原位合成銅基金屬有機(jī)框架差分脈沖伏安法快速檢測(cè)肉制品中亞硝酸鹽

徐藝偉，朱 丹，石吉勇，張 文，王 鑫，劉 超，李文亭，鄒小波

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

亞硝酸鹽作為食品添加劑，被廣泛應(yīng)用于培根、火腿和香腸等肉制品中，具有發(fā)色、防腐和增強(qiáng)風(fēng)味的作用[1]。亞硝酸鹽被人體攝入，在胃酸環(huán)境中，能夠與體內(nèi)的胺類物質(zhì)作用，生成亞硝基化合物[2]，該化合物是強(qiáng)致癌物質(zhì)[3]。當(dāng)亞硝酸鹽經(jīng)消化道吸收進(jìn)入血液，能夠?qū)⒌丸F血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，降低血紅蛋白運(yùn)輸和釋放氧的功能，導(dǎo)致組織缺氧，形成高鐵血紅蛋白血癥[4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于肉制品中亞硝酸鹽的含量都有嚴(yán)格限制，亞硝酸鹽含量是肉制品衛(wèi)生檢疫中必檢項(xiàng)目。因此，開(kāi)發(fā)肉制品中亞硝酸鹽的快速檢測(cè)方法，對(duì)于保障消費(fèi)者食用安全具有重要意義。

食品中亞硝酸鹽檢測(cè)方法主要有分光光度法[5]、色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、電化學(xué)法等[8]。其中，電化學(xué)方法具有設(shè)備便攜、操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)[9]，在亞硝酸鹽檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。NO-2中的氮原子化合價(jià)為正3價(jià)的中間價(jià)態(tài)，既有還原性又具備強(qiáng)氧化性，能夠在電位作用的同時(shí)，在電極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移[11]。在低電位作用時(shí)，NO-2可以獲得電子，發(fā)生還原反應(yīng)生成NO；在高電位作用時(shí)，NO-2將失去電子，發(fā)生氧化反應(yīng)生成NO2[12]。依據(jù)電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)NO-2濃度的測(cè)定[13]?；贜O-2的反應(yīng)原理，在電極表面修飾具有催化NO-2氧化或還原的功能性材料，可有效增強(qiáng)電流信號(hào)，提高傳感器的靈敏度[14]。辣根過(guò)氧化物酶可催化NO-2氧化，常被用于開(kāi)發(fā)電化學(xué)傳感器[15]。然而，由于酶的生物屬性，這些傳感器的性能往往受到酶活性和穩(wěn)定性的限制[16]。

金屬-有機(jī)骨架材料（metal-organic frameworks，MOFs）是金屬離子與有機(jī)配體通過(guò)自組裝形成的具有三維結(jié)構(gòu)的晶體材料[17]。近年來(lái)，MOFs材料被發(fā)現(xiàn)具有模擬酶活性[18]，與天然酶相比具備許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如催化性能穩(wěn)定、不易失活、成本低廉、易保存等[19]。MOFs材料的合成方法主要包括水熱法、機(jī)械法、擴(kuò)散法、微波輔助法以及電化學(xué)法等[20]。其中電化學(xué)合成法能夠在電極表面原位生成目標(biāo)產(chǎn)物[21]，無(wú)需使用黏合劑固定，方便用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建[22]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電化學(xué)法原位合成銅基金屬有機(jī)框架（Cu-based metal organic frameworks，Cu-MOFs），制備用于肉制品中亞硝酸鹽檢測(cè)的電化學(xué)傳感器。首先，采用電沉積方法在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）表面修飾1 層致密且均勻的銅膜；然后，利用堿性氧化作用，將電極表面的銅轉(zhuǎn)化為Cu(OH)2；最后，使用交聯(lián)劑將Cu(OH)2轉(zhuǎn)化為Cu-MOFs。電化學(xué)原位合成方法制備Cu-MOFs具有反應(yīng)速度快、反應(yīng)條件溫和、化學(xué)試劑消耗少等優(yōu)勢(shì)。Cu-MOFs能夠催化NO-2氧化，可有效增強(qiáng)NO-2的電流信號(hào)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸銅、硫酸銨、過(guò)硫酸銨、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、1,3,5-苯三甲酸（1,3,5-benzenetricarboxylic acid，H3BTC）、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三水亞鐵氰化鉀等試劑（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度100 mg/L） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI600D電化學(xué)工作站、GCE（直徑3 mm）、Ag/AgCl電極、鉑絲電極 上海辰華儀器有限公司；JSM-7001F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Jeol公司；BSA224S-CW分析天平 德國(guó)Sartorius公司；微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；KQ-100KDE型超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 電化學(xué)傳感器制備

