花生四烯酸對(duì)小鼠日本血吸蟲(chóng)病治療效果觀察

湯憲時(shí)，趙 松，熊春蓉，蔣甜甜，仝德勝，楊 坤

血吸蟲(chóng)病是世界范圍內(nèi)影響廣泛的寄生蟲(chóng)感染性疾病，尤其在發(fā)展中國(guó)家，受影響的人口高達(dá)8億人之多[5]。血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染人體引起，曼氏血吸蟲(chóng)、埃及血吸蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng)是3種主要感染人類的血吸蟲(chóng)類型，影響我國(guó)的主要是日本血吸蟲(chóng)[6]。

吡喹酮是大多數(shù)血吸蟲(chóng)病流行地區(qū)的首選藥物，在我國(guó)吡喹酮用于血吸蟲(chóng)病治療已逾數(shù)十年。然而，在非洲一些血吸蟲(chóng)病流行區(qū)出現(xiàn)了曼氏血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮耐藥的情況[7-8]，并有關(guān)于吡喹酮副作用的報(bào)道[9-11]。因此，研究開(kāi)發(fā)新的血吸蟲(chóng)病藥物，嘗試新的配伍用藥方法，以達(dá)到與吡喹酮類似或者更好的殺蟲(chóng)效果，對(duì)于延緩血吸蟲(chóng)抗藥性和血吸蟲(chóng)病防控具有現(xiàn)實(shí)意義。

花生四烯酸是一種ω-6脂肪酸，存在于細(xì)胞膜的磷脂中，是細(xì)胞膜脂質(zhì)必不可少的成分，它的4個(gè)雙鍵有助于保證分子自身的靈活性和細(xì)胞膜的流動(dòng)性[1-2]。花生四烯酸在大腦和肌肉中含量豐富，對(duì)腦、視網(wǎng)膜和其他組織的正常發(fā)育起重要作用?；ㄉ南┧嵋彩侨梭w合成二烯類前列腺素的前體物質(zhì)。作為人體必需脂肪酸，人體直接在飲食(瘦肉，蛋黃和某些魚(yú)油)中獲取花生四烯酸或者通過(guò)亞油酸體內(nèi)合成[3]。雖然從食物中攝取的花生四烯酸會(huì)在體內(nèi)通過(guò)環(huán)氧合酶、脂氧合酶和過(guò)氧化物酶被代謝為產(chǎn)生疼痛和炎癥的終產(chǎn)物(包括前列腺素、前列環(huán)素、血栓烷和白三烯)[2]，但是適量的外源性花生四烯酸攝入被證明是安全的，花生四烯酸已在美國(guó)和加拿大被納入配方食品中，以促進(jìn)新生兒的正常發(fā)育以及運(yùn)動(dòng)員的肌肉生長(zhǎng)[4]。體外和在體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明花生四烯酸對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)和埃及血吸蟲(chóng)有殺蟲(chóng)效果[12-13]，但花生四烯酸對(duì)日本血吸蟲(chóng)是否具有類似對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)和埃及血吸蟲(chóng)的殺蟲(chóng)作用，目前尚無(wú)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)研究報(bào)道。本文旨在探索花生四烯酸抗日本血吸蟲(chóng)的作用，為篩選抗日本血吸蟲(chóng)新藥物和新方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥品與蟲(chóng)株 花生四烯酸購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)：2006090131, 純度為99.4%，密度為0.922 g/mL；玉米油購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：8001-30-7；日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺由江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為5周齡雄性BALB/c小鼠(購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心), 體質(zhì)量為(22±2)g，10周齡雄性C57BL/6小鼠(購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心)體質(zhì)量為(24±2)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，晝夜循環(huán)條件下飼養(yǎng)，自由攝取食物和飲水。

1.2 方 法

1.2.1 藥液配制 將花生四烯酸溶于玉米油，配制成花生四烯酸溶液，灌胃小鼠，按照每只小鼠300 mg/kg計(jì)算給藥質(zhì)量，按照每只小鼠0.1 mL/kg計(jì)算給藥體積。

1.2.2 小鼠感染和分組

1.2.2.1 連續(xù)2 d給藥 將75只BALB/c小鼠飼養(yǎng)1周后，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)(40±1)條。分別于感染前3 d、感染后第3 d、第7 d、第14 d、第21 d和第35 d隨機(jī)選取7只小鼠進(jìn)行花生四烯酸灌胃預(yù)防或治療，連續(xù)灌胃2 d，作為給藥組。同時(shí)在各個(gè)給藥時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)選取7只小鼠以玉米油灌胃處理，連續(xù)灌胃2 d，作為溶劑組。最后剩余5只小鼠，不做任何處理，作為未處理組。

