單唾液酸四己糖-1-神經節(jié)苷脂減輕糖尿病腦病模型大鼠腦損傷的機制

劉書芳 汪琳 李月玲 李文雅 王明磊 黃圣明

(漯河市中心醫(yī)院 漯河醫(yī)專一附院，河南 漯河 462000)

糖尿病是臨床常見的慢性疾病，發(fā)病的同時會引起患者多種慢性并發(fā)癥。糖尿病周圍神經病變是臨床常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，通常在患病的10年內伴有明顯的神經病變的癥狀〔1〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，60%～90%的糖尿病患者有不同程度的神經病變〔2〕。糖尿病的發(fā)病機制十分復雜，由于機體長期處于嚴重的高血糖狀態(tài)，使機體出現(xiàn)微循環(huán)異常、神經營養(yǎng)因子缺乏、代謝障礙、氧化應激自由基增多和自身免疫紊亂等〔3〕。糖尿病腦病已經成為臨床上常見的疾病，因此，對于糖尿病腦病的研究越來越受到人們的關注。單唾液酸四己糖-1-神經節(jié)苷脂(GM-1)不僅能提高人體內部免疫因子含量，還對各種損傷性神經具有較強的修復功能和保健作用。一定劑量的GM-1即可促進神經的快速生長，對損傷后的髓鞘具有修復功能，可以有效減少周邊神經髓鞘的脫失概率，調節(jié)細胞的新陳代謝過程〔4〕。GM-1會轉移至神經細胞的細胞器中，參與核酸的合成與代謝，從而調控基因的轉錄和翻譯〔5〕。GM-1主要用于治療外傷性中樞神經系統(tǒng)損傷、腦血管性中樞神經系統(tǒng)損傷及帕金森病等，并且治療效果顯著〔6〕。神經細胞的凋亡與糖尿病密切相關，保護神經細胞功能是目前防治由糖尿病引起的各種腦組織病變問題的常用手段。內質網(wǎng)(ER)是細胞蛋白質合成的場所，當ER功能發(fā)生紊亂時，機體會立即檢測出異常狀態(tài)，并激活細胞的自我保護機制產生ER應激反應〔7〕。合理的ER應激反應能夠促進細胞的正常代謝，提高機體的生理功能，但是過度ER應激或超長時間的應激反應會降低細胞的活力，甚至殺死正常細胞〔8〕。所有神經細胞中都含有大量的ER，并對ER的應激反應具有較高的靈敏度，對糖尿病患者的神經細胞進行抽樣調查后可以看出ER應激標記物的數(shù)量顯著增加〔9〕。本研究通過鏈脲佐菌素建立了大鼠糖尿病腦病模型，檢測海馬區(qū)神經元特異性烯醇化酶(NSE)和S-100B的蛋白表達及海馬組織中ER應激相關分子CHOP、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、B淋巴細胞瘤(Bcl-2)和Bcl-2相關X基因(Bax)蛋白表達水平，并對GM-1治療后的大鼠應激誘導下的細胞凋亡狀況與腦組織損傷的相關性進行了探討。

1 材料與方法

1.1實驗材料 篩選60只Wistar大鼠，雄性、SPF級，每只大鼠的重量在190～200 g，采購單位為北京維通利華動物實驗公司。神經節(jié)苷脂注射液購自齊魯制藥廠。兔抗大鼠NSE多克隆抗體和兔抗大鼠S-100B多克隆抗體購于美國CST公司；CHOP、caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin等抗體購于美國Abcom公司；細胞組織蛋白提取試劑購于上海碧云天生物科技有限公司。實驗中采用的成像設備與系統(tǒng)均是從UVP公司采購；蛋白酶檢測儀器由BioTek公司生產。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及給藥 60只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、GM-1組，各20只。鏈脲佐菌素的注射器件為一次性注射器，注射部位為大鼠的腹腔，注射計量以60 mg/kg為標準，在注射完成后等待48 h，對注射大鼠的血糖水平進行檢測，如果檢測的血糖含量在16.7 mmol/L以上，即可判定該組大鼠符合腦病模型的構建需求，可以開展后續(xù)實驗。正常組注射的藥物為檸檬酸緩沖劑，注射方式為一次性注射。完成糖尿病模型的構建后，對實驗組和觀察組的大鼠按照10 mg/kg 的標準，1次/d直至觀察時間點。