電極預(yù)處理：將GCE依次用粒徑為1.00、0.30、0.05 μm的氧化鋁粉末，在拋光絨布上拋光呈鏡面，然后在無(wú)水乙醇和去離子水中分別超聲處理5 min清除殘留的氧化鋁，并用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

電沉積制備Cu/GCE[23]：分別稱取0.000 1 mol的硫酸銅和0.005 mol的硫酸銨放入同一燒杯中，加入10 mL的水溶解，配制電解質(zhì)溶液。將預(yù)處理的GCE作為工作電極，浸入10 mL已經(jīng)配制好的電解質(zhì)溶液中，在-0.3 V（vsAg/AgCl）的恒電位中保持400 s。在該過(guò)程中，溶液中的銅離子在電位作用時(shí)被還原為銅單質(zhì)而沉積在電極表面，形成1 層均勻、致密且附著性好的銅膜，由此獲得Cu/GCE。

Cu/GCE轉(zhuǎn)變?yōu)镃u(OH)2/GCE[24]：將Cu/GCE浸入濃度3 mol/L的氫氧化鈉溶液，并施加0.2 mA的恒定電流保持180 s。在該過(guò)程中，電極表面的銅在堿性氧化作用中轉(zhuǎn)變?yōu)镃u(OH)2，獲得Cu(OH)2/GCE。

Cu(OH)2/GCE轉(zhuǎn)變?yōu)镃u-MOFs/GCE[25]：稱取0.1 g的H3BTC與4.7 mL無(wú)水乙醇和1.8 mL的去離子水混合，超聲處理5 min，配制交聯(lián)劑溶液。將Cu(OH)2/GCE浸入到交聯(lián)劑溶液中保持240 s，電極表面的Cu(OH)2在交聯(lián)劑H3BTC的作用中轉(zhuǎn)變?yōu)镃u-MOFs，獲得Cu-MOFs/GCE。

1.3.2 電化學(xué)檢測(cè)NO-2

通過(guò)差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV），以0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 7）為電解質(zhì)，獲得NO2-的電流信號(hào)[26]。DPV參數(shù)：初始電位0.3 V，終止電位1.2 V，步進(jìn)電位5 mV，振幅0.05 V，脈沖寬度0.05 s，采樣寬度0.016 7 s，脈沖周期0.05 s。

采用循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法分別設(shè)置不同的掃描速率（20、40、60、80、100 mV/s），觀察NO-2在Cu-MOFs/GCE表面的電化學(xué)行為。CV電位范圍為0.3～1.2 V，NO2-的濃度為100 μmol/L，電解質(zhì)為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 7）。

1.3.3 電極的選擇性和穩(wěn)定性

選擇食品中常見(jiàn)的離子（包括Na+、K+、Ca2+、作為干擾物質(zhì)代表。分別取上述離子1 mmol/L加入到100 μmol/L的NO-2溶液中，使用Cu-MOFs/GCE，通過(guò)DPV法獲得伏安曲線，以NO-2的氧化峰電流強(qiáng)度為指標(biāo)，評(píng)估Cu-MOFs/GCE的選擇性及抗干擾能力。

為了考察Cu-MOFs/GCE的穩(wěn)定性，將制備的Cu-MOFs/GCE置于密閉環(huán)境中，在25 ℃左右的室溫保存，并使用該電極對(duì)100 μmol/L的NO-2進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)7 d記錄每天獲得的伏安曲線。

1.3.4 肉制品檢測(cè)

購(gòu)買(mǎi)培根、火腿腸、醬牛肉和豬肉脯共4 種常見(jiàn)肉制品作為待測(cè)樣品。首先，使用料理機(jī)分別將每種樣品攪碎混勻；其次，準(zhǔn)確稱量5 g樣品放入錐形瓶中，加入80 mL水并超聲30 min，超聲過(guò)程中每隔3 min搖晃錐形瓶，使固態(tài)樣品完全分散；然后，將錐形瓶置于75 ℃的水浴鍋中，水浴加熱5 min，冷卻至室溫后，將樣品轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并加入純水定容至刻度；接著，將樣品溶液用濾紙過(guò)濾，濾液10 000 r/min離心15 min，取上清液備用；最后，將上清液用水系一次性針頭微孔濾膜過(guò)濾，使用C18柱純化，獲得樣品提取液。通過(guò)建立的電化學(xué)方法，使用Cu-MOF為工作電極，測(cè)定樣品提取液中亞硝酸鹽含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)信息輸入Origin軟件繪制圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾電極的形貌表征

