一株從云南西部土壤中分離的蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）的抗氧化活性研究

＊范集壯 程依婷 高玉婷 佘容* 楊曉燕

（1.大理大學(xué)天然抗氧化劑與抗氧化炎癥研究院 云南 671003 2.中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心 云南 671003 3.大理大學(xué) 三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 云南 671003 4.大理大學(xué) 東喜瑪拉雅研究院 云南 671003）

前言

隨著我國老齡化問題的加劇，暴露出了許多醫(yī)療健康問題，如關(guān)節(jié)炎、心腦血管疾病、衰老、腫瘤等許多老年性疾病正逐漸成為威脅著人們生命健康的重要疾病[1]。當(dāng)前研究表明，自由基是引起這一生命趨弱化的重要因素，尤其是大量證據(jù)表明，在病理狀態(tài)下、氧自由基的慢性或急性過度產(chǎn)生可誘發(fā)或加重心腦血管疾病，并且自由基對蛋白質(zhì)和核酸的影響涉及面很廣[2]。而對其預(yù)防的手段之一是使用清除自由基的藥物，但目前市面上廣泛使用的此類藥物主要是人工合成的維生素C（Vit C）對人體健康有潛在威脅，因此不適宜長期服用。天然抗氧化劑是從天然物質(zhì)中分離提取的，相比于合成維生素C，更適宜人長期服用，且其含有的其他天然活性成分更有利于人體吸收[3]。因此，對于天然抗氧化物的開發(fā)迫在眉睫。目前，關(guān)于天然抗氧化物的研究現(xiàn)主要集中在植物方面，利用微生物進(jìn)行天然抗氧化開發(fā)的研究較少。

微生物是自然界的重要組成部分，微生物所產(chǎn)生的藥物與一般化學(xué)藥物相比，具有巨大的優(yōu)越性，其主要表現(xiàn)為微生物生長周期短，易于選種培育，可在短時間內(nèi)大規(guī)模發(fā)酵，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[4]；其次關(guān)于微生物資源方面，學(xué)術(shù)界認(rèn)為目前可培養(yǎng)微生物仍只是自然界的1%[5]，其中未被開發(fā)利用的微生物資源非常豐富。但目前關(guān)于微生物抗氧化藥物方面的研究主要集中在乳酸菌[6-7]和雙歧桿菌[8]，因此，如果能夠擴(kuò)大研究范圍到其他微生物上，不僅能夠豐富抗氧化微生物資源，還能在微生物抗氧化產(chǎn)品開發(fā)上起到促進(jìn)作用。

蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）又稱為臘狀芽孢桿菌蕈狀變種，屬于芽孢桿菌屬蠟狀芽孢桿菌亞種[9]，在自然界中廣泛存在。已有研究表明，蕈狀芽孢桿菌代謝產(chǎn)物具有提高免疫[10]、抑菌[11]、致病[12]等功能，但是關(guān)于其是否具有抗氧化活性的研究還未曾報(bào)道?；诖?，本研究擬利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)分離獲得的蕈狀芽孢桿菌為研究對象，探索其作為抗氧化劑開發(fā)的潛能。研究擬以蕈狀芽孢桿菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物提取物為對象，通過測定其對DPPH和ABTS的自由基清除率以及對FRAP的氧化還原能力評估樣品的抗氧化能力，為利用蕈狀芽孢桿菌進(jìn)行天然抗氧化物的開發(fā)篩選提供參考信息。

1.材料與方法

(1)菌株與培養(yǎng)基

①菌株與培養(yǎng)基

供試菌株：蕈狀芽孢桿菌SH-4 (大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院保藏）。

②培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，調(diào)至pH7.4-7.6，121℃，30min滅菌備用。

(2)儀器與試劑

①儀器

冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠），高速離心機(jī)（LG10-2.4A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠），可見分光光度計(jì)（722N，上海菁華科技儀器有限公公司），電子天平（PX224ZH，奧豪斯儀器有限公司），超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

