n-3多不飽和脂肪酸對糖尿病心肌病小鼠心臟的保護作用*

陳顯桐， 左盛佳， 李可欣， 劉已斌， 王超群， 肖佩儀， 趙澤新， 余細(xì)勇， 江雪燕

（廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東省分子靶標(biāo)與臨床藥理學(xué)重點實驗室，呼吸疾病國家重點實驗室藥理學(xué)組，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東廣州511436）

糖尿?。╠iabetes mellitus）是指由胰島素分泌障礙或其生物功能受損而引起的一種以慢性高血糖為主要特征的代謝性疾病，其主要病因是胰島β細(xì)胞被破壞或胰島素敏感性下降產(chǎn)生胰島素抵抗導(dǎo)致機體血糖持續(xù)升高，臨床表現(xiàn)為多飲、多食、多尿和體重減輕等［1］。1型糖尿病是由于胰島β細(xì)胞功能受損而導(dǎo)致胰島素分泌絕對不足，多發(fā)生于青少年和兒童；2型糖尿病是由于機體內(nèi)胰島β細(xì)胞分泌胰島素相對不足或靶細(xì)胞對胰島素敏感性下降使胰島素的生物功能下降從而產(chǎn)生胰島素抵抗，多發(fā)生于老年人和肥胖者［2］。糖尿病發(fā)病率高，患者基數(shù)大，現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要慢性非傳染性疾?。?］。由于機體長期處于高血糖狀態(tài)，糖尿病可以引起全身大血管及微小血管病變，引發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，如腎臟疾病、神經(jīng)性疾病、視網(wǎng)膜疾病和心血管疾病等［4-5］，其中糖尿病心肌?。╠iabetic cardio?myopathy，DCM）是最嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥之一。

DCM是指由糖尿病引起且與高血壓、心臟瓣膜疾病和冠狀動脈疾病無關(guān)的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的心肌疾病，以心肌肥大、心臟收縮和舒張功能受損等為主要病理特征［6］。DCM的概念由Rubber等［7］于1972年首次提出，臨床上DCM患者主要表現(xiàn)為在長期高血糖狀態(tài)下所導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)改變及心臟功能下降，包括心肌細(xì)胞炎癥、凋亡和纖維化等，隨著病情發(fā)展最后會出現(xiàn)心力衰竭，從而危及患者生命。因此，研究DCM的發(fā)病機制并尋找一種新的治療途徑對DCM的預(yù)防及治療具有重要意義。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥介質(zhì)在DCM患者和動物模型中表達(dá)升高，表明炎癥反應(yīng)是機體早期應(yīng)對高血糖環(huán)境的一種保護性反應(yīng)，持續(xù)的炎癥反應(yīng)引發(fā)心肌纖維化和重構(gòu)，最終導(dǎo)致心肌功能受損［8］。已有研究報道，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization do?main-like receptor protein 3，NLRP3）炎 癥 小 體 是DCM炎癥發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)NLRP3炎癥小體激活后，心肌組織中促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（in?terleukin-1β，IL-1β）和IL-18分泌顯著增加，導(dǎo)致心肌組織的炎癥、纖維化和凋亡加重［9］。NLRP3炎癥小體通路及其相關(guān)炎癥因子的激活與DCM的發(fā)生密切相關(guān)并且在其發(fā)展中起重要作用。

