芥子氣中毒生物標(biāo)志物溯源檢測技術(shù)研究進(jìn)展

(1. 國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102205；2. 防化研究院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京，102205)

芥子氣(sulfur mustard, mustard gas, SM, MG, HD)是糜爛性毒劑最典型代表，學(xué)名為2, 2’-二氯二乙硫醚。HD作為化學(xué)戰(zhàn)劑首先部署于第一次世界大戰(zhàn)，大約有130萬的人受到芥子氣的損傷，傷亡率占化學(xué)毒劑總傷亡人數(shù)的 80%以上[1]。第二次世界大戰(zhàn)日本侵華期間，日軍廣泛對中國軍民施用了HD，造成了巨大傷亡。直到現(xiàn)在，在中國仍有大量的日本遺留化學(xué)武器，其中大部分是HD和芥路混合毒劑，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)這些日遺化武已經(jīng)使3000多名中國公民受到不同程度的傷害[2]。2003 年中國齊齊哈爾的“8·4”事件正是此類典型事件。此后，兩伊戰(zhàn)爭上也有HD施用的報(bào)道[3]。雖然化武公約嚴(yán)格禁止HD的生產(chǎn)、儲(chǔ)存和施用，但以往遺留在化學(xué)炮彈中的HD仍會(huì)時(shí)刻威脅人民的生命安全。因此，有必要建立和發(fā)展可靠的分析方法溯源性檢測和鑒定HD染毒，為指證HD的使用和改善HD染毒人員的醫(yī)療救治提供依據(jù)。與其它體內(nèi)代謝物相比，HD與蛋白質(zhì)加合物更為穩(wěn)定、具有較長的半衰期，能夠在較長時(shí)間范圍內(nèi)檢測到這些加合物，成為HD中毒檢測的重要生物標(biāo)志物。

1 HD概述與中毒機(jī)理

與神經(jīng)性毒劑相比，糜爛性毒劑HD的致死性相對較低。HD具強(qiáng)烈的細(xì)胞毒作用，能使人或動(dòng)物皮膚產(chǎn)生紅斑、水皰、壞死，并能引起眼、呼吸道、消化道粘膜和組織損傷，出現(xiàn)程度不同的全身中毒，主要表現(xiàn)為造血系統(tǒng)和消化道粘膜等的損害[4]。雖然HD中毒機(jī)理尚未完全闡明，但普遍認(rèn)為由于HD具兩個(gè)親電碳原子，是典型的雙功能烷基化試劑，進(jìn)入體內(nèi)后能形成硫鎓正離子，生理?xiàng)l件下，硫鎓正離子通過SN1機(jī)制與體內(nèi)器官或組織中的多種化合物分子的親核性基團(tuán)如氨基、巰基、羥基、羧基、磷酸基及咪唑基等反應(yīng)，生成對應(yīng)的烷基化產(chǎn)物，進(jìn)而產(chǎn)生各種毒理效應(yīng)，如破壞細(xì)胞正常的分裂繁殖；抑制酶的活性；使蛋白變性，導(dǎo)致細(xì)胞和組織壞死、潰爛等。而HD進(jìn)入體內(nèi)后的水解代謝物硫二甘醇(TDG)和它的氧化產(chǎn)物硫二甘醇亞砜(TDGO)、一系列β-裂解酶代謝產(chǎn)物、HD與DNA在鳥嘌呤N7, O6位置上的加合物和在腺嘌呤N3位置上的加合物，HD與一些蛋白質(zhì)的加合物已經(jīng)被作為偵檢臨床樣本中HD暴露的重要生物標(biāo)志物，并且為醫(yī)學(xué)治療提供了可靠的信息。

2 水解產(chǎn)物、與谷胱甘肽加合物及其β-裂解產(chǎn)物為HD中毒生物標(biāo)志物

HD進(jìn)入體內(nèi)在生理?xiàng)l件下，迅速形成的硫鎓正離子中間體具強(qiáng)的電負(fù)性，能夠與水、谷胱甘肽等小分子親核試劑反應(yīng)分別生成硫二甘醇(TDG)和HD-谷胱甘肽加合物(圖1)，后者再經(jīng)β-裂解酶作用生成β-裂解產(chǎn)物，這些代謝物均為HD中毒的重要生物標(biāo)志物。