電極修飾流程如圖1所示。首先，通過(guò)電化學(xué)還原電解液中的銅離子生成銅單質(zhì)，沉積在電極表面，電極表面會(huì)形成1 層黃色的銅膜；然后，利用堿性氧化作用，將電極表面的銅轉(zhuǎn)化為Cu(OH)2，可以看到電極表面由黃色變?yōu)樗{(lán)色；最后，使用交聯(lián)劑H3BTC將Cu(OH)2轉(zhuǎn)化為Cu-MOFs，可以觀察到電極表面由藍(lán)色變?yōu)樗{(lán)綠色。電極表面各修飾階段發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)依次為：

圖1 修飾電極的制備過(guò)程及其電極表面圖像Fig. 1 Flow chart for the preparation of the modified electrode and image of the electrode surface at each step

① Cu2++2e→Cu

② Cu+2OH--2e→Cu(OH)2

③ 3Cu(OH)2+2H3BTC→Cu3(BTC)2+6H2O

通過(guò)掃描電鏡觀察電極表面修飾的Cu、Cu(OH)2和Cu-MOFs的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示。采用電沉積在電極表面修飾的銅呈顆粒狀；經(jīng)堿性氧化處理，在銅粒子基底上生成的Cu(OH)2呈納米帶狀，納米帶相互交錯(cuò)隨機(jī)排列；利用交聯(lián)劑H3BTC將Cu(OH)2轉(zhuǎn)化為Cu-MOFs，生成的Cu-MOFs呈八面體結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果直觀證明了Cu-MOFs在電極表面被成功制備。

圖2 電極表面修飾的Cu（a）、Cu(OH)2（b）、Cu-MOFs（c、d）掃描電鏡圖Fig. 2 SEM images of modified Cu (a), Cu(OH)2 (b), Cu-MOFs (c, d)on the electrode surface

2.2 修飾電極對(duì)NO-2的電催化性能分析

采用DPV法收集NO-2在電極表面電化學(xué)行為的相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖3a所示。在空白的電解液中，GCE和Cu-MOFs/GCE獲得的伏安曲線均無(wú)明顯的氧化峰。當(dāng)電解液有NO-2存在，GCE和Cu-MOFs/GCE獲得的伏安曲線均在0.8 V左右處出現(xiàn)一個(gè)明顯的氧化峰，其原因?yàn)镹O-2在工作電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)。NO-2在電位作用時(shí)，失去電子生成NO2，NO2又發(fā)生均相的歧化反應(yīng)生成NO-3和NO-2。在含有100 μmol/L的NO-2的電解液中，GCE獲得的峰電流為2.02 μA，Cu-MOFs/GCE獲得的峰電流為4.76 μA，Cu-MOFs/GCE獲得的NO-2氧化峰電流是傳統(tǒng)GCE的2.36 倍。以上結(jié)果表明，電極表面修飾的Cu-MOFs能夠催化NO-2氧化反應(yīng)，增強(qiáng)電極的響應(yīng)信號(hào)，有利于提高NO-2檢測(cè)的靈敏度。

為了進(jìn)一步考察NO-2在Cu-MOFs/GCE電極表面的電化學(xué)行為，采用CV技術(shù)分別設(shè)置不同的掃描速率（20、40、60、80、100 mV/s），觀察NO-2氧化峰電流隨掃描速率的變化。從圖4可知，Cu-MOFs/GCE在NO-2的電解質(zhì)中獲得的峰電流強(qiáng)度隨掃描速率逐漸增加，峰電流強(qiáng)度與CV掃描速率呈良好的線性關(guān)系（R2=0.98），說(shuō)明NO-2在電極表面的電化學(xué)氧化反應(yīng)是表面控制過(guò)程[27]。