n-3多不飽和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs）是指含有2個或2個以上雙鍵且第1個雙鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端第3個碳位的多聚多不飽和脂肪酸。n-3 PUFAs廣泛存在于自然界的動植物中，其中α-亞麻酸是合成DHA和EPA的前體，但人體內(nèi)不能合成α-亞麻酸，必須通過食物攝取，因而一種必需脂肪酸，目前人們攝取n-3 PUFAs的主要途徑是食用海洋生物［10］。研究表明，n-3 PUFAs具有改善血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生理功能，并且對風(fēng)濕性疾病、代謝性疾病、帕金森病等具有顯著功效［11］。此外，大量研究顯示Fat-1轉(zhuǎn)基因（Fat-1+/+）小鼠是研究n-3 PUFAs的理想動物模型［12］。Fat-1基因來源于秀麗隱桿線蟲，編碼n-3脂肪酸脫飽和酶，后者以n-6 PUFAs為底物進行脫氫反應(yīng)合成n-3 PUFAs。與野生型C57BL/6小鼠相比，F(xiàn)at-1+/+小鼠能在體內(nèi)將n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs，從而降低n-6/n-3 PUFAs比值。與飲食補充n-3 PUFAs相比，轉(zhuǎn)入Fat-1基因不僅可以增加n-3 PUFAs的含量，還可以降低n-6 PUFAs的水平。因此，在不改變總脂肪酸含量的情況下，F(xiàn)at-1+/+小鼠可用于n-3 PUFAs防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松等的動物研究［13］。目前，轉(zhuǎn)入Fat-1基因已被證實具有預(yù)防肥胖、葡萄糖耐受不足和肝脂肪變性等的作用［14］。此外，已有研究表明，使用鏈脲佐菌素（strep?tozotocin，STZ）誘導(dǎo)1型糖尿病后，F(xiàn)at-1+/+小鼠胰島β細(xì)胞得到n-3 PUFAs的保護，血糖降低，進而糖尿病癥狀減輕［15］。為進一步研究n-3 PUFAs對DCM的作用及其調(diào)控機制，我們采用Fat-1+/+小鼠作為動物模型，觀察n-3 PUFAs對DCM小鼠心肌炎癥、凋亡和纖維化的影響，以期為DCM的預(yù)防和治療提供新思路和新途徑。

材料和方法

1 動物

6~8 周齡、體重約18~20 g的SPF級雄性C57BL/6野生型（wild-type，WT）小鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0034。Fat-1+/+小鼠由廣東省人民醫(yī)院、廣東省心血管病研究所馬歡博士課題組惠贈并由本實驗室進行繁殖與基因型鑒定；基因型鑒定后選取6~8周齡、體重約18~20 g的雄性Fat-1+/+小鼠用于DCM造模實驗。各組小鼠分籠飼養(yǎng)于實驗動物中心并保持溫度（22±2）℃和濕度（50±10）%的飼養(yǎng)條件；實驗前至少適應(yīng)環(huán)境1周。實驗方案均通過廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的審查和批準(zhǔn)。實驗操作符合實驗動物倫理要求的相關(guān)規(guī)定并遵循實驗動物的操作規(guī)范。

2 主要試劑

45%高脂飼料（D12451）購自Research Diets；STZ和D-（+）-葡萄糖購自Sigma；RIPA裂解液、蛋白酶與磷酸酶抑制劑、Trizol、BCA蛋白試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自Thermo；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和預(yù)混型qPCR試劑盒購自艾科瑞生物工程有限公司；異氟烷購自于瑞沃德公司；抗cleaved caspase-3抗體、抗轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）抗體、抗NLRP3抗體、抗含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）抗體、抗caspase-1抗體、抗IL-1β抗體、抗IL-18抗體和抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體均購自Affinity Biosciences；抗GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和抗鼠Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司。所用引物均由Thermo根據(jù)引物序列合成，其中用于RT-PCR的引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for RT-qPCR

3 主要方法

3.1Fat-1+/+小鼠的基因型鑒定Fat-1+/+小鼠出生后3~4周，剪小鼠尾尖2~3 mm，加入蛋白酶K于56℃水浴中消化過夜，按照DNA提取試劑盒提取基因組DNA。取100 ng基因組DNA為模板及下述PCR引物進行PCR擴增。Fat-1的PCR上游引物序列為5'-CGGCTTGATGCTCGTCATTG-3'，下游引物序列為5'-TACTCTAGAACGGCACGGGA-3'。擴增條件為：94℃5 min；94℃20 s，60℃30 s，35個循環(huán)；72℃5 min。取擴增后的PCR產(chǎn)物10μL在含有溴乙啶核酸染料的2%瓊脂糖凝膠上上樣并于120 V電壓電泳30 min，使用超靈敏多功能凝膠成像儀于紫外光下觀察擴增條帶。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶結(jié)果鑒定小鼠基因型。