1.2.2腦脊液GM-1含量的測定 在腹腔注射GM-1后的第3、7、14天后，使用20%烏拉坦麻醉大鼠。麻醉成功后，于大鼠頸后正中切口，暴露環(huán)枕膜。找到大鼠小腦的延髓池，從中抽取120 μl的大鼠腦脊液，然后運用光度監(jiān)測法，結合電子顯微鏡，對腦脊液中GM-1藥物的光吸收能力進行觀察，最后依據(jù)GM-1標準檢測曲線，結合相關計算公式對腦脊液中的GM-1含量進行檢測與計算。

1.2.3Western印跡檢測大鼠腦組織蛋白水平 在注射實驗結束后，首先將3組大鼠處死，并截取頭部；然后在冰上迅速分離出大鼠雙側海馬組織，使用4℃生理鹽水洗滌后，置于液態(tài)氮中凍存后，可冷凍于-80℃冰箱待測。大鼠腦組織中的海馬體存放在研缽中，并在其中加入合理劑量蛋白裂解液，并完成對腦組織的研磨。將研磨完成的腦組織成分置于冰塊上進行30 min的裂解反映后，在4℃的環(huán)境中、離心10 min，從裂解后的細胞液中抽取上清部分，并采用BCA蛋白濃度試劑盒對腦組織蛋白含量進行定量處理。

濃縮膠的選取標準為：純度在5%以上。分離膠的選用標準為：純膠含量為10%，隨后從已經分離出來的擔保樣品中抽取20 μl的劑量作為樣品，在電泳混合完成后，將實驗蛋白放置在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜之上。然后采用10%含量的脫脂乳粉溶液對蛋白進行封閉處理，并靜置2 h，在1∶1 000的比例和4℃孵育的情況下，應再第二日的上午開展后續(xù)實驗。洗膜的次數(shù)為3次，使用的產品為TBST，吸膜的時間應控制在15 min/次左右，在1∶4 000的比例下，應首先進行2 h的溫室孵育，然后采用TBST對膜進行清洗。最后采用化學發(fā)光試劑，對實驗中的蛋白進行著色處理。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.13組腦脊液GM-1測定 GM-1組大鼠腦脊液內GM-1含量在3、7、14 d均顯著高于模型組(P<0.01)，并且含量趨于穩(wěn)定；對照組和模型組由于未給予外源性的GM-1，但卻檢測到微量的腦脊液中的GM-1，推測應是內源性神經節(jié)苷脂。在所有測試階段，GM-1組大鼠腦脊液含有的GM-1水平遠大于模型組，說明腹腔注射GM-1可以有效提高中樞神經系統(tǒng)局部的GM-1的含量。見表1。

表1 各組腹腔注射后不同時間腦脊液GM-1含量

2.2各組海馬組織NSE蛋白表達測定 模型組大鼠的海馬組織NSE蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)。與模型組相比，GM-1組大鼠海馬組織中NSE蛋白表達顯著下調(P<0.05)，說明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病腦病引起的NSE蛋白升高。見圖1，表2。

圖1 各組海馬組織NSE蛋白表達

2.3各組海馬組織S-100B蛋白表達測定 模型組海馬組織S-100B蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)。與模型組相比，GM-1組海馬組織S-100B蛋白表達顯著下調(P<0.05)，說明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病腦病引起的S-100B蛋白升高。大鼠腦部海馬組織S-100B的變化規(guī)律與 NSE蛋白檢測出的變化規(guī)律幾乎一致。見表2，圖2。

圖2 各組海馬組織S-100B蛋白表達

2.4各組海馬組織CHOP蛋白表達測定 模型組海馬組織CHOP表達顯著高于對照組(P<0.05)，與模型組相比，GM-1組海馬組織CHOP蛋白表達量顯著下調(P<0.05)，說明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病腦病引起的ER應激標志蛋白CHOP表達升高。見表2，圖3。

2.5各組海馬組織中caspase-3蛋白表達測定 模型組海馬組織caspase-3表達顯著高于對照組(P<0.05)，與模型組相比，GM-1組海馬組織caspase-3蛋白表達顯著下調(P<0.05)，說明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病腦病引起的caspase-3蛋白表達升高。見表2，圖4。

圖3 各組海馬組織中CHOP蛋白含量的比較

圖4 各組海馬組織caspase-3蛋白表達

2.6GM-1對海馬組織Bax蛋白表達的影響 模型組海馬組織Bax的轉錄水平顯著高于對照組(P<0.05)，與模型組相比，GM-1組海馬組織Bax轉錄水平顯著下調(P<0.05)，說明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病腦病引起的促凋亡基因Bax轉錄水平的升高。見表2，圖5。

