響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提高上部煙葉可用性的研究

楊 波，沈 嘉，楊繼福，舒俊生，張福建，王紹林，陳 軍，馬 松

（1. 安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，安徽 合肥 230088；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，安徽 合肥 2300312；3. 華環(huán)國(guó)際煙草有限公司，安徽 滁州 233121）

煙葉可用性是評(píng)價(jià)煙葉原料在卷煙配方中是否好用的一種指標(biāo)。我國(guó)大部分煙區(qū)上部煙葉可用性的現(xiàn)狀既提高了卷煙制造成本，又限制了卷煙質(zhì)量水平。近年來(lái)，圍繞提高煙葉上部葉可用性的研究主要在煙草農(nóng)業(yè)方面開展，從品種[1-2]、生態(tài)條件[3-6]、栽培技術(shù)[7-10]、成熟度[11-13]、烘烤調(diào)制[14-15]等方面進(jìn)行了大量的研究，但上部煙葉普遍存在的結(jié)構(gòu)致密、內(nèi)在化學(xué)成分不協(xié)調(diào)、勁頭大、刺激性強(qiáng)、工業(yè)可用性不高等問題尚未完全解決，伴隨著我國(guó)卷煙結(jié)構(gòu)持續(xù)提升，上部煙葉大量積壓庫(kù)存，如何從工業(yè)角度提高上部煙葉可用性已經(jīng)成為緩解煙葉等級(jí)結(jié)構(gòu)矛盾，降低工業(yè)庫(kù)存的必由之路。

目前，運(yùn)用生物技術(shù)提高煙葉可用性已成為研究熱點(diǎn)。生物技術(shù)包括微生物技術(shù)和生物酶技術(shù)，微生物技術(shù)主要是在煙葉醇化過程中添加微生物提高煙草品質(zhì)，但由于對(duì)微生物發(fā)酵的本質(zhì)缺乏深入的基礎(chǔ)研究，加之生產(chǎn)工藝的限制，微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于煙草的品質(zhì)改良還處于試驗(yàn)研究階段，與實(shí)際應(yīng)用尚有距離。生物酶技術(shù)主要是在煙葉中添加外源酶降低煙草中纖維素、淀粉、果膠等成分含量，協(xié)調(diào)煙葉中各種成分，從而改善煙葉品質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)生物酶開展了大量研究。BABLER S[16]研究發(fā)現(xiàn)在煙葉中施加蛋白酶能降解煙葉中的蛋白質(zhì)并產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的氨基酸，煙葉的香氣顯著提高。姚光明[17]研究發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶對(duì)煙葉中蛋白質(zhì)的降解作用最為明顯，煙葉的燃吸質(zhì)量得到明顯改善，對(duì)雜氣和苦辣味的消除效果尤為明顯。王繼蓮等[18]用細(xì)菌酶制劑處理煙葉，蛋白酶降解18.64%，氨基酸增加12.72%，同時(shí)香氣成分不同程度增加。李曉等[19]、閆克玉等[20]研究表明，淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和果膠酶對(duì)提升煙葉香氣和甜度，改善余味，降低刺激性、枯焦氣等方面效果顯著。謝會(huì)雅等[21]、李小斌等[22]用復(fù)合酶液處理煙葉，發(fā)現(xiàn)其對(duì)降解烤煙蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等單一中性酶。石志發(fā)等[23]用功能潛香劑、風(fēng)味蛋白酶、糖化酶組合處理上部煙葉效果明顯，煙葉淀粉、蛋白質(zhì)含量降低，總糖、還原糖含量上升，致香成分增加。楊慶等[24]將糖化酶、纖維素酶、過氧化氫酶、淀粉酶等多種酶液按一定比例復(fù)配，添加的煙葉醇化后，煙葉總糖、還原糖、總植物堿、總氮、淀粉和蛋白質(zhì)含量降低，致香成分總量增加，感官評(píng)吸青雜氣減弱，舒適性變好。許春平等[25]用復(fù)合酶處理低次煙葉，煙葉總糖含量增加57.23%，蛋白質(zhì)和總氮含量降低，施木克值增加，雜環(huán)類化合物、酮類和酸類增加，煙堿含量降低，煙葉刺激性減少，煙香改善，余味增加。