3.2 小鼠DCM模型的構(gòu)建 6~8周齡雄性WT和Fat-1+/+小鼠分別隨機分成正常對照組和DCM模型組，共4組：WT組、Fat-1+/+組、WT+DCM組和Fat-1+/++DCM組，每組8~15只小鼠。DCM模型組連續(xù)5 d腹腔注射50 mg/kg檸檬酸緩沖液稀釋的STZ，對照組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液，注射結(jié)束第3天測定小鼠空腹血糖，血糖濃度高于11.6 mmol/L則選取用于DCM造模并使用45%高脂飼料（high-fat diet，HFD）喂養(yǎng)20周，對照組給予普通飼料，期間正常飲食，自由飲水。

3.3 超聲心動圖測定心功能 DCM造模10周后，每隔2周應(yīng)用Vevo 3100小動物超聲儀（VisualSonics）對小鼠進行超聲心動圖檢測，觀察和記錄左心室結(jié)構(gòu)及心臟收縮和舒張功能的變化。采用異氟烷吸入法麻醉小鼠并將其固定于恒溫板上，前胸脫毛后涂抹超聲耦合劑，使用30 MHz超聲探頭在左心室乳頭肌水平切面位置選取短軸方向并在M-Mode下檢測心臟收縮功能，在心臟四腔心切面使用彩色多普勒和組織多普勒模式檢測心臟舒張功能。超聲心動圖連續(xù)記錄5個完整心動周期圖像并使用軟件測量心功能各項參數(shù)，5個心動周期的平均數(shù)值為每只小鼠的檢測值。心臟收縮功能檢測指標(biāo)包括：左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）、左心室收縮末期前壁厚度（left ventricular an?terior wall thickness at end-systole，LVAWs）、左心室舒張末期前壁厚度（left ventricular anterior wall thick?ness at end-diastole，LVAWd）、左心室收縮末期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at endsystole，LVPWs）、左心室舒張末期后壁厚度（left ven?tricular posterior wall thicknessatend-diastole，LVPWd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimeter at end-systole，LVIDs）和左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimeter at end-diastole，LVIDd）。心臟舒張功能檢測指標(biāo)包括：舒張早期與心房收縮期二尖瓣峰值速度比值（mitral peak velocity ratio of early-diastolic filling to atrial contraction，E/A）和舒張早期與心房收縮期二尖瓣環(huán)峰值速度比值（mitral annular peak velocity ratio of early-diastolic filling to atrial contraction，E'/A'）。

3.4 口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT） DCM造模實驗結(jié)束后進行小鼠OGTT：小鼠禁食禁水5 h后尾靜脈采血檢測空腹血糖濃度，隨后按照2 g/kg劑量經(jīng)口灌胃葡萄糖溶液并于灌胃后15、30、60、90和120 min后尾靜脈采血檢測血糖濃度，計算血糖-時間曲線下面積（area under curve，AUC）。計算公式：AUC0-120=［15×（glucose0+glucose15）+15×（glucose15+glucose30）+30×（glucose30+glucose60）+30×（glucose60+glucose90）+30×（glucose90+glucose120）］/2。

3.5 RT-qPCR檢測心肌組織的mRNA表達(dá) 取50 mg液氮凍存心臟組織，通過組織研磨儀粉碎后，按照試劑盒說明書提取總RNA，使用紫外分光光度計在260 nm波長下定量檢測RNA的A值。按照Evo M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：42℃2 min、37℃15 min、85℃5 s。取100 ng cDNA為模板，使用SYBRGreen Pro Taq HS試劑盒，用qPCR儀擴增密，條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 s，40個循環(huán)。擴增后收集熒光信號并獲得Ct值。內(nèi)參照為GAPDH。采用2?ΔΔCt法（ΔCt=Ct目的基因?CtGAPDH；ΔΔCt=ΔCt實驗組?ΔCt對照組）計算目的基因的mRNA相對表達(dá)水平。

