腎蘇Ⅳ對糖尿病腎病大鼠足細胞、podocin及VEGF水平的影響

黃勇 程潔 周曄華 王茂泓 黃雅倩 吳國慶 皮持衡

(江西中醫(yī)藥大學 1附屬醫(yī)院腎病科，江西 南昌 330019；2科技學院)

糖尿病(DM)腎病(DN)又稱DM腎小球硬化癥，是DM的主要并發(fā)癥之一〔1〕。DN的發(fā)病率比一般疾病高，且療效差，其特點主要以腎小球血管受損、硬化為主，臨床上表現(xiàn)為尿蛋白排泄量增加〔2〕。目前來看，足細胞是通過腎小球基底膜外側(cè)的細胞高度分化而來，并且足細胞結(jié)構(gòu)的改變和分子的異常表達都和DN蛋白尿的產(chǎn)生有密不可分的聯(lián)系，其中導(dǎo)致DN持續(xù)發(fā)生的主要因素就是足細胞的損傷情況〔3〕。

裂孔隔膜上的蛋白分子是維持足細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的關(guān)鍵，例如podocin蛋白分子等，在腎小球的濾過屏障中，這些蛋白分子決定著其選擇性的功能〔4〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種多向性分子，其中在骨髓的造血細胞、發(fā)育腎組織的神經(jīng)纖維中，都有VEGF的表達，并且多種的生物效應(yīng)也會通過VEGF和VEGF異性受體相互結(jié)合而發(fā)揮出來〔5〕。腎小球中的VEGF可自行分泌后再作用于足細胞，并增殖并分化足細胞，對足細胞有非常重要的作用〔6〕。研究證實，腎系膜細胞中的VEGF mRNA的表達可以通過高糖進行刺激，以此來增加其表達〔7〕，由此可見，VEGF在DN的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用〔7〕。本研究在以往關(guān)于“腎絡(luò)病癥”的基礎(chǔ)上，采用“益氣祛風、養(yǎng)血和絡(luò)”的創(chuàng)新性思路干預(yù)DN足細胞損傷，通過建立DN大鼠模型，觀察中藥復(fù)方“腎蘇Ⅳ”對大鼠的足細胞超微結(jié)構(gòu)和其相關(guān)的分子podocin和VEGF的表達的影響。

1 材料和方法

1.1材料 動物：選用雄性SD大鼠，均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，共30只。所有大鼠體重160～180 g，常溫下飼養(yǎng)大鼠，讓大鼠自由飲水攝食7 d，讓所有大鼠對新的環(huán)境進行適應(yīng)。

試劑與儀器：本實驗所用試劑和儀器分別為：江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房按照比例煎制腎蘇Ⅳ，按照黃芪30 g，炒當歸10 g，青風藤15 g，澤蘭15 g，漢防己10 g，僵蠶10 g，重樓10 g的比例進行調(diào)制。所有藥品重復(fù)煎煮3次，把煎煮完的藥物濃縮為100 ml的汁液備用。Sigma公司生產(chǎn)的鏈脲佐菌素(STZ)；Abcam公司生產(chǎn)的山羊兔抗podocin抗體；北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的兔抗VEGF抗體；強生中國有限公司生產(chǎn)的強生穩(wěn)步型血糖測試儀；蘇凈安泰公司生產(chǎn)的超凈工作臺；日本日立公司生產(chǎn)的透射電鏡；美國RD公司生產(chǎn)的大鼠尿白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒。

1.2動物分組與模型建立 所有大鼠適應(yīng)1 w新的環(huán)境，禁食12 h，把大鼠平均分為正常對照組(NC組)，DN大鼠模型組(DN組)和DN大鼠模型加腎蘇Ⅳ治療組(SC組)。除NC組外的大鼠均建立DN大鼠模型，DN組和SC組大鼠腹部注射STZ溶液，60 mg/kg其中STZ溶液是由pH值為4.5的檸檬酸鹽緩沖液配制而成，其中檸檬酸鹽含量為0.1 mol/L。NC組大鼠注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。飼養(yǎng)大鼠1 w后采取大鼠的尾靜脈血液，測量空腹大鼠的血糖，當測量的值≥16.7 mmol/L為成功建模。在造模成功后第1天起，SC組大鼠給予劑量為1.8 ml/400(g·d)的腎蘇Ⅳ灌胃，NC組和DN組大鼠灌服同等劑量生理鹽水，干預(yù)周期6 w。

1.3收集標本 結(jié)束實驗之前的1 d，開始用代謝籠收集大鼠24 h的尿量，并對其尿量進行記錄。稱重后分離腹主動脈血清，并把血清置入-20℃中保存待用。采取大鼠10 ml的心臟血液，置于-70℃的環(huán)境中保存。處死大鼠后，將大鼠的左腎取出并稱其重量，采取腎皮質(zhì)區(qū)中的多塊腎組織，大小為1 mm3，把腎組織塊用戊二醛進行固定，以備電鏡檢查使用。取出雙側(cè)腎臟并稱重，稱重前把表面的血液吸干，其中一部分的腎組織用甲醛進行固定，待石蠟切片使用。將剩余的腎組織冷藏在液氮中，最后放置在-80℃冰箱中保存。