綜合來(lái)看，生物酶制劑可以改善煙葉品質(zhì)，提高香氣，減少雜氣等不良?xì)庀?，提高舒適性。生物酶制劑的使用無(wú)疑為工業(yè)企業(yè)提高上部煙葉可用性提供了一條切實(shí)可行的路徑。筆者針對(duì)工業(yè)企業(yè)上部煙葉難使用的現(xiàn)狀，以皖南B3F等級(jí)煙葉為研究原料，圍繞上部煙葉普遍存在的質(zhì)量缺陷，借鑒前人的研究成果，針對(duì)性的選擇生物酶制劑，通過不同生物酶制劑的篩選和復(fù)合酶制劑的優(yōu)化，為上部煙葉可用性的提高提供理論參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.2 酶使用煙堿脫氫酶、脂氧合酶、蛋白酶、酸性木聚糖酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶共5種不同酶制劑。

1.1.3 主要設(shè)備所用主要設(shè)備有KBF240恒溫恒濕箱、PL203-C電子天平、空氣壓縮機(jī)、燒杯、移液槍、噴槍和托盤等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備（1）處理樣：稱取200 g片煙，均勻鋪放在托盤中；用移液槍移取不同濃度的酶溶液（濃度詳見表1～表5），按煙葉重量的3‰放于燒杯中，并用純凈水稀釋20倍；用噴槍將稀釋后的單酶均勻噴灑在煙片上；將處理后的煙片放入恒溫恒濕箱（溫度40℃，濕度65%）中7 d后取出，在室溫條件下存放40 d進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)[26]。（2）對(duì)照樣（CK）：將酶液換成純凈水，其他步驟同上。

1.2.2 感官質(zhì)量評(píng)價(jià)按照安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司《煙葉感官質(zhì)量評(píng)價(jià)辦法》進(jìn)行定量評(píng)價(jià)和定性描述。定量評(píng)價(jià)包括香氣特征（香氣質(zhì)、香氣量和雜氣）、煙氣特征（勁頭、濃度和細(xì)膩程度）和口感特征（刺激性、干燥感、余味和甜度），均采用9分制。燃燒性、灰色均采用5分制。試驗(yàn)重點(diǎn)針對(duì)香氣量、香氣質(zhì)、雜氣和余味進(jìn)行定量評(píng)價(jià)和定性描述。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析采用Excel和Design-Expert 10.0.1進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一酶提高上部煙葉可用性的效果

2.1.1 煙堿脫氫酶由表1可知，煙堿脫氫酶單一酶處理中，當(dāng)添加濃度在1.0‰～1.2‰時(shí)，香氣質(zhì)感略有提升，香氣量略有增加，余味變得純凈舒適；當(dāng)添加濃度在1.2‰時(shí)，對(duì)皖南B3F的綜合改善效果最好，特別是對(duì)辛辣刺激性有較明顯的改善。

表1 煙堿脫氫酶對(duì)皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.2 脂氧合酶由表2可知，當(dāng)脂氧合酶的添加濃度在0.12‰～0.14‰時(shí)，香氣量略有增加，余味略顯舒適。當(dāng)添加濃度在0.14‰時(shí)，對(duì)皖南B3F的綜合改善效果最好，對(duì)枯焦氣和辛辣刺激性均有不同程度的改善。當(dāng)添加濃度在0.16‰時(shí)，綜合改善效果最差。

表2 脂氧合酶對(duì)皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.3 蛋白酶由表3可知，蛋白酶單一酶處理中，當(dāng)添加濃度在1.0‰～1.2‰時(shí)，香氣質(zhì)感提升，雜氣特別是枯焦氣降低明顯。當(dāng)添加濃度在1.2‰時(shí)，對(duì)皖南B3F的綜合改善效果最好，對(duì)枯焦氣和辛辣刺激性均有不同程度的改善。

表3 蛋白酶對(duì)皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.4 酸性木聚糖酶由表4可知，酸性木聚糖酶單一酶處理中，當(dāng)添加濃度在0.4‰～0.6‰時(shí)，香氣質(zhì)感提升明顯，雜氣特別是枯焦氣降低明顯。當(dāng)添加濃度在0.6‰時(shí)，對(duì)皖南B3F的綜合改善效果最好，對(duì)枯焦氣有不同程度的改善。