3.6 Western blot檢測心肌組織的蛋白水平 取適量液氮凍存的心臟組織，每10 mg組織加入100μL含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液后使用組織研磨儀勻漿，冰上裂解30 min后于4℃、12 000 r/min離心20 min并取其上清液。采用BCA蛋白濃度測定法定量檢測蛋白濃度后加入5×SDS上樣緩沖液于95℃變性15 min制備蛋白樣品。使用12%SDS-PAGE分離蛋白，取30~60μg總蛋白上樣后在恒壓100 V下電泳2 h，恒流250 mA濕法轉(zhuǎn)膜2 h后用5%脫脂牛奶封閉1 h。洗膜后與所需I抗4℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次后加入對應(yīng)II抗室溫孵育2 h，洗膜后使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并于凝膠呈像系統(tǒng)中曝光成像。采用ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度值定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參照計算目的蛋白的相對水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示并使用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件進行分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較選擇Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 n-3 PUFAs對DCM小鼠血糖和體重的影響

根據(jù)PCR和瓊脂糖凝膠電泳條帶結(jié)果鑒定小鼠基因型，其中在427 bp處有單一特異的電泳條帶為Fat-1+/+小鼠，WT小鼠則無此明顯條帶，見圖1A。選取雄性Fat-1+/+小鼠用于DCM造模。DCM造模2周后，F(xiàn)at-1+/+和WT兩組小鼠空腹血糖濃度較造模前均顯著升高，于造模后第4周達(dá)到峰值，且伴隨體重逐漸減輕（P<0.05），見圖1B、C。造模后小鼠血糖和體重的變化符合糖尿病特點。DCM造模20周Fat-1+/+組血糖顯著低于WT組且體重顯著升高（P<0.01），見圖1D、E，表明Fat-1+/+小鼠經(jīng)DCM造模后的血糖和體重較WT小鼠有所改善。此外，DCM造模結(jié)束后，進行OGTT并計算AUC。OGTT結(jié)果顯示，DCM造模后WT和Fat-1+/+小鼠糖耐量曲線均異常升高，在15、30、60、90和120 min時點的血糖水平和血糖AUC均高于造模前（P<0.01），見圖1F，表明造模后兩組小鼠糖耐量受損；DCM組Fat-1+/+小鼠血糖AUC顯著小于WT小鼠（P<0.01），見圖1G，說明Fat-1+/+小鼠葡萄糖耐量較WT組得到有效改善，即n-3 PUFAs具有顯著改善DCM小鼠糖耐量的作用。

Figure 1.Effect of n-3 PUFAs on blood glucose and body weight in DCM mice.A：identification of Fat-1 gene by agarose gel electro?phoresis；B：blood glucose；C：body weight；D：blood glucose at 20 weeks；E：body weight at 20 weeks；F：oral glucose tolerance test（OGTT）；G：analysis of the areas under OGTTcurves.Mean±SEM.n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs WTgroup；#P<0.05，##P<0.01 vs Fat-1+/+group；&P<0.05，&&P<0.01 vs WT+DCM group.圖1 n-3 PUFAs對DCM小鼠血糖和體重的影響

2 n-3 PUFAs改善DCM小鼠左心室收縮功能

M-Mode超聲結(jié)果顯示，在造模第10周，DCM組小鼠的LVEF和LVFS較造模前顯著降低（P<0.01）并且兩者在造模后第10~20周呈時間依賴性下降，見圖2A、B。此外，在造模后第20周LVAWs、LVAWd、LVPWs和LVPWd較造模前均顯著減低，但LVIDs和LVIDd顯著升高（P<0.05），見圖2C~H，初步表明DCM造模后小鼠左心室腔增大且室壁變薄，并伴有心臟收縮功能受損。DCM造模20周后Fat-1+/+小鼠LVEF、LVFS、LVAWs、LVPWs和LVPWd均顯著高于WT小鼠（P<0.05），見圖2A~F，并且LVIDs和LVIDd顯著低于WT小鼠（P<0.05），見圖2G~I，表明DCM造模后Fat-1+/+小鼠的左心室收縮功能較WT小鼠得到有效改善，即n-3 PUFAs能顯著改善DCM小鼠的左心室收縮功能。

