超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定糕點(diǎn)中的三氯蔗糖

梁婷婷 曾云想

摘要： 建立了檢測(cè)糕點(diǎn)中三氯蔗糖的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)方法。樣品經(jīng)亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液去除糕點(diǎn)中蛋白、油脂等雜質(zhì)后， 用甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫， 采用Aglient Eclipse Plus C18 （3.0×100mm）分離后，用電噴霧負(fù)離子（ESI-）模式離子化，選擇多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）方式監(jiān)測(cè)，串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三氯蔗糖在0.1-3.0ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系， 相關(guān)系數(shù)為r=0.998， 三氯蔗糖的方法檢出限為 0.1μg/kg，回收率為93.8%-97.6%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD） 為1.38%。 本方法快速簡(jiǎn)便， 操作穩(wěn)定， 可適用于糕點(diǎn)三氯蔗糖的質(zhì)量控制檢測(cè)。

關(guān)鍵詞： 三氯蔗糖;超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜;干擾少

傳統(tǒng)食品工業(yè)長(zhǎng)期以來主要以糖類作甜味劑，傳統(tǒng)糕點(diǎn)中常用的糖類物質(zhì)如蔗糖、葡萄糖、果糖等。這些糖類甜味物質(zhì)多呈現(xiàn)高營(yíng)養(yǎng)性、高安全性、高發(fā)熱值及低甜度、大添加量的特點(diǎn)，長(zhǎng)期大量食用，易引起心血管疾病、肥胖癥、糖尿病及齲齒等，嚴(yán)重威脅人體健康。由于我國(guó)老齡化程度不斷增加，忌糖隊(duì)伍越來越大，食品將進(jìn)一步趨于低熱量、低糖。因此，開發(fā)應(yīng)用安全健康的低熱量、高甜度及具有功能性的非營(yíng)養(yǎng)性甜味劑，以滿足健康、科學(xué)飲食需求顯得尤為迫切。三氯蔗糖是以蔗糖為原料的功能性的甜味劑，1976年由英國(guó)泰萊公司與倫敦大學(xué)共同研制并申請(qǐng)專利，具有無能量、高甜度、純正甜味、安全度高等特點(diǎn)，其甜度可達(dá)蔗糖甜度約600倍。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）早在1998年批準(zhǔn)三氯蔗糖上市之前，參照了100多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，未發(fā)現(xiàn)其在生殖系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)方面毒性以及未發(fā)現(xiàn)誘發(fā)癌癥的反應(yīng)。我國(guó)1997年正式批準(zhǔn)使用三氯蔗糖之前同樣經(jīng)過了一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其安全性。

三氯蔗糖在我國(guó)使用廣泛，目前對(duì)于三氯蔗糖分析方法主要有高效液相色譜法、離子色譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 22255-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》中使用的是高效液相色譜法。由于糕點(diǎn)中成分復(fù)雜，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法中前處理需進(jìn)行衍生化過程繁瑣，并且三氯蔗糖的性質(zhì)較黏，氣相色譜儀進(jìn)樣量小容易引起誤差導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性不好;高效液相色譜法測(cè)定三氯蔗糖方法檢測(cè)器穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)，過程復(fù)雜。因而應(yīng)用此方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。本文研究縮短提取時(shí)間，簡(jiǎn)化處理過程，檢出限低、干擾少適用于糕點(diǎn)中三氯蔗糖檢測(cè)的需要。

1. 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6460型超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀;KH3200B型臺(tái)式超聲波清洗器;Direct-Pure UP型純水機(jī);梅特勒LE204E/02型分析天平;固相萃取柱。

三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液20mg/mL;甲醇、甲酸、正己烷為HPLC級(jí)。

乙酸鋅、亞鐵氰化鉀分析純。

1.2 儀器工作條件

1.2.1色譜條件

Aglient ZDRBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（3.0mm×100mm），流動(dòng)相：A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸水溶液，B為甲醇;柱溫35℃，進(jìn)樣量10?L。流動(dòng)相梯度洗脫程序：0min，A為95%;0-2min，A由95%降至30%;2-3min，A由30%升至50%;3-3.2min，A由50%降至10%;3.2-4.1min，A由10%升至95%;4.1-7.0min，A為95%。流量0.3mL/min。

1.2.2質(zhì)譜條件

電噴霧電離負(fù)離子模式（ESI-）;質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）;脫溶劑氣：氮?dú)?碰撞氣：氬氣;干燥氣流量：10L/min;干燥氣溫度：350℃;毛細(xì)管電壓：3.0kV;噴霧壓力：207KPa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。其中*為定量離子。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取粉碎均勻后的固體試樣2g精確到0.001g置于50mL離心管中，加入5mL水，旋渦振蕩器振蕩2min后加入15mL甲醇，繼續(xù)振蕩30s，超聲提取20min，然后以8000r/min冷凍離心3min，移取上清液，殘?jiān)?5%甲醇再次提取，合并2次提取液，將提取液用30mL正己烷凈化后移取下層溶液，將提取液通過依次用5mL甲醇和5mL水活化的固相萃取小柱，再加入1mL水淋洗，待柱中液體完全流出后，用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液于75℃水浴氮吹近干，甲醇定容至1mL，過0.45μm微孔濾膜供液質(zhì)分析。

2. 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

現(xiàn)行GB 22255-2014在樣品制備過程中，其轉(zhuǎn)速為3000r/min時(shí)間10min。優(yōu)化條件將轉(zhuǎn)速增為8000r/min冷凍離心3min，樣品在低溫條件下分層效果更好，不易堵塞凈化柱，且能縮短前處理時(shí)間。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察三氯蔗糖正離子模式下，無法產(chǎn)生相應(yīng)的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，而在ESI負(fù)離子模式下有良好的信號(hào)，因此選擇ESI負(fù)離子模式下進(jìn)行三氯蔗糖的測(cè)定。將1ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液在負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，再通過MRN，優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇最佳子離子，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量。最后確定 m/z395.1>358.9作為定性離子對(duì)，m/z395.1>35.1作為定量離子對(duì)（見表1）。

2.3 校準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)質(zhì)量濃度為0.1-3.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0ng/mL，繪制線性曲線。得到線性回歸方程y=458.16x+16.82，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，線性范圍0.1-3.0ng/mL。以S/N=3計(jì)，三氯蔗糖的最小檢出限為0.1μg/kg，以S/N=10計(jì)，該方法的定量檢測(cè)限為 0.5μg/kg。

2.4 精密度的測(cè)定

取1.00ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按選定的實(shí)驗(yàn)條件連續(xù)測(cè)試6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）%為1.38%。

2.5 加標(biāo)回收率的測(cè)定

稱取適量樣品，按線性范圍分別加入三個(gè)濃度的三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。平均加標(biāo)回收率為95.3%，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，滿足日常檢測(cè)要求。

3. 結(jié)果與討論

本工作建立了測(cè)定糕點(diǎn)中三氯蔗糖的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三氯蔗糖在0.1-3.0ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系， 相關(guān)系數(shù)為r=0.998，三氯蔗糖的方法檢出限為 0.1μg/kg，回收率為93.8%-97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.38%。本方法檢出限低，回收率、重復(fù)性等結(jié)果均優(yōu)于同等條件的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜法，可滿足糕點(diǎn)中三氯蔗糖的檢測(cè)要求。