1.4觀察一般狀態(tài) 一般狀態(tài)包括精神、活動、毛發(fā)的色澤及脫落、體重和排便等。

1.5腎指數(shù)和血糖的測定 3組各處死3只大鼠，取出大鼠兩側(cè)的腎并稱重，稱重前將表面的血液吸干，計算腎指數(shù)。采用酶耦聯(lián)比色法檢測3組大鼠尾靜脈血的血糖。

1.6生化檢測 采用全自動的生化分析儀檢測3組大鼠的生化情況，其中包括血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和肌酐(Scr)的濃度。用雙縮脲法測定24 h的尿蛋白(Pro)。

1.7透射電鏡檢查大鼠超微結(jié)構(gòu) 將固定好的腎組織塊取出，進行磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗、脫水并切成80～90 nm的片狀，透射鏡觀察被溫染的組織，具體觀察足細胞個數(shù)，足突平均寬度(FPW)、足突融合率和基底膜厚度(GBM)。

1.8腎臟組織形態(tài)學觀察 每組大鼠各處死3只，具體的操作如下：取出腎皮質(zhì)，用甲醛將腎皮質(zhì)固定1 d，切片，厚度為3 μm，將組織進行蘇木素-伊紅(HE)染色和PAS染色后進行觀察。

1.9Western印跡檢測大鼠腎組織中podocin和VEGF蛋白的表達 將3組腎組織分別提取100 mg，將細胞裂解并提取核蛋白測量濃度，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液混勻，按照4∶1進行，為了讓蛋白質(zhì)變性需將蛋白溶液煮沸處置。電泳板孔內(nèi)注入蛋白樣品50 μg。轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后加脫脂奶粉，封閉1 h。TTBS洗滌要在加入的1抗前進行，每次漂洗10 min，一共進行3次漂洗，最后加入2抗對溶液進行稀釋，再在常溫環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后數(shù)碼相機照相。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)比較 NC組大鼠毛發(fā)很有光澤，自由活動且有靈敏的反應(yīng)。DN組大鼠精神狀況欠佳，且大鼠均反應(yīng)緩慢，活動也很疲倦，毛發(fā)泛黃無光澤，還有大鼠出現(xiàn)脫毛的情況，大鼠伴隨尿量也增多，體重也明顯減輕；與DN組大鼠相比，SC組大鼠的情況明顯出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。

2.2各組大鼠體重、腎指數(shù)和血糖的比較 與NC組比較，DN組和SC組體重明顯降低、腎指數(shù)、血糖水平均明顯升高(均P<0.05)；SC組體重明顯高于DN組，且腎指數(shù)和血糖水平均明顯低于DN組(均P<0.05)。見表1。

2.33組生化檢測比較 與NC組比較，DN組和SC組Pro、TC、TG和Scr水平均明顯增高(P<0.05)；與DN組比較，SC組各項指標水平均明顯下降(均P<0.05)，見表1。

2.43組腎臟組織形態(tài)比較 NC組的腎組織形態(tài)均正常，與NC組相比，DN組腎小球肥大，毛細血管基底膜增厚，系膜基質(zhì)中有增生出現(xiàn)，腎小管上皮細胞也出現(xiàn)了空泡樣變，蛋白管型較為常見。與DN組相比，SC組腎組織形態(tài)明顯變好，如圖1。

黑色箭頭表示腎小球，綠色、紅色箭頭表示腎小管圖1 3組腎組織形態(tài)(×50)

2.53組足細胞個數(shù)和FPW等比較 NC組足細胞結(jié)構(gòu)完整，足突的排列整齊有序，清晰可見；與NC組相比，DN組足突有增寬的現(xiàn)象，有的足突已經(jīng)融合并且消失，足細胞也不完整且減少，大鼠的基底膜有也明顯增厚的情況出現(xiàn)。與NC組比較，DN組和SC組FPW、融合率及GBM均明顯增高，而足細胞個數(shù)明顯下降(均P<0.05)；與DN組比較，SC組FPW、融合率和GBM均明顯下降，而足細胞個數(shù)明顯上升(均P<0.05)。見表2、圖2。

2.6Western印跡檢測podocin和VEGF的蛋白水平 DN組腎組織中podocin蛋白的表達明顯低于NC組，而VEGF蛋白的表達明顯高于NC組(P<0.05)；與DN組相比較，SC組大鼠腎組織中podocin蛋白明顯升高，且VEGF蛋白的表達顯著下降(P<0.05)，見表2、圖3。

黑色箭頭表示足突，紅色箭頭表示基底膜圖2 3組電鏡下濾過膜的超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