在偶像粉絲圈（俗稱飯圈）中的粉絲屬性大致分為三類，分別是唯粉、CP粉和團(tuán)粉。唯粉，指的是只喜歡團(tuán)隊(duì)中其中一位偶像的粉絲，可能對(duì)其他團(tuán)隊(duì)成員沒有好惡感受，也可能帶有強(qiáng)烈的厭惡情緒；CP粉源起于韓國(guó)娛樂圈，CP是英文單詞couple的縮寫，CP粉指的是同時(shí)喜歡的兩個(gè)明星并把他們假想成情侶關(guān)系的粉絲，且偶像CP組合方式并不限制性別。團(tuán)粉即整個(gè)偶像團(tuán)隊(duì)的粉絲，團(tuán)隊(duì)中的每一個(gè)人都是團(tuán)粉追捧的對(duì)象，因而團(tuán)粉不接受成員爭(zhēng)端和組合解散。

表4 酸性木聚糖酶對(duì)皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.5 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶由表5可知，淀粉-1,4-葡萄糖苷酶單一酶處理中，當(dāng)添加濃度在0.4‰～0.8‰時(shí)，香氣量提升明顯，余味變得純凈舒適。當(dāng)添加濃度在0.4‰時(shí)，對(duì)皖南B3F的綜合改善效果最好，對(duì)枯焦氣、辛辣刺激性有不同程度的改善。

表5 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶對(duì)皖南B3F煙葉改善效果 （分）

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)皖南B3F上部煙葉的枯焦氣和辛辣刺激性改善明顯的主要是蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶，3種酶的適宜濃度分別為0.8‰～1.2‰、0.4‰～0.8‰和0.1‰～0.14‰。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和結(jié)果

為進(jìn)一步研究變量之間交互作用的影響關(guān)系，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化最佳復(fù)合酶組合。每個(gè)單因素的初步研究是響應(yīng)面優(yōu)化的指導(dǎo)范圍，基于Box-Benhnken采樣原理，選擇對(duì)感官質(zhì)量得分有顯著提高的3個(gè)因素：蛋白酶（A）、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶（B）、脂氧合酶（C）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表6和表7）。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和編碼

表7 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 10.0.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：得分=22.64+0.05×A+1.867 66×10-15×B-0.075×C-0.2×AB-0.05×AC+8.871 66×10-16×BC-0.72×A2-0.52×B2-0.72×C2（編碼制）。

對(duì)方程進(jìn)行回歸分析可知（表8），F(xiàn)值可用來(lái)檢驗(yàn)各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性的高低。F越大，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。當(dāng)模型顯著性檢驗(yàn)值P＜0.05，說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表8可以看出，對(duì)感官質(zhì)量得分影響大小順序?yàn)椋篊＞A＞B，即：脂氧合酶＞蛋白酶＞淀粉-1,4-葡萄糖苷酶。模型的決定系數(shù)R2為0.994 2，說明模型具有高的顯著性，而R2adj=0.986 8，能夠解釋實(shí)驗(yàn)98.68%的響應(yīng)值變異，且與預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2Pred也接近，說明此響應(yīng)模型具有較高擬合精度，與真實(shí)數(shù)據(jù)擬合程度良好，具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，由此可以用該模型分析和預(yù)測(cè)改善效果最明顯的復(fù)合酶制劑。