2.1 HD水解產(chǎn)物

由HD水解生成的TDG，可以通過氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成硫二甘醇亞砜(TDGO)(圖1)。一直以來，由于TDG和TDGO少量存在于正常健康人的尿液中，它們作為確證HD中毒的生物標(biāo)志物存在一定的爭議。然而，TDG和TDGO在正常人體內(nèi)的背景值極低，分別僅為0～1.0 ng/mL和2～8.0 ng/mL[5]，遭遇HD染毒的樣本中兩者的含量將顯著增加，研究證實(shí)，體內(nèi)TDG濃度高于2 ng/mL，TDGO濃度高于10 ng/mL，可初步認(rèn)定為HD中毒。因此，它們常作為核查HD暴露的輔助性依據(jù)。此外，進(jìn)入體內(nèi)的HD也有極少量發(fā)生氧化，生成HD亞砜(SMO，圖1)，該代謝產(chǎn)物被檢測存在于尿液、血液和分泌物中。SMO為非內(nèi)源性物質(zhì)，被用作HD中毒的重要生物標(biāo)志物。這些水解、氧化產(chǎn)物可在HD暴露后迅速出現(xiàn)在生物體液中，并于數(shù)日內(nèi)經(jīng)尿液排出體外。

圖1 HD在體內(nèi)代謝的4種主要途徑

TDG和TDGO的定量檢測，常通過衍生化制備，再由GC-MS/MS檢測，檢測限可達(dá)0.5 ng/mL。此外，近年來，LC-ESI-MS/MS也被發(fā)展用于檢測這些化合物，該類方法樣品制備簡單，無需復(fù)雜的衍生化過程，采用SRM模式，檢測限達(dá)0.05 ng/mL(SMO)、5.0 ng/mL(TDG)和0.5 ng/mL(TDGO)[6]。

2.2 HD-谷胱甘肽加合物及其β-裂解產(chǎn)物

谷胱甘肽(GSH)是人體內(nèi)具有活性的含有3個(gè)氨基酸的小分子肽類物質(zhì)，HD與谷胱甘肽的加合位點(diǎn)為半胱氨酸上的巰基。HD-谷胱甘肽加合物經(jīng)γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶和二肽酶酶解后游離出HD-半胱氨酸加合物，再由N-乙酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化生成SBSNAE(圖1)。再經(jīng)β-裂解酶作用，生成一系列特征性的非內(nèi)源性的小分子標(biāo)志物，被稱為“β-裂解產(chǎn)物”；主要為：1,1’-磺?；?2-甲亞磺?；?乙烷(SBMSE)和1-甲基亞磺?；?2-(2-甲巰基乙基磺?；?乙烷(MSMTESE)等(圖1)。此外，經(jīng)檢測，這些特征性代謝產(chǎn)物隨尿液排出體外，在體內(nèi)可停留約1周。

β-裂解產(chǎn)物的分析檢測手段主要是GC-MS或GC-MS/MS，然而，由于SBMSE和MSMTESE的熱穩(wěn)定性較差，分析前通常應(yīng)用三氯化鈦等將其還原成單一的1,1’-磺?；?2-甲巰基)乙烷(SBMTE)，然后再進(jìn)行檢測。Black等[8]和王穎等采用GC-PCI-MS檢測尿液中的β-裂解產(chǎn)物，檢測限分別為2 ng/mL和0.5 ng/mL。Young等[10]應(yīng)用GC-MS/MS進(jìn)行檢測，該方法具最高的靈敏度，尿樣中的β-裂解產(chǎn)物的檢測限可達(dá)0.038 ng/mL。然而，應(yīng)用這些氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)涉及到復(fù)雜的樣品制備步驟，一定程度上限制了其應(yīng)用與推廣。為了獲得更簡便的檢測方法，LC-MS/MS定量檢測血液[6]、尿液中β-裂解產(chǎn)物的分析方法逐漸被建立和應(yīng)用。該類方法無需還原反應(yīng)等處理，只要簡單的制備即可直接進(jìn)入LC-MS/MS分析。近來，一個(gè)高特異性、靈敏的檢測血漿中所有β-裂解產(chǎn)物和SBSNAE的方法被建立和考察，檢測限分別為0.01 ng/mL(SBMSE和MSMTESE)、0.05 ng/mL(SBMTE)和0.5 ng/mL(SBSNAE)，較Read等建立的LC-MS 或LC-MS/MS分析方法的靈敏度有較大的提高[6]。

對于尿液中HD代謝物的溯源檢測，雖然已有大量的液質(zhì)和氣質(zhì)檢測方法已經(jīng)被建立，但以上方法未見有一種單獨(dú)的方法能夠同時(shí)檢測HD在尿液中的水解代謝物、與谷胱甘肽的加合物及其β-裂解產(chǎn)物。然而，本實(shí)驗(yàn)室Liu等通過固相萃取方法的改進(jìn)，首次建立了一個(gè)單獨(dú)的可以同時(shí)定量檢測尿液中HD的4個(gè)代謝物液質(zhì)分析方法，避免了以往需要多個(gè)分析方法才能完成此4個(gè)化合物檢測的問題[11]。

