印跡檢測(cè)。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜印跡，經(jīng)封閉液4℃作用過夜后，用鼠抗人Rab23抗體(稀釋度為1∶1 000)或GAPDH抗體與膜上的抗原結(jié)合。用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)與其反應(yīng)后室溫孵育2 h，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯色，經(jīng)壓片曝光后，顯影定影。采用 Quantity One 軟件分析目的Rab23蛋白/GAPDH的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行掃描采圖與分析。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)Rab23mRNA的表達(dá)〔5〕根據(jù)Genebank的β-actin和Rab23的序列，利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)可擴(kuò)增的產(chǎn)物，引物序列：β-actin上游引物為5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′，下游引物為5′-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3′，擴(kuò)增序列長度為182 bp。Rab23上游引物為5′-AGGCACTGGCAAAAAGGTTA-3′，下游引物為5′-CGGAGTGACTTCCACCAGAT-3′，擴(kuò)增序列長度為198 bp。轉(zhuǎn)染后48 h收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞1×107個(gè)，按Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度備用，合成cDNA按常規(guī)行RT-PCR，反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqTMⅡ(2×)12.5 μl，cDNA 模板2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，dH2O 8.5 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10 min。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。Rab23 mRNA相對(duì)含量測(cè)定：用凝聚膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描并用Quantity One軟件計(jì)算Rab23mRNA/β-actin的比值，從而得出Rab23 mRNA的相對(duì)含量。

1.2.5MTT比色法檢測(cè)U251細(xì)胞增殖抑制水平〔2〕將空白對(duì)照組和Rab23轉(zhuǎn)染組細(xì)胞按1×107個(gè)/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板上，體積100 μl/孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞80%融合后，分別向Rab23轉(zhuǎn)染組，人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3組加入25 mg/L人參皂甙Rg3，細(xì)胞接種48 h后，取96孔板行MTT檢測(cè)。每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光培育，4 h棄孔內(nèi)上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀上490 nm波長下測(cè)其吸光度值(A)。

1.2.6Western印跡檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原Ki-67(Ki-67)和B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白的表達(dá)〔6，7〕細(xì)胞分組同1.2.2。給藥48 h后，按照文獻(xiàn)方法檢測(cè)U251細(xì)胞中Ki-67和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1U251細(xì)胞中Rab23 蛋白的表達(dá) 空白對(duì)照組(0.91±0.24)凝膠成像及分析系統(tǒng)對(duì)樣本的條帶灰度值與相尖β-antin條帶灰度值比值明顯低于Rab23轉(zhuǎn)染組(1.23±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 U251細(xì)胞中Rab23蛋白的表達(dá)

2.2U251細(xì)胞中Rab23 mRNA的表達(dá) 空白對(duì)照組Rab23 mRNA灰度比值(0.83±0.12)明顯低于Rab23轉(zhuǎn)染組(1.69±0.37，P<0.01)。

2.3各組U251細(xì)胞的增殖水平 空白對(duì)照組、Rab23轉(zhuǎn)染組、人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3組在第48小時(shí)吸光度A490值分別為0.87±0.08，0.61±0.06，0.49±0.11，0.35±0.03。與空白對(duì)照組比較，Rab23轉(zhuǎn)染組、人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3的增殖水平明顯依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Rab23+人參皂甙Rg3組作用最為顯著，表明Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖水平有明顯協(xié)同抑制作用。

2.4U251細(xì)胞中Ki-67和Bcl-2蛋白的表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，Rab23轉(zhuǎn)染組、人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3的Ki-67蛋白表達(dá)水平明顯依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Rab23+人參皂甙Rg3組作用最為顯著，Bcl-2蛋白表達(dá)亦有同樣趨勢(shì)，表明Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的Ki-67和Bcl-2表達(dá)水平有明顯協(xié)同抑制作用，見表1。

表1 各組U251細(xì)胞Ki-67和Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討 論

膠質(zhì)瘤治療以手術(shù)為首選，但由于膠質(zhì)瘤具有浸潤生長的特性，與腦組織間無明顯邊界，難以全部切除。探索新的治療方法抑制膠質(zhì)瘤已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。腫瘤抑制基因聯(lián)合中藥治療將具有非常好的前景。

Rab23基因編碼的蛋白是小GTP 酶超家族Rab家族成員，Rab23在成年小鼠的腦、乳腺、胃、精巢、卵巢等組織中也有表達(dá)，提示Rab23在成體組織器官功能的維持過程中起重要作用〔8〕。同時(shí)，Rab23還介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)小泡的運(yùn)輸及溶酶體的內(nèi)吞作用〔9〕。Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一個(gè)經(jīng)典的控制胚胎發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要由3種分泌型糖蛋白配體Shh、Ihh 和Dhh，兩個(gè)跨膜蛋白受體Ptch1、Smo，3個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3及下游的靶基因等組成。在Hedgehog信號(hào)通路中，多種基因已經(jīng)被鑒定為原癌基因或腫瘤抑制基因。Rab23可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Gli2和Gli3的活性或改變Smo與Gli之間關(guān)鍵因子的亞細(xì)胞定位，抑制Hedgehog信號(hào)通路的激活。Rab23可能是Hedgehog信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)分子并成為Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控中具有抑制腫瘤的作用的一個(gè)新靶點(diǎn)〔8～10〕。人參皂苷Rg3是由人參中提取的天然活性成分，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥，與化療聯(lián)合協(xié)同增效等顯著的作用〔11，12〕。

增殖細(xì)胞核抗原Ki-67是細(xì)胞作為細(xì)胞周期中核抗原的決定簇，在細(xì)胞周期中處于活動(dòng)期的細(xì)胞均可表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中廣泛應(yīng)用作為處于增殖狀態(tài)的標(biāo)志物〔13〕。Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，屬于抗凋亡基因〔14〕。

綜上，Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，并且聯(lián)合作用比單獨(dú)使用效果更加明顯。腫瘤增殖是腫瘤患者致死的最直接原因。腫瘤抑制基因和中藥聯(lián)合治療可能發(fā)揮較好作用，這為膠質(zhì)瘤的治療提供了一個(gè)新的方向。