Figure 2.n-3 PUFAs improved left ventricular systolic function in DCM mice.A：left ventricular ejection fraction（LVEF）；B：left ventricular fraction shortening（LVFS）；C and D：left ventricular anterior wall thickness at end-systole and end-diastole（LVAWs and LVAWd）；E and F：left ventricular posterior wall thickness at end-systole and end-diastole（LVPWs and LVPWd）；Gand H：left ventricular internal diameter at end-systole and end-diastole（LVIDs and LVIDd）；I：representa?tive M-mode images.Mean±SEM.n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs Fat-1+/+group；&P<0.05，&&P<0.01 vs WT+DCMgroup.圖2 n-3 PUFAs改善DCM小鼠左心室收縮功能

3 n-3 PUFAs改善DCM小鼠左心室舒張功能

彩色多普勒和組織多普勒檢測結(jié)果表明，在造模第14周，DCM組小鼠的E/A和E'/A'較造模前顯著下降（P<0.05）；DCM組中Fat-1+/+小鼠在造模14、16、18和20周的E/A和E'/A'均顯著高于WT小鼠（P<0.05），見圖3。這一結(jié)果表明經(jīng)DCM造模后小鼠左心室舒張功能受損，但DCM造模后Fat-1+/+小鼠的左心室舒張功能較WT小鼠得到有效改善，即說明n-3 PUFAs能顯著改善DCM小鼠左心舒張功能。

Figure 3.n-3 PUFAs improved left ventricular diastolic function in DCM mice.A：mitral peak velocity ratio of early-diastolic filling to atrial contraction（E/A）；B：mitral annular peak velocity ratio of early-diastolic filling to atrial contraction（E'/A'）；C and D：representative pulsed-wave and tissue Doppler mode waveform images.Mean±SEM.n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs WTgroup；#P<0.05，##P<0.01 vs Fat-1+/+group；&P<0.05，&&P<0.01 vs WT+DCMgroup.圖3 n-3 PUFAs改善DCM小鼠左心室舒張功能

4 n-3 PUFAs抑制DCM小鼠心肌凋亡和纖維化相關(guān)分子的表達(dá)

DCM造模結(jié)束后使用Western blot和RT-qPCR分別檢測心肌組織中凋亡凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3和促纖維化蛋白TGF-β的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，DCM造模組小鼠心肌組織中cleaved cas?pase-3和TGF-β蛋白水平較造模前均顯著上升（P<0.01）；此外，經(jīng)DCM造模后Fat-1+/+組與WT組相比，cleaved caspase-3和TGF-β蛋白水平均顯著下降（P<0.01），見圖4A。RT-qPCR結(jié)果趨勢與Western blot結(jié)果一致，caspase-3和TGF-β的mRNA水平在DCM造模后的Fat-1+/+組中較WT組顯著下降（P<0.01），見圖4D。以上結(jié)果表明DCM造模后Fat-1+/+小鼠心肌組織凋亡和纖維化程度較WT組顯著減輕，即n-3PUFAs能有效抑制DCM小鼠心肌凋亡和纖維化相 關(guān)分子的表達(dá)。

Figure 4.n-3 PUFAs attenuated the expression of cardiac apoptosis-and fibrosis-related molecules in DCM mice.A：Western blot for determining the protein levels of cleaved caspase-3 and TGF-βin heart tissues；B：RT-qPCR analysis of the mRNA levels of caspase-3 and TGF-βin heart tissues.Mean±SEM.n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs Fat-1+/+group；&P<0.05，&&P<0.01 vs WT+DCM group.圖4 n-3 PUFAs抑制DCM小鼠心肌細(xì)胞凋亡與纖維化相關(guān)分子的表達(dá)