3 HD與蛋白質(zhì)和核酸加合物作為HD中毒的生物標(biāo)志物

HD進(jìn)入體內(nèi)，除了與水、谷胱甘肽等小分子親核試劑反應(yīng)外，還與DNA和蛋白質(zhì)等大分子上的親核基團(tuán)反應(yīng)，生成相應(yīng)的HD-DNA或HD-蛋白質(zhì)加合物(圖1)。這些大分子加合物較為穩(wěn)定，在體內(nèi)可存在數(shù)月之久，因此它們已成為HD中毒溯源檢測的重要生物標(biāo)志物。

3.1 HD-核酸加合物

HD中毒引發(fā)的細(xì)胞毒性被認(rèn)為主要由HD烷基化DNA所致，烷基化的DNA直接使遺傳信息無法準(zhǔn)確復(fù)制，進(jìn)而發(fā)生錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)錄與翻譯，最終表現(xiàn)出機(jī)體的損傷。由HD介導(dǎo)的DNA烷基化位點(diǎn)發(fā)生在脫氧鳥嘌呤(G)的N7位，產(chǎn)物為N7-(2-羥乙基硫代乙基)鳥嘌呤(N7-HETEG)；脫氧腺嘌呤(A)的N3位，產(chǎn)物為N3-(2-羥乙基硫代乙基)腺嘌呤(N3-HETEA)；脫氧鳥嘌呤(G)的O6位，產(chǎn)物為O6-(2-羥乙基硫代乙基)鳥嘌呤(O6-HETEG)(圖2)。此外，一分子的HD與兩個(gè)鳥嘌呤在N7位上發(fā)生鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)，產(chǎn)物為雙(鳥嘌呤-7)衍生物(Bis-G)(圖2)。這些位點(diǎn)的烷基化具明顯的傾向性，經(jīng)測定，N7-HETEG含量最高，約占DNA總加合物的61%，N3-HETEA和Bis-G各約占17%，而O6-HETEG僅占總加合物的0.1%。

圖2 4個(gè)HD-DNA加合物的結(jié)構(gòu)式

基于此，早期的檢測方法主要集中于N7-HETEG，方法主要為32P 后標(biāo)記法、免疫檢測法和質(zhì)譜分析。前兩者雖然具高的特異性和靈敏度，但操作步驟相對復(fù)雜且定量的準(zhǔn)確度不高。質(zhì)譜法可以彌補(bǔ)這方法的缺點(diǎn)，因此檢測獲得了越來越多的重視。由于N7-HETEG的極性強(qiáng)，需先采用五氟苯甲酰溴或雙三甲基硅基三氟乙酰胺等對其進(jìn)行衍生化，再進(jìn)入GC-MS檢測。但該方法樣品制備過程仍過于復(fù)雜，衍生化條件過于苛刻，因此應(yīng)用上受到了很大限制。相比之下，LC-MS/MS方法無需衍生化即可直接檢測，相關(guān)的方法也獲得了發(fā)展和應(yīng)用。Fidder等[12]將樣品經(jīng)SPE簡單分離凈化后，直接進(jìn)入LC-MS/MS 分析，在HD染毒豚鼠尿液中檢測到了N7-HETEG，檢測限為0.2 ng/ml。Wei等[13]建立了專門適用于人血液中N7-HETEG加合物的檢測方法，血液中的DNA經(jīng)分離、酸水解，再進(jìn)入LC-MS/MS定量分析，方法檢測限為0.33 ng/mL，應(yīng)用該方法能夠在染毒濃度為312 ng/ml HD的全血中，檢測到N7-HETEG。Batal等[14]主要分析了SM處理的小牛胸腺DNA和人白血病單核細(xì)胞中最豐富的3種DNA加合物N7-HETEG、N3-HETEA和BisG，該方法基于外部校準(zhǔn)曲線的使用，后續(xù)研究集中于DNA加合物在內(nèi)臟分布情況。Zhang等建立并驗(yàn)證了一種氘代同位素稀釋UHPLC-MS/MS同時(shí)定量N7-HETEG、N3-HETEA、Bis-G、和O6-HETEG的方法，該方法更為簡便、靈敏，4個(gè)分析物的檢測限分別為0.01、0.11、0.04和0.002 fmol，此外該課題組分析發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞系和脂肪組織中的DNA加合物水平遠(yuǎn)高于其他組織，一定程度上表明HD可能易在富脂環(huán)境富集[7]。Zubel[15]課題組以15N/13C的HD-DNA加合物標(biāo)樣為內(nèi)標(biāo)，同樣利用同位素稀釋超高液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，在多種樣本中定量分析了HETEG、HETEA及BisG與芥子氣染毒劑量和染毒時(shí)間的關(guān)系。。