②試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，?；晒I(yè)發(fā)展有限公司），2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，上海麥克林生化科技有限公司），2,4,6－三吡啶基三嗪（TPTZ，上海麥克林生化科技有限公司），抗壞血酸（Vit C，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸乙酯（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），牛肉浸膏（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），蛋白胨（北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司），氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），均為分析純。

(3)試驗(yàn)方法

①菌株的純化

在超凈工作臺取于甘油保種管的原始蕈狀芽孢桿菌SH-4菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)活化，然后放入28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。

②蕈狀芽孢桿菌SH-4發(fā)酵液制備

將已經(jīng)活化的蕈狀芽孢桿菌SH-4菌株接種到滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于溫度為28℃，140rpm/min搖床中培養(yǎng)3d。

③蕈狀芽孢桿菌代謝產(chǎn)物提取

蕈狀芽孢桿菌發(fā)酵好后用等體積的乙酸乙酯萃取，再應(yīng)用超聲輔助提取，超聲條件：20℃、40Hz、60power、1h，超聲完成后靜置一晚，隔天取上清液進(jìn)行旋蒸，旋蒸條件：30℃、40rpm/min。旋蒸完成后，將濃縮的提取物用少量蒸餾水超聲輔助溶解，轉(zhuǎn)移至已稱重、干燥、干凈的培養(yǎng)皿后置于-20℃冰箱，待提取物凝固后利用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥數(shù)天，所獲固體為菌體代謝產(chǎn)物。

④DPPH清除能力測定

DPPH溶液的配制：準(zhǔn)確稱取DPPH粉末1g，用無水乙醇溶解并定量轉(zhuǎn)入1L棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1g/L的DPPH儲備液，置于冰箱中冷藏備用。

DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取1mL DPPH儲存液和19mL無水乙醇混合搖勻，將儲備液稀釋20倍，配制成50mg/L的DPPH工作液。再將工作液用無水乙醇依次稀釋為5mg/L、2.5mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.05mg/L濃度做DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線使用。

DPPH自由基清除率的測定：準(zhǔn)確稱取蕈狀芽孢桿菌乙酸乙酯提取物0.1g，用10ml無水乙醇溶解，得到10g/L提取物母液。再將提取物母液依次稀釋為10g/L，5g/L，2.5g/L，1g/L，0.5g/L，0.25g/L，0.1g/L，0.05g/L，0.025g/L待測溶液，以等質(zhì)量濃度的Vit C為參照。精確吸取0.7ml待測樣品溶液和0.7ml DPPH工作溶液1:1混勻?yàn)閷?shí)驗(yàn)組，對照組用0.7mL無水乙醇代替DPPH溶液，以加入0.7mL DPPH和0.7mL無水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)組，每個濃度設(shè)置三個復(fù)孔，37℃水浴30min后用1mL比色皿于517nm分光光度計(jì)處測吸光值，計(jì)算清除率及IC50，并以Vit C的IC50為對照計(jì)算樣本比活性[13-15]。

自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

實(shí)驗(yàn)組吸光度記為Ai；對照組吸光度作為Aj；標(biāo)準(zhǔn)組吸光度作為A0值。

IC50計(jì)算：運(yùn)用SPSS建立三個變量，分別是濃度，清除率和總數(shù)。建立好后輸入數(shù)據(jù)，其中總數(shù)用1或者100表示，其他按實(shí)際輸入。輸好后使用回歸中的Probit分析，其中響應(yīng)頻率為清除率，觀測值匯總為總數(shù)，協(xié)變量為濃度，轉(zhuǎn)換選擇對數(shù)底為10，模型選擇logit，隨后在彈出的輸出界面的置信限制中找到概率0.50的估計(jì)濃度即為IC50。

