基于單巰基β-環(huán)糊精修飾的納米金比色法檢測(cè)水中的芘*

向 霄 鄭博文 李佳男 聶宏宇 邢海波 黃波濤#

(1.上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 200233；2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418)

隨著煤、石油在工業(yè)生產(chǎn)、交通運(yùn)輸以及日常生活中的廣泛應(yīng)用，不斷產(chǎn)生的多環(huán)芳烴(PAHs)嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。PAHs是一類含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的芳烴化合物，包括蒽、芘、苯并芘等[2]，已被列為典型的持久性有機(jī)污染物，其中大多數(shù)都為致癌物和致畸物[3-4]。在PAHs污染危險(xiǎn)日益嚴(yán)重的情況下，對(duì)環(huán)境中PAHs進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確測(cè)定有助于環(huán)境的修復(fù)與保護(hù)，使公民免受污染的威脅。

目前對(duì)PAHs的檢測(cè)方法有質(zhì)譜、色譜分析法[5-7]，酶聯(lián)免疫吸附法[8]，表面增強(qiáng)拉曼光譜法[9]等，上述方法雖然成熟穩(wěn)定，但基本都需要大型儀器，檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，開(kāi)展環(huán)境中PAHs快速篩查，建立高效、快速、簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，對(duì)保護(hù)環(huán)境、保護(hù)公民健康具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

納米金(AuNPs)因其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)備受廣大研究者的青睞，其水溶液的具體顏色與金粒子間的間隔有關(guān)，當(dāng)金粒子發(fā)生團(tuán)聚，粒子間的間距變小時(shí)，水溶液會(huì)由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。目前，利用AuNPs比色法開(kāi)發(fā)的生物傳感器一般是利用未經(jīng)修飾的AuNPs溶液，在強(qiáng)電解質(zhì)的直接作用下，使AuNPs表面電荷發(fā)生變化，產(chǎn)生聚集，從而引起顏色變化；也有的是用適配體等功能性基團(tuán)通過(guò)共價(jià)作用修飾到AuNPs表面，當(dāng)修飾在表面的功能基團(tuán)和待測(cè)物特異性結(jié)合時(shí)，會(huì)改變AuNPs顆粒之間的距離，從而引起AuNPs聚集并產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色變化。利用這種性質(zhì)可以設(shè)計(jì)出多種檢測(cè)探針，例如使用氨基酸修飾AuNPs檢測(cè)卡那霉素[10]，利用核酸適配體修飾AuNPs檢測(cè)三聚氰胺[11]等。

β-環(huán)糊精作為大分子物質(zhì)，擁有一個(gè)空腔結(jié)構(gòu)，對(duì)一些大小適中的分子具有識(shí)別作用，因此成為近些年的研究熱點(diǎn)[12-15]。通過(guò)修飾β-環(huán)糊精外沿可以使其與納米粒子結(jié)合，用來(lái)檢測(cè)PAHs[16-18]。

本研究基于單巰基β-環(huán)糊精(以下簡(jiǎn)稱β-環(huán)糊精)、AuNPs、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、H2O2設(shè)計(jì)出了一種新型快速傳感器，用來(lái)檢測(cè)水中的代表性PAHs之一——芘。將AuNPs與β-環(huán)糊精結(jié)合，β-環(huán)糊精對(duì)PAHs具有分子識(shí)別作用，會(huì)使PAHs嵌入其疏水空腔中[19-21]。當(dāng)體系中存在TMB/H2O2時(shí)，會(huì)拉近β-環(huán)糊精腔體間的距離從而使AuNPs發(fā)生聚集。通過(guò)肉眼可觀察到體系顏色的變化，能達(dá)到定性檢測(cè)水中芘的目的。之后可以進(jìn)一步借助紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水中芘的定量分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所使用的主要儀器如下：臺(tái)式離心機(jī)(TD5M-WS)；恒溫振蕩器(THZ-98C)；pH計(jì)(PB-10)；電子天平(BSA224S)；超聲波清洗器(KS-7200E)；紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-3500)。

1.2 試 劑

β-環(huán)糊精、TMB、KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2、檸檬酸三鈉、四氯金酸、H2O2均為分析純。所有試劑和緩沖溶液均用超純水(電阻率18 MΩ·cm)配置，實(shí)驗(yàn)中所用實(shí)際水樣來(lái)自海灣旅游區(qū)相關(guān)河道。