5 n-3 PUFAs抑制DCM小鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體的活化

Western blot結(jié)果顯示，DCM造模組的心肌組織中炎癥小體相關(guān)分子NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平較造模前均顯著上升（P<0.01）；但以上蛋白水平在DCM造模后的Fat-1+/+組中較WT組均顯著下降（P<0.05），見圖5A。RT-qPCR結(jié)果顯示，DCM組中炎癥小體相關(guān)分子NLRP3、ASC、cas?pase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1和IL-6的mRNA表達(dá)水平較造模前均顯著上升（P<0.05）；但上述mRNA表達(dá)水平在DCM造模后的Fat-1+/+組中較WT組均顯著下降（P<0.05），見圖5B。以上結(jié)果表明DCM造模后Fat-1+/+小鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體及其相關(guān)炎癥因子水平較WT小鼠顯著下降，即n-3 PUFAs能有效抑制DCM小鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體及炎癥因子的轉(zhuǎn)錄激活。

討 論

DCM主要表現(xiàn)為在長期高血糖狀態(tài)下所引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡與纖維化等心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生的特異性改變，最終導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙［16］。研究表明，多種危險因素引起DCM的發(fā)生和發(fā)展，其中糖尿病后出現(xiàn)的糖代謝紊亂是DCM的主要致病因素，機體的持續(xù)高血糖狀態(tài)會誘發(fā)心肌凋亡、纖維化和炎癥等心肌損傷和心臟重構(gòu)，最終導(dǎo)致左心室功能受損［17-18］。研究表明，n-3 PUFAs具有改善血糖和血脂、抗氧化和抗炎等多種作用并能顯著改善代謝性疾病［19］；而Fat-1基因產(chǎn)物能將內(nèi)源性的n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs，在Fat-1+/+小鼠的1型糖尿病模型中，n-3 PUFAs能夠通過保護胰島β細(xì)胞而降低血糖，從而改善糖尿病癥狀［20］。本實驗表明在Fat-1+/+小鼠的DCM模型中，n-3 PUFAs對DCM小鼠心臟具有保護作用；主要表現(xiàn)為顯著抑制DCM造模所致的血糖升高和口服糖耐量受損，改善左心室收縮及舒張功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡、纖維化及NLRP3炎癥小體激活，從而減輕心肌損傷。

研究報道，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌病變以心肌纖維化為主，由于持續(xù)的高血糖導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原蛋白逐漸堆積，纖維化程度不斷加深，心室壁僵硬度增加，舒張期順應(yīng)性下降，導(dǎo)致心肌舒張功能受損。此外，持續(xù)的高血糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞代謝紊亂，隨著疾病的進展會逐漸出現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷、凋亡和壞死及心臟重構(gòu)并最終導(dǎo)致左心室收縮功能障礙［21-22］。本實驗采用腹腔注射STZ配合45%HFD喂養(yǎng)進行DCM造模，在造模20周后，DCM組小鼠E/A和E'/A'均顯著下降，提示左心室弛張性和順應(yīng)性受損導(dǎo)致舒張功能降低。此外，DCM組小鼠LVEF和LVFS顯著下降，LVAWs、LVAWd、LVPWs和LVPWd顯著下降但LVIDd顯著上升，提示DCM造模后左心室室壁變薄而且室腔變大引起左心收縮功能下降與心臟重構(gòu)，表明DCM造模20周后小鼠符合DCM特征。DCM造模后，與WT小鼠相比，F(xiàn)at-1+/+小鼠血糖升高和口服糖耐量受損顯著減輕，E/A、E'/A'、LVEF和LVFS增加，表明n-3 PUFAs顯著改善糖代謝水平和左心舒張及收縮功能并抑制心臟重構(gòu)。

Figure 5.n-3 PUFAs inhibited activation of NLRP3 inflammasome and related cytokines in DCM mice.A：Western blot for deter?mining the protein levels of NLRP3，ASC，procaspase-1，caspase-1，pro-IL-1β，IL-1βand IL-18 in heart tissues；B：RT-qPCR analysis of the mRNA levels of NLRP3，ASC，caspase-1，IL-1β，IL-18，TNF-α，MCP-1 and IL-6 in heart tissues.Mean±SEM.n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs Fat-1+/+group；&P<0.05，&&P<0.01 vs WT+DCM group.圖5 n-3 PUFAs抑制DCM小鼠心肌細(xì)胞炎癥小體及炎癥因子活化