比活性的計(jì)算[16]：

“小時候，有個家伙欺負(fù)我，看到我的連環(huán)畫就想搶走，我打不過他不知怎么辦，就觀察別的小孩，發(fā)現(xiàn)當(dāng)一個小孩被人欺負(fù)的時候，就說我有一個哥哥，或者我有一個誰誰很厲害。當(dāng)時我正好看了鄭淵潔寫的皮皮魯?shù)墓适?，于是我靈機(jī)一動對那個小孩說我有一個哥哥，名字叫皮皮魯，可厲害了，你知不知道？他瞪著眼睛想了半天不知道皮皮魯是誰，但被這個怪異的名字嚇住了，居然放過了我?！?/p>

AE=1/IC50（AE為自由基清除能力）

AE（樣品）=1/IC50（樣品）

AE（Vitc）=1/IC50（Vitc）

比活性=AE（樣品）/AE（Vitc）=IC50（Vitc）/IC50（樣品）

⑤ABTS清除能力測定

ABTS工作液的配制：避光稱取ABTS粉末30mg，加超純水8mL溶解配制得7mmol/L ABTS水溶液，精密稱取10mgK2S2O8加15mL超純水溶解得4.9mmol/L過硫酸鉀水溶液，將以上兩種水溶液按1:1等量混合，置于4℃冰箱避光情況儲存12-16h，得到ABTS母液備用。使用時，用無水乙醇在734nm稀釋至吸光度為0.70±0.02Abs范圍內(nèi)工作液。

ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線：將Vit C用無水乙醇依次稀釋為10mg/L，7.5mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.25mg/L濃度。樣品和ABTS工作液體積比按1:3加入反應(yīng)，做ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線使用。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

實(shí)驗(yàn)組吸光度記為Ai；對照組吸光度作為Aj；標(biāo)準(zhǔn)組吸光度作為A0值。

⑥總抗氧化能力（FRAP法）的測定

TPTZ工作液的配制：分別配置醋酸鹽緩沖液（pH3.6），10mmol/L TPTZ溶液，20mmol/L FeCl3溶液，并按照體積比10:1:1混合，制成TPTZ工作液。

FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配置成1.6mmol/L，0.8mmol/L，0.4mmol/L，0.2mmol/L，0.1mmol/L不同濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，分別加入TPTZ工作液2.4mL，混勻后37℃避光反應(yīng)10min，593nm測定吸光度，并根據(jù)FeSO4濃度與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣本總氧化還原能力測定：準(zhǔn)確稱取蕈狀芽孢桿菌乙酸乙酯提取物0.1g，用10mL乙醇溶解，得到10g/L提取物母液。用無水乙醇將提取物母液梯度稀釋為5g/L，2.5g/L，1g/L，0.5g/L，0.25g/L，0.1g/L，0.05g/L，0.025g/L濃度的待測液。精確吸取待測樣液0.1mL，加入TPTZ工作液2.4mL，37℃條件下水浴10min，于593nm處測定吸光度為實(shí)驗(yàn)組。同時，以無水乙醇代替TPTZ工作液分別與不同濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，所得吸光度為對照組吸光度。根據(jù)FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線求得1.0mmol/L標(biāo)準(zhǔn)FeSO4和TPTZ工作液反應(yīng)，所得吸光度為標(biāo)準(zhǔn)組吸光度[15]。

FRAP值計(jì)算：

FRAP=（Ai-Aj）/Ao

其中，Ai為實(shí)驗(yàn)組吸光度；Aj為對照吸光度；Ao為標(biāo)準(zhǔn)吸光度。

2.結(jié)果與分析

(1)DPPH自由基清除率

①DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線

DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示DPPH溶液在0.05mg/L-5mg/L濃度范圍內(nèi)，濃度與清除率呈現(xiàn)良好的正相關(guān)關(guān)系，其回歸方程y=-5.5084x2+45.365x-4.8754，相關(guān)系數(shù)R2=0.9842，如圖1。

圖1

②DPPH自由基清除率測定結(jié)果

蕈狀芽孢桿菌乙酸乙酯粗提取物具有良好的清除DPPH自由基的能力，且隨著樣品濃度的升高，清除能力增加。提取物質(zhì)量濃度0.025g/L到10g/L之間，DPPH自由基清除率從（2.23±0.01%）增加到（95.74±0.02%）。樣品的IC50為1.395g/L是Vit C的0.0717%（Vit C的IC50為0.001g/L），如圖2。