表8 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析

響應(yīng)面是響應(yīng)值對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，可直觀反映各因素及因素交互作用對(duì)結(jié)果的影響。不同酶的復(fù)配組合對(duì)感官質(zhì)量得分的影響見圖1～圖3。從圖1中可以看出，蛋白酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互作用對(duì)得分的影響呈拋物面分布，當(dāng)?shù)鞍酌敢欢〞r(shí)，隨著淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的增加，得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。同理，當(dāng)?shù)矸?1,4-葡萄糖苷酶不變時(shí)，隨著蛋白酶的提高，得分也呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)。在二者交互作用下，蛋白酶引起曲面更大幅度波動(dòng)，對(duì)得分影響更大。僅考慮二者因素作用下的最優(yōu)組合范圍為：蛋白酶為0.95‰～1.05‰，淀粉-1,4-葡萄糖苷酶為0.7‰～0.9‰水平范圍內(nèi)。圖2所示的交互響應(yīng)面中，蛋白酶和脂氧合酶的變化均引起得分先增后減波動(dòng)。相較于圖1，二者整體波動(dòng)幅度相對(duì)較大，說明蛋白酶與脂氧合酶交互作用對(duì)得分的影響要大于蛋白酶與淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互影響。當(dāng)?shù)鞍酌溉?.0‰水平、脂氧合酶C取0.12‰水平附近的值時(shí)，該組合作用下的得分最高。由圖3，交互曲面整體也呈一拋物曲面，可以看出，當(dāng)?shù)矸?1,4-葡萄糖苷酶不變時(shí)，脂氧合酶引起曲面幅度變化更大，換言之，在交互作用中脂氧合酶的貢獻(xiàn)率更大，實(shí)際酶的復(fù)合過程控制中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注該影響較大的因素，設(shè)置合理的酶的復(fù)配方式。當(dāng)設(shè)定淀粉-1,4-葡萄糖苷酶在0.7‰～0.9‰，脂氧合酶在0.115‰～0.125‰時(shí)，得分最高，應(yīng)控制該條件從而得到最佳復(fù)配組合。

圖1 蛋白酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互作用對(duì)感官得分的影響

圖3 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶的交互作用對(duì)感官得分的影響

為進(jìn)一步精準(zhǔn)確定全局最優(yōu)解，以得分最高為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)分析結(jié)果，得分在蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶、脂氧合酶的共同影響下的最優(yōu)酶的組合為蛋白酶1.0‰、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶0.8‰、脂氧合酶0.12‰，在此條件下模型預(yù)測(cè)的最大得分為22.64分。在最優(yōu)酶的組合下，皖南上部煙葉香氣質(zhì)提升明顯，刺激性降低，勁頭降低，雜氣減輕，煙氣明顯柔和細(xì)膩，質(zhì)量有明顯提高。

3 討 論

從研究結(jié)果來(lái)看，生物酶能夠改善煙葉感官質(zhì)量，增加煙草香味物質(zhì)，減輕雜氣和刺激性，生物酶的主要作用體現(xiàn)在生物酶能夠促進(jìn)煙葉中纖維素、果膠、淀粉等的生物轉(zhuǎn)化，協(xié)調(diào)煙草中化學(xué)成分，降解煙草中的有害成分并提高煙葉香氣成分。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶這3種單一酶對(duì)上部煙葉改善效果較好，這與前人研究結(jié)果[16-21]一致。3種單一酶的作用機(jī)理不同，蛋白酶主要將煙葉中蛋白質(zhì)長(zhǎng)的肽鍵分解成短肽；淀粉-1,4-葡萄糖苷酶作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷鍵，將淀粉分子分解成成葡萄糖；而脂氧合酶既與類胡蘿卜素、綠素降解有關(guān)，又能催化亞油酸、亞麻酸氧化，形成正己醇、己烯酸、己烯醛等香氣成分。

在單一酶試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，項(xiàng)目組采用響應(yīng)面分析法開展合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，開展不同單一酶復(fù)配組合研究，利用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過響應(yīng)面及軟件運(yùn)行計(jì)算得到最佳組合。在多種酶共同作用下，煙葉中的多肽、蛋白質(zhì)、粗纖維以及淀粉類大分子有很好的降解轉(zhuǎn)化作用，這有利于提高煙葉的內(nèi)在化學(xué)成分協(xié)調(diào)性，從而使煙葉感官質(zhì)量評(píng)分提高，對(duì)于提高上部煙葉可用性具體重要意義。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，添加生物酶可以提高上部煙葉質(zhì)量，對(duì)皖南上部煙葉感官質(zhì)量提升較大的是蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶，這3種酶對(duì)煙葉枯焦氣、辛辣刺激性均有不同程度的改善。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化確定了最佳復(fù)合酶組合，最優(yōu)組合為蛋白酶1.0‰、淀粉-1,4-葡萄糖0.8‰、脂氧合酶0.12‰，在此條件下感官質(zhì)量最優(yōu)得分為22.64分。優(yōu)化后的復(fù)合酶對(duì)皖南上部煙葉香氣質(zhì)提升明顯，刺激性降低，勁頭降低，雜氣減輕，煙氣明顯柔和細(xì)膩，質(zhì)量有明顯提高。上述研究成果對(duì)于上部煙葉可用性提升有重要意義。