DCM在長期高血糖狀態(tài)下早期產(chǎn)生適應(yīng)性心肌重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌肥大、纖維組織增生、心肌細(xì)胞炎癥和心肌凋亡等，隨著病情發(fā)展心臟逐漸進入失代償期，心臟重構(gòu)加劇，最終發(fā)展為心力衰竭［23］。因此，心肌細(xì)胞凋亡和纖維化是心肌損傷和心臟重構(gòu)的重要標(biāo)志，也是衡量DCM進程的一個重要指標(biāo)［24］。本實驗檢測了DCM造模后心肌組織中cas?pase-3和TGF-β的mRNA和蛋白水平，結(jié)果表明DCM造模后caspase-3和TGF-β的mRNA水平，以及cleaved caspase-3和TGF-β的蛋白水平均顯著上升，說明通過DCM造模后心臟出現(xiàn)凋亡和纖維化等心肌重構(gòu)的特征，提示本實驗中DCM造模成功且采用的造模方法有效可行。此外，經(jīng)DCM造模后Fat-1+/+小鼠心肌組織中cleaved caspase-3和TGF-β的蛋白水平顯著下降，說明n-3 PUFAs可顯著抑制DCM所引起的心肌細(xì)胞凋亡與纖維化；RT-qPCR結(jié)果與Western blot檢測結(jié)果一致，也進一步證實n-3 PUFAs有效改善心肌凋亡和纖維化的心臟保護作用。

炎癥小體是一種分布于細(xì)胞漿中的多蛋白復(fù)合物，在機體的免疫炎癥反應(yīng)中具有重要作用。已有研究報道，NLRP3炎癥小體在DCM的炎癥發(fā)展和心肌重構(gòu)中起著關(guān)鍵的作用［25］。NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和procaspase-1組成，當(dāng)受到外界信號刺激時，NLRP3與接頭蛋白ASC結(jié)合，招募并激活procaspase-1，激活后生成的caspase-1介導(dǎo)IL-1β前體和IL-18前體切割活化為IL-1β和IL-18，從而引起下游的炎癥反應(yīng)［26-28］。在DCM小鼠中，心肌組織受損并通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxy?gen species，ROS），隨著ROS不斷積累激活NLRP3炎癥小體及下游的炎癥因子從而加速心肌纖維化和心臟重構(gòu)［29］。為探究n-3 PUFAs改善DCM的機制是否與NLRP3炎癥小體及其相關(guān)炎癥因子有關(guān)，本課題通過RT-qPCR和Western blot檢測DCM造模前后各組小鼠心肌組織中NLRP3及其炎癥因子的mRNA和蛋白水平。在DCM造模20周后，炎癥相關(guān)基因NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白水平較造模前均顯著上升，提示DCM造模后NL?RP3通路被激活并參與調(diào)控DCM的炎癥發(fā)展和心肌重構(gòu)。但是，DCM造模后的Fat-1+/+組與WT組相比，NLRP3相關(guān)分子及炎癥因子的表達(dá)水平均顯著下降，提示Fat-1+/+小鼠心肌組織中NLRP3相關(guān)炎癥因子通路被顯著抑制，即說明n-3 PUFAs能有效抑制DCM所致的NLRP3炎癥小體及炎癥因子的轉(zhuǎn)錄激活，從而改善DCM。

綜上所述，本研究表明在小鼠DCM體內(nèi)動物實驗中，n-3 PUFAs可顯著抑制DCM造模所致的血糖升高、體重減輕和口服糖耐量受損，并改善左心收縮及舒張功能，抑制心臟重構(gòu)和心肌損傷，其作用可能通過減輕心肌細(xì)胞凋亡和纖維化，并抑制NLRP3炎癥小體及相關(guān)炎癥因子激活，從而減輕心肌損傷。雖然n-3 PUFAs對DCM的具體機制及臨床應(yīng)用的可行性還有待進一步探究，但本課題為DCM的科學(xué)研究和臨床防治提供實驗基礎(chǔ)與新的思路。