圖2 DPPH自由基清除率的測定結(jié)果

(2)ABTS法測定

①ABTS自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線

ABTS自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示ABTS溶液在0.25mg/L-10mg/L濃度范圍內(nèi)，濃度與清除率呈現(xiàn)良好的正相關(guān)關(guān)系，其回歸方程y=0.602x2+1.1322x，相關(guān)系數(shù)R2=0.9766，如圖3。

圖3 ABTS自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線

②ABTS自由基清除率測定結(jié)果

蕈狀芽孢桿菌乙酸乙酯粗提取物對ABTS自由基的清除率隨濃度升高明顯的增加。在試驗(yàn)濃度0.025g/L到0.5g/L濃度范圍內(nèi)，當(dāng)濃度為0.025g/L時，清除率可達(dá)（23.76±0.0055%），濃度為0.5g/L時，清除率高達(dá)（88.30±0.0018%）。樣品的IC50為0.0830g/L，為Vit C的9.639%（Vit C的IC50為0.008g/L），蕈狀芽孢桿菌粗提物具有較好的清除效果，如圖4。

圖4 ABTS自由基清除率的測定結(jié)果

(3)總抗氧化能力(FRAP法)測定結(jié)果

①FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線

FeSO4溶液在0.1-1.6mmol/L范圍內(nèi)，與TPTZ工作液反應(yīng)，其濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的正相關(guān)關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-0.0322x2+0.148x+0.0699，R2=0.9999，如圖5。

圖5 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

②蕈狀芽孢桿菌總抗氧化能力

蕈狀芽孢桿菌乙酸乙酯粗提物在試驗(yàn)濃度0.025g/L～10g/L下，總還原力隨著濃度的增加而升高，F(xiàn)RAP值從0.3267mmol/L增加到1.502mmol/L，如圖6。

圖6 FRAP總抗氧化能力的測定結(jié)果

3.結(jié)論與討論

(1)粗提液濃度不同影響抗氧化效果

低濃度抗氧化劑起抗氧化效果，高濃度抗氧化劑起促氧化效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在低濃度下蕈狀芽孢桿菌粗提物對自由基的清除率隨濃度的升高而上升，但當(dāng)清除率達(dá)到峰值后升高濃度，粗提物對自由基的清除率不升反降。2011年，《Cell》雜志就曾指出，低濃度自由基能刺激機(jī)體啟動保護(hù)機(jī)制，進(jìn)而提高機(jī)體抗氧化能力[17]。說明對于抗氧化劑使用的劑量越多對于自由基的清除效果并非越好，甚至Sesso等就曾證實(shí)Vit C和Vit E不僅不能有效的預(yù)防心血管疾病，Vit E甚至還會增加血性中風(fēng)的概率[18]。

(2)抗氧化微生物資源豐富

目前對于抗氧化微生物的篩選主要集中在高原、荒漠[19-20]、深海[21]等異質(zhì)性較強(qiáng)的生境中，在這樣極端的環(huán)境中的微生物就更容易受到氧化損傷，這也就更可能刺激在極端環(huán)境中存活的微生物形成了獨(dú)特抗逆機(jī)制來保護(hù)自身的生存和傳代。那在極端環(huán)境中就更有利于我們篩選出具有抗氧化性的微生物。云南西部地區(qū)受綜合地理因素影響，自然氣候景觀多種多樣，是亞洲地區(qū)生物多樣性最高的區(qū)域，所蘊(yùn)含微生物資源非常豐富。本研究自云南西部土壤中分離所得蕈狀芽孢桿菌的發(fā)酵液粗提物表現(xiàn)出很好的抗氧化能力，可進(jìn)一步探究其有效抗氧化分子及抗氧化機(jī)制，為開發(fā)新型、優(yōu)質(zhì)天然抗氧化及提供參考。