1.3 β-環(huán)糊精修飾AuNPs的制備

AuNPs的制備：燒杯中加入98 mL超純水和1 mL四氯金酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)加熱攪拌至微沸再加1 mL檸檬酸三鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)，溶液顏色變?yōu)樽霞t色后繼續(xù)加熱10 min，停止加熱并冷卻至室溫保存。

β-環(huán)糊精修飾AuNPs的制備過(guò)程參考文獻(xiàn)[11]，將制備好的AuNPs和β-環(huán)糊精(1 μmol/L)以體積比1∶1混合攪拌12 h后保存。

1.4 吸收曲線

配置7組混合液，在400～800 nm波長(zhǎng)下掃描，繪制吸收曲線，并記錄下溶液顏色的變化。7組混合液均以AuNPs為基質(zhì)，再添加下列系列混合液?；旌弦?為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、0.8 mol/L H2O2；混合液2為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、0.3 μmol/L TMB；混合液3為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、0.8 mol/L H2O2、0.3 μmol/L TMB；混合液4為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、0.8 mol/L H2O2、50 μmol/L芘；混合液5為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、0.3 μmol/L TMB、50 μmol/L芘；混合液6為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、0.8mol/L H2O2、0.3 μmol/L TMB、50 μmol/L芘；混合液7為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、50 μmol/L芘。

1.5 β-環(huán)糊精修飾的AuNPs的透射電鏡掃描

將上述7組樣品送往上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行透射電鏡(Tecnai G2 Spirit BioTWIN)掃描，進(jìn)一步完成檢測(cè)體系的表征。

1.6 檢測(cè)體系的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

分別設(shè)定β-環(huán)糊精梯度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L，TMB梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，H2O2梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L，以優(yōu)化檢測(cè)體系。除實(shí)驗(yàn)變量外，固定β-環(huán)糊精為0.5 μmol/L，TMB為0.5 μmmol/L，H2O2為1.0 mol/L，芘為50 μmol/L，反應(yīng)時(shí)間為10 min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定680 nm處吸光度。

1.7 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

為研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)β-環(huán)糊精/AuNPs、TMB/H2O2和芘之間相互作用的影響，選擇了0、20、100 μmol/L的芘與檢測(cè)體系混合，反應(yīng)時(shí)間分別為0、5、10、15、20、25、30 min后測(cè)定680 nm處吸光度。

1.8 水中常見(jiàn)離子的影響實(shí)驗(yàn)

為了研究水中常見(jiàn)的金屬離子對(duì)檢測(cè)體系的影響，在待測(cè)溶液中分別加入摩爾濃度為1 mmol/L的CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl，并設(shè)定芘為100 μmol/L，反應(yīng)10 min，測(cè)定680 nm處吸光度。

1.9 檢測(cè)方法靈敏度實(shí)驗(yàn)

配置一系列已知摩爾濃度的芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中芘分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L，反應(yīng)10 min后，測(cè)定680 nm處吸光度，以摩爾濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.10 實(shí)際水樣的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)及與傳統(tǒng)方法的比較

在實(shí)際水樣中分別添加10.0、20.0、50.0、100.0 μmol/L芘，采用此檢測(cè)方法和氣相色譜—質(zhì)譜(GC/MS)分別測(cè)定其加標(biāo)回收率，進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-環(huán)糊精修飾的AuNPs檢測(cè)水中芘的原理

AuNPs溶液的顏色反映了其顆粒的聚集狀況，這種聚集一般是受溶液中電解質(zhì)的影響[22]。分散態(tài)的AuNPs顆粒表面會(huì)發(fā)生等離子體共振，從而在520 nm處有最大吸收峰，此時(shí)溶液呈紅色。而AuNPs顆粒呈聚集狀態(tài)時(shí)，粒徑較大，AuNPs粒子之間的表面等離子體共振作用降低了電子激發(fā)所需要的能量，從而使AuNPs溶液的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)，體系顏色變?yōu)樗{(lán)色[23]。

鑒于此，實(shí)驗(yàn)從修飾AuNPs開(kāi)始，將β-環(huán)糊精連接到AuNPs表面。如圖1所示，β-環(huán)糊精二級(jí)空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)碗狀，內(nèi)部有一個(gè)較大的空腔，體系中的芘可以嵌入到空腔中，形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。AuNPs首先與β-環(huán)糊精結(jié)合；由于β-環(huán)糊精對(duì)芘的分子識(shí)別作用，芘嵌入其疏水空腔中；當(dāng)體系中存在TMB/H2O2時(shí)，會(huì)拉近β-環(huán)糊精腔體間的距離從而使AuNPs發(fā)生聚集，體系顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。