圖5 各組海馬組織Bax蛋白表達

2.7GM-1對海馬組織Bcl-2蛋白表達的影響 模型組海馬組織Bcl-2的轉錄水平顯著低于對照組(P<0.05)，與模型組相比，GM-1組海馬組織抑凋亡基因Bcl-2轉錄水平顯著上調(P<0.05)，說明腹腔注射GM-1可以有效地提高糖尿病腦病引起的抑凋亡基因Bcl-2轉錄水平的降低。見表2，圖6。

圖6 各組海馬組織Bcl-2蛋白表達

3 討 論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，61.8%的糖尿病患者伴有神經病變，其中糖尿病腦病是最常見的并發(fā)癥之一。目前對于糖尿病腦病的具體發(fā)病機制還不清楚，多數(shù)研究人員認為是由于機體微循環(huán)障礙、代謝紊亂及神經營養(yǎng)因子減少等因素導致的〔9〕。

糖尿病患者的血糖含量始終處于較高水平，而高水平的血糖含量會加速細胞的新陳代謝過程，并對一些神經細胞具有死亡促進作用，從而導致神經細胞的傳導功能衰退，死亡速度加快。糖尿病對人體的中樞神經阻滯具有較強的侵害作用，會降低大腦神經中樞的工作效率，使腦神經結構和組織發(fā)生生理性病變，加速腦細胞的衰老與死亡〔10〕。糖尿病患者存在神經損傷問題的根本原因在于其體內血糖含量的上升，兩者之間存在正相關性。GM-1屬于神經糖鞘脂類，生存的空間僅限于神經元細胞膜中，能夠對人體起到神經信號傳導作用〔10〕。研究表明，由外部注入體內的GM-1可以有效促進神經因子的生長，并誘導內源性神經因子的重新發(fā)育，GM-1對腦組織中軸的突膜具有良好的刺激作用，能夠激活突膜區(qū)域的蛋白酶，對神經信號的傳導具有增益效果，對神經性損傷具有一定的修復作用〔11〕。

海馬區(qū)域是大腦中具有學習記憶功能的重要神經中樞部位，海馬區(qū)域受損會使患者出現(xiàn)嚴重的腦損傷，并伴有嚴重的記憶功能障礙。NSE和S-100B是大腦海馬組織中與腦損傷相關的神經元特異性標志物，對海馬體腦組織神經損傷問題的研究始終是學術界重點關注的課題。NSE在腦中樞神經損傷的治療方面具有較高的特殊性，與其他藥物的差異主要集中在神經元細胞與內分泌細胞中的藥物含量，因此可以作為神經細胞損傷的重要標志物。S-100B是一種細胞溶質鈣結合蛋白，在細胞中的含量十分豐富，主要分布于雪旺細胞和神經膠質細胞中。當腦組織發(fā)生損傷后，被激活的星形膠質細胞會產生大量的S-100B，并對星形膠質細胞的激活產生正反饋調節(jié)。S-100B蛋白過表達會導致神經毒作用，從而對腦組織中的神經元細胞、膠質細胞產生死亡誘導作用，使這些細胞走向死亡。NSE和S-100B是中樞神經系統(tǒng)中的標志性蛋白，分別以神經元和神經膠質細胞為主〔7〕。本研究結果說明在糖尿病腦病的發(fā)病機制中，大鼠海馬組織的神經元及神經膠質細胞均受到了明顯損傷，推測GM-1對糖尿病腦病大鼠腦部的神經損傷起明顯的保護作用，NSE和S-100B可以作為糖尿病腦病病情程度評估的指標。

本研究結果說明GM-1在注射進大鼠體內后，可以由CHOP途徑來降低神經細胞死亡，延長細胞衰老的時間。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，采用GM-1進行糖尿病腦病的治療，可以使caspase-3的水平大幅降低，由此可以推測出GM-1對神經細胞的凋亡具有抑制作用，對糖尿病腦病具有較強的療效。此外，本研究結果還進一步證實CHOP的過表達和積聚會使促凋亡基因Bax上調，抗凋亡基因Bcl-2下調，當Bcl-2/Bax的比值降低后，會導致細胞發(fā)生凋亡。本研究結果提示GM-1主要是利用對CHOP蛋白表達強度的降低，來實現(xiàn)對線粒體傳播途徑的阻斷，使神經細胞在較短的時間內凋亡，從而加速了人體的衰老過程。