miRNA-10a及miRNA-27a在老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測中的價值

鄒敏 孫奕琛 劉文 李利 (江漢大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科，湖北 武漢 43005；腫瘤科)

外科手術(shù)是治療乳腺癌的常用手段，通過切除腫瘤組織避免癌細胞擴散，提高腫瘤局部控制率，改善生活質(zhì)量〔1〕。但仍有部分患者病情惡化出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗，尤其老年乳腺癌患者一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，生存質(zhì)量差，5年生存率低，預(yù)后差〔2〕；故需重視其預(yù)后評估。調(diào)查顯示，腫瘤易感性及進展與miRNA密切相關(guān)，超過50%的miRNA定位于腫瘤雜合子缺失區(qū)、染色體擴增區(qū)等，通過多通路調(diào)控腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移〔3〕。miRNA-10a定位于17號染色體短臂HOXB4及HOXB5基因間隙，目前已被證實與胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)，可通過促進DNA甲基化調(diào)控HOXB4、HOXD4基因轉(zhuǎn)錄，參與造血細胞分化、免疫調(diào)節(jié)、癌細胞增殖及進展等過程〔4，5〕。miRNA-27a定位于19號染色體短臂，屬多功能miRNA，已發(fā)現(xiàn)miRNA-27a參與宮頸癌、肝癌發(fā)病過程〔6，7〕，且與骨代謝疾病、肌肉細胞發(fā)育等密切相關(guān)〔8，9〕。但對miRNA-10a、miRNA-27a與乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未見報道。本研究擬對老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者乳腺癌病理組織miRNA-10a、miRNA-27a水平進行檢測，旨在明確兩者與老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期為老年乳腺癌術(shù)后預(yù)后評估提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1一般資料 收集2016年1月至2017年6月漢江大學(xué)附屬醫(yī)院收治的98例老年乳腺癌手術(shù)患者的臨床資料。按隨診術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況分為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組32例與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組66例。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥60歲；經(jīng)手術(shù)病理確診為乳腺癌；接受乳腺癌根治術(shù)治療；留存病理蠟塊標(biāo)本；有完整術(shù)后2年隨診結(jié)果；臨床及病理資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心肝腎肺疾?。黄渌l(fā)性惡性腫瘤；活動性感染；無法控制糖尿病或高血壓；嚴(yán)重腦血管??；術(shù)前已接受放化療或其他抗腫瘤治療；血液系統(tǒng)疾病或凝血功能異常；嚴(yán)重精神疾病無法配合；臨床或隨訪資料不全。

1.3主要試劑及儀器 miRNA-10a、miRNA-27a引物及內(nèi)參引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限工程公司合計及合成，cDNA第1鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；Trizol試劑盒(美國Invirotrogen公司)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(日本Takara公司)，Taq-Man miRNA Assays(Applied Bidsystems公司)；高速冷凍離心機(美國Beckman coulter公司)，-80℃超低溫冰箱(日本Sanyo公司)，ND-1000型紫外分光廣度計(NanoDrop公司)，7500型RT-PCR System(Applied Bidsystems公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4方法 留存乳腺癌組織解凍，液氮研磨成粉末，加入Trizol試劑盒提取總RNA，紫外分光度儀測定吸光度A值，A260/A280比值>1.8確定標(biāo)本滿意后用于監(jiān)測miRNA，1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，1 μl cDNA置于反應(yīng)體系內(nèi)94℃擴增120 s，膠回收純化DNA片段，RT-PCR法測定miRNA-10a、miRNA-27a表達水平，嚴(yán)格參照試劑使用說明操作，miRNA-10a引物序列為上游：5′-TTACACACGCTTACCCTGTAG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATC-3′；miRNA-27a引物序列為上游：5′-GGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3′，下游：5′-GCGGAACTTAGCCACTGTGA-3′；U6(內(nèi)參)引物序列為上游：5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；均以U6為內(nèi)參，反應(yīng)體系：上下游引物各1 μl+2×SYBR Green Mix 10 μl+cDNA 1 μl+0.1%滅菌蒸餾水補足，總體積20 μl；擴增條件：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)，每樣品均設(shè)3個復(fù)孔，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，樣品熒光信號達RT-PCR儀器最高閾值時擴增循環(huán)數(shù)為Ct值，-2△△Ct法計算目的基因相對表達量，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)〔10〕。

1.5隨訪 患者均接受為期2年隨訪調(diào)查，采用電話、門診復(fù)查等方式，出院6個月內(nèi)每3個月隨訪1次，6個月以后每半年隨訪1次，隨訪截止至2019年6月，統(tǒng)計乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、多因素Logistic回歸分析、受試者工作特征(ROC)曲線分析miRNA-10a、miRNA-27a對乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值。