1.2.2.2 連續(xù)7 d給藥 取30只C57BL/6小鼠，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)(20±1)條。分別于感染后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d隨機(jī)選取5只小鼠進(jìn)行花生四烯酸灌胃治療，連續(xù)灌胃7 d，作為給藥組。同時(shí)在各個(gè)給藥時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)選取5只小鼠以玉米油灌胃處理，連續(xù)灌胃7 d，作為溶劑組。最后剩余5只小鼠，不做任何處理，作為未處理組。

1.2.3 樣本處理和數(shù)據(jù)計(jì)算

1.2.3.1 體內(nèi)血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān) 各組小鼠均于感染后第42 d解剖，取出小鼠肝臟和腸道，分別于小鼠腸系膜靜脈和肝臟門(mén)靜脈仔細(xì)檢查，收集蟲(chóng)體，置于生理鹽水中，解剖鏡下區(qū)分雌雄并計(jì)數(shù)成蟲(chóng)數(shù)量，減蟲(chóng)率以公式(對(duì)照組檢獲蟲(chóng)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組檢獲蟲(chóng)數(shù))/對(duì)照組檢獲蟲(chóng)數(shù)×100%。

1.2.3.2 肝內(nèi)蟲(chóng)卵負(fù)擔(dān) 肝臟稱重，用鑷子撕碎成均勻小塊，37 ℃于5% NaOH溶液消化12 h，攪拌器中攪拌30 s，進(jìn)一步打碎未完全消化的肝臟組織，依次經(jīng)過(guò)60目(孔徑0.3 mm)、80目(孔徑0.2 mm)、120目(孔徑0.125 mm)標(biāo)準(zhǔn)篩過(guò)濾，去除大顆粒雜質(zhì)，最后經(jīng)過(guò)600目(孔徑0.025 mm)尼龍網(wǎng)兜過(guò)濾，用4 ℃預(yù)冷1.2% NaCl溶液將留在網(wǎng)兜里的蟲(chóng)卵洗脫于離心管中，定容為50 mL。充分搖勻管內(nèi)蟲(chóng)卵，取50 μL蟲(chóng)卵懸液于顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲(chóng)卵，連續(xù)計(jì)數(shù)5次，推算50 mL溶液中的蟲(chóng)卵數(shù)量，即為該小鼠的肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)量。減卵率以公式(對(duì)照組肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)-實(shí)驗(yàn)組肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù))/對(duì)照組肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)輸入Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫(kù)、制作柱狀圖，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 連續(xù)2 d用藥對(duì)不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)的作用 詳見(jiàn)圖1。

① P<0.05

2.1.1 體內(nèi)血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān) 未處理組小鼠體內(nèi)的成蟲(chóng)數(shù)量為(30±2.828)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠體內(nèi)成蟲(chóng)數(shù)量分別為(19.14±5.409)、(25±4)、(21.4±5.276)、(15.66±5.467)、(17.33±2.808)、(14.57±5.473)；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組小鼠體內(nèi)成蟲(chóng)數(shù)量分別為(23.83±2.266)、(24.8±5.979)、(18.8±2.638)、(23.2±1.6)、(23.2±6.968)、(22.75±2.947)。第14 d和第35 d，給藥組小鼠體內(nèi)的成蟲(chóng)數(shù)量明顯低于溶劑組(第14 dt=0.024,P<0.05，第35 dt=0.033,P<0.05)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d服藥的給藥組減蟲(chóng)率分別為36.19%、16.66%、28.66%、47.77%、42.22%、51.42%；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組減蟲(chóng)率分別為20.55%、17.33%、37.33%、22.66%、22.66%、24.16%,見(jiàn)圖2。

① P<0.01

2.1.2 肝內(nèi)蟲(chóng)卵負(fù)擔(dān) 未處理組小鼠每克肝臟含蟲(chóng)卵數(shù)為(13 721±2 084)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠每克肝臟含蟲(chóng)卵數(shù)分別為(4 032±394)、(34 193±2 400)、(21 525±2 703)、(21 495±594)、(43 335±816)、(31 175±289)；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組小鼠每克肝臟含蟲(chóng)卵數(shù)分別為(10 606±1 059)、(10 153±1 196)、(11 253±1 426)、(53 693±905)、(34 483±422)、(20 953±361)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的給藥組與溶劑組小鼠肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(感染前3 dt=1.967，P<0.01)(感染后第3 dt=2.875，P<0.01)(感染后第7 dt=3.383E-06，P<0.01)(感染后第14 dt=0.000 010 1，P<0.01)(感染后第21 dt=0.0248，P<0.05)(感染后第35 dt=0.000 125，P<0.01)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d服藥的給藥組減卵率分別為70.6%、-149.19%、-56.86%、84.33%、68.41%、77.28%；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組減卵率分別為22.7%、26%、17.98%、60.86%、74.86%、84.73%。