圖1 β-環(huán)糊精修飾的AuNPs檢測(cè)水中芘的原理示意圖Fig.1 Schematic description for pyrene detection by the β-cyclodextrin modified AuNPs

2.2 檢測(cè)體系的吸收曲線

首先對(duì)顯色情況進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用β-環(huán)糊精修飾AuNPs的基礎(chǔ)上，無(wú)論β-環(huán)糊精單獨(dú)與H2O2、TMB共存，還是催化TMB/H2O2的反應(yīng)(混合液1～3)，都沒(méi)有明顯的顯色反應(yīng)，溶液還是呈現(xiàn)出β-環(huán)糊精修飾的AuNPs的混合液4～6分別在混合液1～3的基礎(chǔ)上加入了芘?；旌弦?顏色發(fā)生明顯變化，長(zhǎng)波區(qū)域的吸光度增加，AuNPs顆粒產(chǎn)生了一定程度的聚集?；旌弦?作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在體系中沒(méi)有H2O2和TMB，只有芘存在的情況下，顏色也沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。因此，可以通過(guò)使用加入了H2O2、TMB和β-環(huán)糊精修飾的AuNPs來(lái)達(dá)到檢測(cè)水溶液中芘的目的。

圖2 檢測(cè)體系的吸收曲線Fig.2 Absorption curve of detection system

本來(lái)顏色?？赡苁且?yàn)棣?環(huán)糊精修飾的AuNPs失去了原本的催化活性，無(wú)法正常催化TMB/H2O2的顯色反應(yīng)。

2.3 β-環(huán)糊精修飾的AuNPs的透射電鏡掃描結(jié)果

通過(guò)透射電鏡對(duì)不同樣品進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同處理下β-環(huán)糊精修飾的AuNPs的透射電鏡掃描圖Fig.3 Transmission electron microscope images of different β-cyclodextrin-modified AuNPs

當(dāng)溶液中不含有芘時(shí)，β-環(huán)糊精修飾的AuNPs是規(guī)則的球形，并均勻分布在溶液中，H2O2和TMB的存在并沒(méi)有影響β-環(huán)糊精修飾的AuNPs形態(tài)。

混合液4～7中有芘的加入，也沒(méi)有使得體系中β-環(huán)糊精修飾的AuNPs發(fā)生明顯的變化。連在AuNPs表面的β-環(huán)糊精中可能已經(jīng)嵌入了芘，但是β-環(huán)糊精修飾的AuNPs之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有明顯的相互作用。

當(dāng)檢測(cè)體系中H2O2和TMB同時(shí)存在時(shí)，芘的加入使得β-環(huán)糊精修飾的AuNPs發(fā)生了明顯的聚集現(xiàn)象。進(jìn)一步證明當(dāng)體系中存在TMB/H2O2時(shí)，會(huì)拉近β-環(huán)糊精腔體間的距離使AuNPs發(fā)生聚集，從而使溶液的顏色也由紅色變?yōu)樗{(lán)色。

2.4 β-環(huán)糊精濃度的優(yōu)化結(jié)果

檢測(cè)體系中β-環(huán)糊精的濃度影響著傳感器的穩(wěn)定性。β-環(huán)糊精通過(guò)巰基連在AuNPs的表面，其濃度對(duì)靈敏度有著較大影響，因此需要對(duì)β-環(huán)糊精的濃度進(jìn)行優(yōu)化。由圖4可以看出，在β-環(huán)糊精為0.5 μmol/L時(shí)，檢測(cè)體系的吸光度最大，而過(guò)量的β-環(huán)糊精可能會(huì)對(duì)AuNPs正常的聚合產(chǎn)生阻礙作用，所以選擇0.5 μmol/L為β-環(huán)糊精最適摩爾濃度。

圖4 β-環(huán)糊精對(duì)檢測(cè)體系的影響Fig.4 Effect of β-cyclodextrin on detection system

2.5 TMB濃度的優(yōu)化結(jié)果

TMB作為一種顯色劑，會(huì)在強(qiáng)氧化劑的作用下發(fā)生顏色的變化。檢測(cè)體系中H2O2的存在可能會(huì)引起TMB顏色的變化，從而影響整個(gè)檢測(cè)體系顏色的變化。正是因?yàn)轶w系中TMB的濃度對(duì)反應(yīng)最終顏色有較大影響，因此需要對(duì)其進(jìn)行濃度優(yōu)化。由圖5可以看出，TMB低于0.3 μmol/L時(shí)，吸光度呈上升趨勢(shì)；TMB超過(guò)0.3 μmol/L后，吸光度較為穩(wěn)定。因此，選擇0.3 μmol/L為T(mén)MB最適摩爾濃度。