2 結(jié) 果

2.1隨訪2年復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況 隨訪2年局部復(fù)發(fā)13例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例，遠處轉(zhuǎn)移14例，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移共32例(32.65%)，其中術(shù)后1年內(nèi)11例，1～2年21例。

2.2兩組一般資料比較 兩組病理類型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組腫瘤直徑>2 cm、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)/孕激素受體(PR)均陰性率均顯著高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較〔n(%)〕

2.3兩組miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量比較 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組癌組織miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量均顯著高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 兩組miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量比較

圖1 兩組乳腺癌組織miRNA-10a、miRNA-27a RT-PCR產(chǎn)物

2.4老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素分析 以術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移為因變量，以單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)據(jù)腫瘤直徑(>2 cm)、臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER/PR均陰性率、miRNA-10a、miRNA-27a作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析(α入=0.05，α出=0.10)，結(jié)果顯示：臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER/PR均陰性率、miRNA-10a、miRNA-27a均為老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素

2.5miRNA-10a、miRNA-27a對老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值 ROC曲線分析見表4、圖2。

表4 miRNA-10a、miRNA-27a對老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

圖2 miRNA-10a、miRNA-27a預(yù)測乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討 論

miRNA屬小分子非編碼RNA，有證據(jù)顯示，此類RNA在乳腺癌中扮演癌基因及抑癌基因角色，參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等級聯(lián)過程，同時與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤肝細胞生成密切相關(guān)〔11，12〕。早期乳腺癌miRNA表達譜中已發(fā)現(xiàn)20余種miRNA表達與正常組織存在差別〔13，14〕。最新研究提出，miRNA可作為腫瘤預(yù)后評估依據(jù)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)〔15〕。miRNA-10家族位于同源異型和基因HOX簇內(nèi)，參與生長調(diào)控過程，目前已發(fā)現(xiàn)miRNA-10a在甲狀腺癌組織異常上調(diào)，高出癌旁組織10余倍〔16〕。也有數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌細胞系內(nèi)miRNA-10a呈明顯高表達，干擾miRNA-10a表達可抑制癌細胞侵襲〔17〕。本研究對老年乳腺癌癌組織miRNA-10a表達情況監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，其miRNA-10a表達較Lee等〔18〕報道的正常乳腺組織高，且隨訪2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者癌組織miRNA-10a水平明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，證實miRNA-10a可能參與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程，分析機制可能與miRNA-10a存在癌基因作用，可通過調(diào)控細胞黏附分子表達，促進癌細胞克隆、增殖，增加其侵襲性，促進其遷移，進而促成乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

miRNA-27a被認為是典型癌基因miRNA，肝癌中miRNA-27a可通過提高轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達，提高細胞黏附分子表達〔19〕；胰腺癌中miRNA-27a可靶向調(diào)控Spry2表達，調(diào)節(jié)細胞生長、克隆及侵襲〔20〕；子宮內(nèi)膜癌中抑制miRNA-27a表達可促進癌細胞G1期停滯及凋亡〔21〕。本研究與Li等〔22〕假設(shè)觀點一致，推測乳腺癌組織miRNA-27a表達異常上調(diào)可能促成癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究與早期報道〔23，24〕結(jié)論相符，主要與臨床分期靠后、病理分化程度低、ER/PR陰性、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者癌細胞侵襲性強、癌細胞新生血管多，腫瘤血供豐富，更易呈現(xiàn)侵襲性生長、擴散轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，腫瘤細胞易擴散進入血循環(huán)，造成復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移〔25，26〕。此外，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-10a、miRNA-27a為老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，推測miRNA-10a、miRNA-27a在乳腺癌進展過程中可能發(fā)揮原癌基因作用，促成癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，造成乳腺癌復(fù)發(fā)。且兩者對乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有較高的預(yù)測價值，因此對miRNA-10a、miRNA-27a水平超過臨界值的乳腺癌患者需強化術(shù)后隨訪追蹤，警惕復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。

綜上，老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者癌組織miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量較高，兩者對乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移均有較高的預(yù)測價值，有望作為老年乳腺癌預(yù)后預(yù)測的新分子標(biāo)志物。但本實驗獲取樣本量少，且尚未分析miRNA-10a、miRNA-27a與乳腺癌病理參數(shù)的關(guān)系，存在一定的局限性，對miRNA-10a、miRNA-27a與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其具體機制尚待驗證。