2.2 連續(xù)7 d用藥對(duì)不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)的作用 見(jiàn)圖3。

① P<0.05

2.2.1 體內(nèi)血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān) 未處理組小鼠體內(nèi)的成蟲(chóng)數(shù)量為，(13.62±2.912)。感染后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠體內(nèi)成蟲(chóng)數(shù)量分別為6±3.674、9±1.264、9.5±2.958、10±2.449、8±2.898；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組小鼠體內(nèi)成蟲(chóng)數(shù)量分別為9.66±0.471、7.56±4.092、6.66±1.885、8.66±2.494、13.33±1.885。只有第28 d給藥組小鼠體內(nèi)的成蟲(chóng)數(shù)量明顯低于溶劑組(t=0.048 7,P<0.05)。感染后第1、7、14、21、28 d服藥的給藥組減蟲(chóng)率分別為55.96%、33.94%、30.27%、26.6%、41.28%；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組減蟲(chóng)率分別為29.05%、44.95%、51.07%、36.39%、2.14%, 見(jiàn)圖4。

① P<0.01

2.2.2 肝內(nèi)蟲(chóng)卵負(fù)擔(dān) 未處理組小鼠每克肝臟含蟲(chóng)卵數(shù)為(19 733±1 173)。感染后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠每克肝臟含蟲(chóng)卵數(shù)分別為(2 500±677)、(3 963±1 099)、(11 644±938)、(75 524±1 163)、(55 464±234)；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組小鼠每克肝臟含蟲(chóng)卵數(shù)分別為(6 493±1 244)、(7 347±916)、(7 014±453)、(8 385±695)、(10 542±583)。第21 d給藥除外，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的給藥組與溶劑組小鼠肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(第1 dt=0.000 022 8，P<0.01)(第7 dt=0.000 094 2，P<0.01)(第14 dt=8.916 9×10-6，P<0.01)(第28 dt=1.034 8×10-7，P<0.01)。感染后第1、7、14、21、28 d服藥的給藥組減卵率分別為87.33%、79.91%、40.98%、61.72%、71.89%；在上述給藥時(shí)間點(diǎn)灌服玉米油的溶劑組減卵率分別為67.09%、62.76%、64.45%、57.5%、46.57%。

3 討 論

花生四烯酸已被用于曼氏血吸蟲(chóng)病和埃及血吸蟲(chóng)病的防治。花生四烯酸的殺蟲(chóng)的機(jī)制被認(rèn)為是激活與血吸蟲(chóng)軀體表皮結(jié)合的中性鞘磷脂酶(nSMase)[14-15]，導(dǎo)致血吸蟲(chóng)鞘磷脂水解為神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿[16-17]，神經(jīng)酰胺引起血吸蟲(chóng)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層流動(dòng)性、通透性和完整性的急劇變化[18]，最后導(dǎo)致血吸蟲(chóng)損傷和死亡。掃描和透射電子顯微鏡印證，經(jīng)花生四烯酸作用后的蟲(chóng)體出現(xiàn)細(xì)胞膜起泡和細(xì)胞膜根尖部結(jié)構(gòu)紊亂[12]。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞會(huì)暴露寄生蟲(chóng)體表抗原，增加其與宿主抗體結(jié)合概率，最終導(dǎo)致發(fā)育中的血吸蟲(chóng)和成蟲(chóng)體表破損，甚至死亡[19-20]。已有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)導(dǎo)連續(xù)15 d每天給小鼠喂飼含約300 mg/kg ARA的嬰兒配方奶粉，可使曼氏血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān)降低60%，可使埃及血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān)降低80%。在任何接受ARA治療的小鼠中均未觀察到不良反應(yīng)[12]。曼氏血吸蟲(chóng)感染的學(xué)齡兒童接受ARA(10 mg/kg·d-1)，共15 d)治療，治愈率分別為78%和85%，與PZQ配伍使用，治愈率可達(dá)100%[21]。

