細粒棘球絳蟲TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

王冰潔，趙 莉，班萬里，段蘭利，陳云英，張壯志

囊型包蟲病(CE)即細粒棘球蚴病，是由細粒棘球絳蟲幼蟲(棘球蚴)引起的一種慢性人獸共患病[1]。病變可使鄰近器官組織萎縮及功能障礙，病變包囊一旦破裂，可引起過敏反應(yīng)，甚至死亡，嚴重威脅了公共安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)，影響社會經(jīng)濟發(fā)展[2]。鑒于該病的廣泛流行和嚴重程度，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其作為17種被忽視的疾病之一納入2020年戰(zhàn)略路線圖[3]。在我國，幾乎所有省(直轄市、自治區(qū))都有該病的報告，尤以新疆、寧夏、青海、甘肅、陜西、西藏、四川、云南、內(nèi)蒙古等地區(qū)最為嚴重[4]。據(jù)統(tǒng)計，全國每年患包蟲病的牛、羊在5 000萬頭(只)以上，造成的經(jīng)濟損失超過30億元，推算患病人數(shù)為166 098例[4-5]，包蟲病仍是世界范圍內(nèi)引起家畜發(fā)病和死亡的重要原因之一。因此及時、準確地監(jiān)測囊型包蟲病，對控制該病的流行、綜合防控措施的實施和防治效果的評價等都具有十分重要的意義。

目前，用于囊型包蟲病的檢測方法主要有4類，其中影像學(xué)檢測是該病檢測的首選，但難以區(qū)分病變包囊和腫瘤；病原學(xué)檢測是確診該病的經(jīng)典方法，但對實驗人員專業(yè)知識和技術(shù)要求較高；免疫學(xué)檢測在早期檢測中發(fā)揮重要作用，但無法避免假陽性結(jié)果[6-7]；分子生物學(xué)檢測是從基因水平對病原進行檢測的方法，具有特異、敏感等優(yōu)點，目前已用于包蟲病特異基因篩選等方面的研究[8-9]。本研究以細粒棘球絳蟲線粒體基因的特異性引物和探針建立起了用于囊型包蟲病檢測的熒光定量PCR方法，以便快速、準確的區(qū)分Eg，并將其應(yīng)用于Eg的大規(guī)模監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 道德申明 本研究獲得了新疆畜牧科學(xué)院倫理委員會的批準(批準號20130319-07)，所有動物均按照中華人民共和國動物倫理程序和指南進行處理。

1.2 蟲株及臨床樣本 細粒棘球蚴(cystic echinococcus)、細粒棘球絳蟲(Eg)、多房棘球蚴(alveolar echinococcus)、多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，Em)、腦多頭蚴(Coenuruscerebralis，Cc)、多頭多頭絳蟲(Multicepsmulticeps，Mm)、細頸囊尾蚴(Cysticercustenuicollis，Ct)、泡狀帶絳蟲(Taeniahydatigena，Th)及犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis，Tc)蟲株均由本實驗室分離保存。臨床樣本(牛/羊肝、肺包囊、犬腸道寄生蟲體)由本實驗室在伊犁昭蘇縣采集，樣本詳細信息見表1。

表1 臨床樣本信息

1.3 主要試劑 瓊脂糖、2×SuperReal PreMix(Probe)、血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、GoldenViewTM核酸染料、DL2000 Marker、pMD19-T、Taq DNA聚合酶等購自新疆寶信生物工程有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 引物及探針的設(shè)計與合成 針對Eg線粒體基因保守區(qū)，使用Oligo 6.0軟件設(shè)計特異性引物和探針。Eg-F：5′-GCAGGTTACTTTGATATAGTAAATTGTG-3′；Eg-R：5′-CCACAATTAAAA-AAATAAATAAC-3′；Eg-P：5′-(FAM)ATACTATGGTCCATATATCTATATTAAGAGCTG-AG(TAMRA)-3′，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.4.2 重組質(zhì)粒標準品的制備 提取Eg陽性樣本DNA并進行常規(guī)PCR擴增，擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)，篩選陽性菌落并擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進行PCR鑒定、測序及序列分析，根據(jù)序列分析結(jié)果選擇正確的重組質(zhì)粒作為標準品，測定重組質(zhì)粒的濃度，并換算成拷貝數(shù)。

1.4.3 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化 通過矩陣法篩選反應(yīng)體系中引物和探針的最適濃度組合，并確定PCR反應(yīng)的退火-延伸溫度、反應(yīng)時間及循環(huán)數(shù)。

1.4.4 標準曲線的建立及敏感性試驗 10倍梯度稀釋已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒標準品，得到109拷貝/μL～100拷貝/μL共10個稀釋度的質(zhì)粒模板，每個稀釋度做3個復(fù)孔，建立熒光定量PCR標準曲線并確定該方法的最低檢出限。