3.2 HD-蛋白質(zhì)加合物

與其它代謝產(chǎn)物相比，HD與蛋白質(zhì)加合物更為穩(wěn)定、具有較長的半衰期，能夠在較長時(shí)間范圍內(nèi)檢測到這些加合物[16, 17]，是HD中毒長期溯源性檢測的重要生物標(biāo)志物。雖然，在體內(nèi)HD能夠使多種蛋白質(zhì)上的親核氨基酸殘基發(fā)生烷基化，但其中作為生物標(biāo)志物被認(rèn)為最重要的是HD與血紅蛋白N-末端纈氨酸反應(yīng)，生成的HD-血紅蛋白烷基化加合物；以及與血清白蛋白第34位的半胱氨酸反應(yīng)，生成的HD-白蛋白烷基化加合物(圖3)；主要是由于這兩種蛋白加合物含量高、易于分離和檢測。

HD與血紅蛋白N-末端Val殘基形成的加合物最為穩(wěn)定，能夠在體內(nèi)存在長約120天。HD-血紅蛋白加合物的檢測方法主要是使用Edman降解法結(jié)合氣相色譜 (GC)-NICI-MS分析鑒定產(chǎn)生的S-羥乙基硫乙基(S-HETE)-Val加合物。HD-血紅蛋白加合物經(jīng)Edman降解后，生成N-末端Val加合物，再由七氟丁酸酐或七氟丁酰咪唑衍生化后，用NCI-GC/MS分析衍生化產(chǎn)物，檢測限可達(dá)0.1 μmol/L。該方法被應(yīng)用于實(shí)際HD染毒樣品的溯源性檢測，測定HD 染毒22～26天的伊朗傷員全血樣本，均檢出了(S-HETE)-Val加合物。

圖3 HD與人血清白蛋白第34位Cys殘基加合反應(yīng)過程

HD與人血清白蛋白(ALB)第34位半胱氨酸殘基，生成穩(wěn)定的S-羥乙基硫乙基([S-HETE])-ALB加合物在體內(nèi)的半衰期為20～25天。該HD-ALB加合物的檢測方法主要為蛋白酶解結(jié)合LC-ESI-MS-MS分析，方法基于應(yīng)用鏈酶蛋白酶酶解[S-HETE]-ALB加合物，轉(zhuǎn)換生成分子量較小、易于質(zhì)子化的三肽加合物“[S-HETE]-CPF”，再進(jìn)行LC-ESI-MS-MS的檢測分析[22]。以d8-HD作為內(nèi)標(biāo)，分析定量HD暴露血漿中[S-HETE]-CPF三肽加合物的定量方法已經(jīng)被建立，應(yīng)用該方法在真實(shí)HD暴露樣本中檢測出[S-HETE]-ALB加合物，有效地確證了HD樣本的染毒。最近，Pantazides等[25]建立了一個(gè)改進(jìn)的定量HD-ALB加合物方法，該方法具簡化的樣品制備步驟，使用少量的血液樣本，選擇蛋白酶K酶解[S-HETE]-ALB加合物，解決了以往不同批次鏈酶蛋白酶酶解產(chǎn)生[S-HETE]-CPF三肽加合物的量變異性較大的問題。但該方法僅能測定[S-HETE]-CPF加合物的量，而非暴露HD的濃度，測定結(jié)果無法直接給出人員HD中毒程度的信息；本實(shí)驗(yàn)室Liu等通過引入HD模擬劑作為內(nèi)標(biāo)，建立了血漿中HD-ALB加合物的定量檢測方法，實(shí)現(xiàn)了HD染毒濃度的直接測定[26]。

4 結(jié)論

鑒于糜爛性毒劑HD在生物醫(yī)學(xué)樣本中溯源性鑒定需求，大量的HD中毒溯源生物標(biāo)志物分析檢測方法被開發(fā)和建立，其中基于質(zhì)譜分析的技術(shù)在生物標(biāo)志物的檢測鑒定領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢，不足是仍要結(jié)合復(fù)雜的樣品前處理程序才能獲得滿意的靈敏度，分析檢測周期較長，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測；此外，對于大量中毒樣本，不能同時(shí)處理和分析。因此，今后建立適合高通量、自動(dòng)化分析HD中毒溯源生物標(biāo)志物檢測方法，建立健全相應(yīng)的高通量設(shè)備或裝備體系；以及結(jié)合分子識別與光學(xué)檢測，設(shè)計(jì)適于現(xiàn)場檢測的芯片等，實(shí)現(xiàn)生物醫(yī)學(xué)樣本中毒劑與蛋白質(zhì)加合物在現(xiàn)場的快速、準(zhǔn)確、特異性檢測，將是未來應(yīng)用和發(fā)展的趨勢。