本研究證明日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)對(duì)300 mg/kg花生四烯酸敏感。自感染后第35 d開(kāi)始連續(xù)給藥2 d，可使Balb/c小鼠血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān)下降約50%；自感染后第28 d開(kāi)始連續(xù)給藥7 d，可使C57小鼠血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān)下降約40%。這與一次性口服ARA治療使小鼠體內(nèi)曼氏和埃及血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān)下降31.2%至39.3%[13]的報(bào)導(dǎo)類似。兩個(gè)給藥組小鼠肝內(nèi)蟲(chóng)卵負(fù)擔(dān)降低均超過(guò)70%，進(jìn)一步印證了花生四烯酸對(duì)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的殺蟲(chóng)作用。連續(xù)用藥7 d的減蟲(chóng)率低于連續(xù)用藥2 d的原因，可能是用藥時(shí)間越靠后，蟲(chóng)體越成熟，花生四烯酸對(duì)蟲(chóng)體的破壞作用越顯著；也可能由于小鼠品系不同，藥物在小鼠體內(nèi)代謝有差異。

雖然有體外實(shí)驗(yàn)證明花生四烯酸可以對(duì)曼氏和埃及血吸蟲(chóng)(包括幼蟲(chóng)，童蟲(chóng)和成蟲(chóng)階段在內(nèi)的)所有發(fā)育階段造成不可逆的損傷[12]，但是本研究發(fā)現(xiàn)300 mg/kg花生四烯酸對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的殺蟲(chóng)效果存在差異性。在感染后的前7 d內(nèi)，于第3 d、第7 d連續(xù)2 d用藥，花生四烯酸的殺蟲(chóng)效果與溶劑玉米油沒(méi)有明顯差別；而從感染后第1 d起連續(xù)7 d用藥，雖然用藥組的減蟲(chóng)率有高于溶劑組的趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相反地，在感染后第14 d連續(xù)2 d用藥，花生四烯酸的殺蟲(chóng)率顯著高于溶劑玉米油(P<0.05)，殺蟲(chóng)率達(dá)到47%；而分別從感染后第7 d、第14 d和第21 d起連續(xù)7 d用藥，花生四烯酸的殺蟲(chóng)效果與溶劑玉米油的殺蟲(chóng)效果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)。因此，本研究不能證明300 mg/kg花生四烯酸對(duì)日本血吸蟲(chóng)的童蟲(chóng)有特異性殺傷作用。同時(shí)，與未處理組相比，感染前3 d預(yù)防用藥可以降低小鼠體內(nèi)血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān)，但是與溶劑組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同樣不能證明300 mg/kg花生四烯酸對(duì)鉆入皮膚的尾蚴有特異性抑制作用。

與未處理組相比，本研究中使用的溶劑玉米油具有殺蟲(chóng)效果。在不同的時(shí)間點(diǎn)連續(xù)2 d給予溶劑，各個(gè)溶劑組的減蟲(chóng)率可達(dá)到20%～30%，在增加連續(xù)給藥至7 d，玉米油的殺蟲(chóng)率進(jìn)一步增加到30%～40%(感染后第35 d給溶劑除外)。玉米油的殺蟲(chóng)作用的可能源于玉米油中含有一定濃度包括花生四烯酸在內(nèi)的不飽和脂肪酸，因此，在本研究中只有顯著超過(guò)溶劑組殺蟲(chóng)率的用藥組，才會(huì)被認(rèn)為有特異性殺蟲(chóng)效果。

本研究中各組小鼠肝內(nèi)蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)組間差異較大，這可能與蟲(chóng)卵收集等實(shí)驗(yàn)操作引入的誤差有關(guān)，例如，肝臟消化、攪拌打碎以及蟲(chóng)卵過(guò)濾和計(jì)數(shù)等步驟可能為蟲(chóng)卵數(shù)量計(jì)算引入誤差。因此，肝內(nèi)蟲(chóng)卵負(fù)擔(dān)只能間接和粗略地反映小鼠體內(nèi)成蟲(chóng)數(shù)量的差異和變化，作為驗(yàn)證小鼠體內(nèi)血吸蟲(chóng)負(fù)擔(dān)的輔助指標(biāo)。

本研究證明花生四烯酸對(duì)抑制日本血吸蟲(chóng)同樣有效。灌服300 mg/kg花生四烯酸可對(duì)成蟲(chóng)期(28～35 d)日本血吸蟲(chóng)造成有效損傷，使小鼠體內(nèi)血吸蟲(chóng)負(fù)荷降低超過(guò)40%，相應(yīng)地，小鼠肝內(nèi)蟲(chóng)卵負(fù)荷也有明顯降低(超過(guò)70%)，證明花生四烯酸具有被用于日本血吸蟲(chóng)藥物治療的潛力。在本研究基礎(chǔ)上，改變花生四烯酸用藥劑量和用藥時(shí)長(zhǎng)、增加配伍用藥選擇，將更深入全面地了解花生四烯酸抗日本血吸蟲(chóng)作用，同時(shí)獲得更好的殺蟲(chóng)效果和更廣闊的應(yīng)用前景。

利益沖突：無(wú)