1.4.5 特異性試驗 按照建立的熒光定量PCR檢測方法對提取的Eg、Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena及T.canis陽性樣本DNA進行檢測，判定該方法的特異性。

1.4.6 重復(fù)性試驗 選取107～103拷貝/μL的標準品進行重復(fù)檢測，比較同一濃度梯度的標準品在重復(fù)檢測中的擴增曲線與Ct值之間有無統(tǒng)計學(xué)差異，確定該方法的穩(wěn)定性。

1.4.7 臨床樣本的檢測 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法、常規(guī)PCR方法和病原學(xué)方法對從伊犁昭蘇縣采集的50份疑似感染細粒棘球蚴或細粒棘球絳蟲的臨床樣本(表1)進行檢測，比較三者的敏感性和符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標準品的鑒定 提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增，得到長度約為187 bp的目的片段(圖1)，測序比對后確定為細粒棘球絳蟲線粒體基因，表明標準陽性重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMD19-T-Eg，質(zhì)粒濃度經(jīng)測定為100 μg/mL。

M：DNA Marker(DL2000)；1：PCR products of recombinant plasmids；2：Negative control

2.2 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后，確定最佳反應(yīng)體系為(20 μL)：2×SuperReal PreMix(Probe)10 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各0.5 μL，探針(10 μmoL/L)0.25 μL，模板DNA 1 μL，滅菌ddH2O 7.75 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)，同時收集熒光信號。

2.3 標準曲線及敏感性試驗結(jié)果 以109拷貝/μL～100拷貝/μL的重組質(zhì)粒標準品為模板進行熒光定量PCR擴增，獲得擴增動力學(xué)曲線(圖2)和標準曲線(圖3)。從圖中可以看出建立的方法可以檢測出的標準品最低濃度為102拷貝/μL，建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明建立的方法靈敏度高、誤差小。

1～10：109 copies/μL～100 copies/μL；11：Negative control

圖3 Eg實時熒光定量PCR的標準曲線

2.4 特異性試驗結(jié)果 以Eg、Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena及T.canis陽性樣本DNA為模板，進行熒光定量PCR擴增，只有細粒棘球蚴和細粒棘球絳蟲出現(xiàn)良好的擴增曲線(圖4)，表明建立的方法特異性較好。

1：cystic echinococcus；2：Echinococcus granulosus(107 copies/μL)；3；Eg standard plasmids；4：alveolar echinococcus；5：Echinococcus multilocularis；6：Coenurus cerebralis；7：Multiceps multiceps；8：Cysticercus tenuicollis；9；Taenia hydatigena；10：Toxocara canis；11：Negative control

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果 用107拷貝/μL～103拷貝/μL的標準品進行的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗，變異系數(shù)均小于3%(表2)，表明建立的方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

表2 實時熒光定量PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果 對采集自伊犁昭蘇縣的50份臨床樣本(表1)分別用熒光定量PCR方法、常規(guī)PCR方法和病原學(xué)方法進行檢測，熒光定量PCR檢測的陽性率為12%(6/50)，常規(guī)PCR為8%(4/50)，病原學(xué)為12%(6/50)，三者陽性符合率為100%。

3 討 論

我國是囊型包蟲病的高度流行區(qū)，流行區(qū)面積達全國總面積的46%[10]。近年來，隨著我國經(jīng)濟的高速發(fā)展，動物疫病防治工作面臨著前所未有的挑戰(zhàn)，快速、高通量檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用是開展國家動物疫情監(jiān)測、有效實施風(fēng)險分析、加強動物疫病管理和進行市場監(jiān)督的重要手段。熒光定量PCR作為一種快速、準確、高效的檢測方法，可實現(xiàn)多個樣品的自動化檢測，檢測時間較普通PCR短且污染少，已經(jīng)成為實驗室檢測病原的主要手段之一[11]。目前熒光定量PCR方法主要包括染料法(如：SYBR Green染料)和探針法(如TaqMan和MGB探針等)，雖然染料法成本比探針法低，但探針法特異性好，在臨床檢測中有著突出優(yōu)勢[12-13]。

因此，本研究基于細粒棘球絳蟲線粒體基因保守區(qū)設(shè)計了特異性引物和探針，建立了用于檢測該病的熒光定量PCR方法。該方法獲得的標準曲線線性關(guān)系好，在109～102拷貝/μL相關(guān)系數(shù)達0.998，靈敏度達102拷貝/μL，與其他病原(Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena、T.canis)不存在交叉反應(yīng)，組內(nèi)和組間變異系數(shù)較小(<3%)，說明該方法靈敏度高、特異性強、重復(fù)性和穩(wěn)定性好。在臨床樣品檢測試驗中，能成功地檢測出Eg，且與普通PCR方法相比，檢出率明顯提高，檢測時間明顯縮短，說明本研究建立的方法可以對囊型包蟲病病原進行檢測，及時發(fā)現(xiàn)傳染源，對該病的防控具有重要意義。

利益沖突：無