圖3 3組podocin和VEGF蛋白表達

3 討 論

在DM中最常見的微血管并發(fā)癥為DN，遺傳易感性和高糖長時間的相互作用，從而讓DN不斷發(fā)生與發(fā)展。DN不僅會因為腎小球基底膜增厚而發(fā)生基本的病理改變，還會受到基質(zhì)樣物質(zhì)增生的影響，在臨床上通常表現(xiàn)為尿蛋白的排泄持續(xù)性的增加〔8〕。足細胞結(jié)構(gòu)及功能的改變是蛋白尿產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)，并成為DN持續(xù)進展的關(guān)鍵因素〔9，10〕。相鄰足突之間的裂孔是由podocin、VEGF等多種蛋白分子相互連接，從而阻止大分子物質(zhì)通過，讓腎小球濾過膜有高度的選擇性。podocin、VEGF均為跨膜蛋白并特異性表達在裂孔膜上，podocin通過其C末端與CD2相關(guān)蛋白的胞內(nèi)段相互作用，可促進信號傳導(dǎo)。研究表明，podocin和VEGF信號傳導(dǎo)異?？梢鹱慵毎δ墚惓２?dǎo)致蛋白尿的發(fā)生〔11〕。從中醫(yī)角度分析，DN病程綿長，腎氣虛弱是導(dǎo)致疾病慢化性的主要因素，其疾病虛實錯雜的病例原因是濕濁、瘀血、熱毒和外邪等。前期圍繞“腎臟固有細胞功能調(diào)節(jié)”進行了系列研究〔12，13〕，本研究在之前的基礎(chǔ)上篩選具有療效優(yōu)勢的中藥復(fù)方腎蘇Ⅳ對DN大鼠進行干預(yù)，并且探討DN大鼠抑制足細胞損傷的機制。

本研究結(jié)果說明DN發(fā)生時，在糖代謝異常的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂和腎功能損害，在腎蘇Ⅳ干預(yù)后，SC組大鼠的情況都明顯好轉(zhuǎn)。腎蘇Ⅳ由3組藥物組成：①以生黃芪、炒當歸益氣養(yǎng)血，充養(yǎng)腎絡(luò)；②以漢防己、青風藤、僵蠶祛風勝濕，搜剔腎絡(luò)風濕伏邪；③以重樓、澤蘭解毒通絡(luò)。諸藥協(xié)同以益氣祛風、養(yǎng)血和絡(luò)，促進腎絡(luò)氣血調(diào)和〔14〕。

DN發(fā)生時，高糖可下調(diào)podocin的表達也是導(dǎo)致其發(fā)生的主要原因。①DN會讓組成裂孔膜的分組發(fā)生改變，減少足突之間的分子鏈接，甚至中斷分子鏈接，進而改變足突的形態(tài)〔15，16〕；足突會在高糖的狀態(tài)下完全的融合，甚至完全消失不見，podocin蛋白的表達也會受高糖的影響而減少，從此讓蛋白尿的排泄增多〔17，18〕。②在腎組織中podocin的表達降低，阻礙了細胞外到內(nèi)CD2相關(guān)蛋白和細胞骨架蛋白之間的信號傳遞，足細胞的結(jié)構(gòu)因此而受到破壞；當足細胞脫落后，基底膜裸露，毛細血管袢由于靜水壓的作用向包曼氏囊腔側(cè)凸出、粘連，甚至腎小球局灶節(jié)段硬化形成〔19，20〕。本研究結(jié)果提示腎蘇Ⅳ可通過改善足細胞的結(jié)構(gòu)而減少尿蛋白形成，減輕高血糖所致的腎臟損害。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方腎蘇Ⅱ能夠有效地延緩慢性腎臟病早期患者腎纖維化進程，腎功能有顯現(xiàn)改善〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)辛通暢絡(luò)法復(fù)方腎蘇Ⅱ可通過作用于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1，從而延緩FSGS大鼠腎間質(zhì)纖維化進程〔22〕。尚懿純等對局灶節(jié)段性腎小球硬化大鼠做研究發(fā)現(xiàn)，腎蘇Ⅱ方可延緩FSGS大鼠疾病進展的作用機制為抑制了Notch1、P53活性，從而阻抑足細胞凋亡進程〔23〕。本研究發(fā)現(xiàn)腎蘇Ⅳ能使腎組織中podocin蛋白表達上調(diào)，并且隨著足突和基底膜改善更明顯，大鼠Pro也顯著減少，可見腎蘇Ⅳ可增加podocin表達，對腎小球過濾有一定的恢復(fù)作用，減輕蛋白尿的形成；但腎蘇Ⅳ對足細胞podocin分子結(jié)構(gòu)上是否存在血管緊張素Ⅱ受體有待進一步研究。

DN的發(fā)生中細胞因子的作用備受人們的關(guān)注，VEGF屬于一種有絲分裂原，在血管的內(nèi)皮細胞中有一定的作用，促進其細胞的增殖，同時還增加血管的通透性，一定程度上改變了內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能，細胞外基質(zhì)被合成，在DN中的作用非常的重要。研究證實，DN患者比正常人的VEGF蛋白表達明顯增多，并且經(jīng)過腎蘇Ⅳ干預(yù)后發(fā)現(xiàn)其蛋白表達會明顯下降〔24〕。

綜上，腎蘇Ⅳ可有效地調(diào)控podocin和VEGF蛋白表達的平衡，從而改善足細胞超微結(jié)構(gòu)的病變，同時對DN有一定的防治作用。