圖5 TMB對(duì)檢測(cè)體系的影響Fig.5 Effect of TMB on detection system

2.6 H2O2濃度的優(yōu)化結(jié)果

檢測(cè)體系中H2O2的濃度對(duì)反應(yīng)最終顏色也有較大影響，因此需要對(duì)其進(jìn)行濃度優(yōu)化。由圖6可以看出，H2O2為0.8 mol/L時(shí)吸光度最大，且高于0.8 mol/L后吸光度略有下降，因此選擇0.8 mol/L為H2O2最適摩爾濃度。

圖6 H2O2對(duì)檢測(cè)體系的影響Fig.6 Effect of H2O2 on detection system

2.7 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

制備好的AuNPs溶液放置過(guò)久，可能會(huì)發(fā)生沉降；且檢測(cè)體系若需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，也無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求。所以，考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)體系的影響。

通過(guò)圖7可以發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)最初的10 min，吸光度隨著時(shí)間延長(zhǎng)增幅較大；反應(yīng)時(shí)間超過(guò)10 min后，吸光度基本上不再增長(zhǎng)且很快達(dá)到平衡。這說(shuō)明在H2O2和TMB的作用下，β-環(huán)糊精空腔內(nèi)嵌入芘的AuNPs已經(jīng)全部產(chǎn)生聚集，溶液顏色也不會(huì)繼續(xù)改變。綜上所述，選擇10 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)體系的影響Fig.7 Effect of reaction time on detection system

2.8 水中常見(jiàn)離子的影響

離子強(qiáng)度可能對(duì)AuNPs的聚集情況產(chǎn)生一定影響，所以考察了水中常見(jiàn)的金屬離子對(duì)檢測(cè)體系的影響。由圖8可以看出，在溶液中存在Ca2+、Mg2+、Na+、K+這些離子的情況下，吸光度并沒(méi)有明顯的變化。所以離子強(qiáng)度對(duì)該檢測(cè)體系的結(jié)果幾乎沒(méi)有影響。

圖8 常見(jiàn)離子對(duì)檢測(cè)體系的影響Fig.8 Effect of ions on detection system

2.9 檢測(cè)方法靈敏度

配置一系列已知濃度的芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得的吸光度在低濃度和高濃度范圍內(nèi)變化趨勢(shì)不太一致，所以分別繪制低濃度和高濃度芘標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖9。芘處于低濃度與高濃度時(shí)，均與吸光度呈良好的線性關(guān)系。使用分光光度計(jì)檢測(cè)的檢測(cè)限為3.4 μmol/L。

圖9 檢測(cè)方法的靈敏度Fig.9 Sensitivity of the detection method

2.10 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可見(jiàn)，此檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率為96%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差絕對(duì)值小于5%。同時(shí)用GC/MS平行測(cè)定相同樣品3次，測(cè)得的加標(biāo)回收率介于98%～110%。經(jīng)過(guò)對(duì)比可說(shuō)明該方法用于快速檢測(cè)水中芘是可行的。

表1 本檢測(cè)方法和GC/MS分別檢測(cè)水中芘

3 結(jié) 語(yǔ)

以水中芘作為檢測(cè)目標(biāo)，將β-環(huán)糊精修飾到AuNPs表面，選取TMB、H2O2作為聚合劑，建立了一種簡(jiǎn)單、高效、快速檢測(cè)水中芘的新方法。其原理是TMB、H2O2的存在改變了AuNPs在芘嵌入β-環(huán)糊精空腔后的距離，使得AuNPs顆粒產(chǎn)生聚集。隨著反應(yīng)的發(fā)生，AuNPs溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，吸收曲線和特征吸收峰的吸光度也隨之發(fā)生了改變。

此檢測(cè)體系最適條件分別為0.5 μmol/L β-環(huán)糊精、0.3 μmol/L TMB、0.8mol/L H2O2，最佳反應(yīng)時(shí)間10 min。使用分光光度計(jì)檢測(cè)的檢測(cè)限為3.4 μmol/L。在實(shí)際水樣的檢測(cè)中，芘的加標(biāo)回收率為96%～106%，可以滿足實(shí)際水樣中芘的精確檢測(cè)要求。