圖4 不同掃描速率時(shí)Cu-MOFs/GCE在含有100 μmol/L NO－2的電解質(zhì)中的循環(huán)伏安曲線（a）及對(duì)應(yīng)的線性擬合曲線（b）Fig. 4 Cyclic voltammograms (a) of Cu-MOFs/GCE in the electrolyte containing 100 μmol/L NO－2 at different scan rates and resulting calibration curve (b)

2.3 Cu-MOFs/GCE的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限

為了得到Cu-MOFs/GCE的線性工作范圍數(shù)據(jù)，通過(guò)DPV法獲得不同濃度NO-2的響應(yīng)信號(hào)。圖5a為Cu-MOFs/GCE檢測(cè)10、20、30、40、60、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、500、600、800、1 000、1 200 μmol/L NO-2獲得的伏安曲線，0.8 V處的氧化峰電流強(qiáng)度隨NO-2濃度增大而逐漸增加。以峰電流強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，NO-2濃度為橫坐標(biāo)，建立如圖5b所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在濃度10～1 200 μmol/L范圍內(nèi)，Cu-MOFs/GCE的峰電流強(qiáng)度與NO-2濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.033x+1.182，R2=0.99。依據(jù)3 倍信噪比計(jì)算，Cu-MOFs/GCE對(duì)NO-2的檢測(cè)限為1.57 μmol/L。與已報(bào)道的NO-2電化學(xué)傳感器相比[28-30]，Cu-MOFs/GCE具有檢測(cè)限低、靈敏度高、線性范圍寬、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。

2.4 Cu-MOFs/GCE的選擇性和穩(wěn)定性

在食品亞硝酸鹽檢測(cè)中，NO2-常與其他離子共存，因此需要對(duì)Cu-MOFs/GCE的選擇性進(jìn)行研究。選擇食品中常見(jiàn)的離子包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、作為干擾物質(zhì)代表。圖6a結(jié)果顯示，在NO-2溶液中添加這些離子，NO-2的氧化峰電流沒(méi)有明顯變化（小于5%），說(shuō)明Cu-MOFs/GCE具有良好的選擇性。

為了考察Cu-MOFs/GCE的穩(wěn)定性，采用DPV法連續(xù)記錄Cu-MOFs/GCE對(duì)100 μmol/L NO-2的響應(yīng)電流。圖6b結(jié)果顯示，Cu-MOFs/GCE獲得的電流信號(hào)隨使用時(shí)間延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镃u-MOFs/GCE在貯存過(guò)程的電極表面發(fā)生鈍化。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，在連續(xù)測(cè)量7 d后，Cu-MOFs/GCE的電流信號(hào)比初始電流響應(yīng)值僅降低了10%左右，說(shuō)明制備的Cu-MOFs/GCE具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 肉制品中亞硝酸鹽的檢測(cè)

采用電化學(xué)DPV法，以Cu-MOFs/GCE作為工作電極，采集肉制品樣品提取液中亞硝酸鹽的響應(yīng)信號(hào)，并結(jié)合多次標(biāo)準(zhǔn)加入法，獲得亞硝酸鹽濃度信息。結(jié)合樣品前處理方法，Cu-MOFs/GCE對(duì)肉制品中亞硝酸鹽的檢測(cè)限為2.17 mg/kg，遠(yuǎn)低于GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的最大殘留量30 mg/kg，因此該傳感器能夠滿足國(guó)標(biāo)限量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求。基于樣品提取液中亞硝酸鹽濃度，計(jì)算得到肉制品中亞硝酸鹽含量如表1所示，結(jié)果表明檢測(cè)的肉制品中以NaNO2計(jì)的亞硝酸鹽含量均低于GB 2760—2014規(guī)定的最大殘留量。為了驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)采用GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》規(guī)定的第二法（分光光度-鹽酸萘乙二胺法）對(duì)樣品中的亞硝酸鹽進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示這2 種方法獲得的檢測(cè)結(jié)果基本一致，相對(duì)誤差均低于10%。上述試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，基于Cu-MOFs/GCE的電化學(xué)方法，在肉制品亞硝酸鹽測(cè)定中具有較好的準(zhǔn)確性。

表1 肉制品中亞硝酸鹽檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of nitrite determination in different meat products

3 結(jié) 論

通過(guò)電化學(xué)法在電極表面原位合成Cu-MOFs，制備了用于肉制品中亞硝酸鹽檢測(cè)的電化學(xué)傳感器。電極表面修飾的Cu-MOFs對(duì)電化學(xué)氧化NO-2反應(yīng)具有催化作用，能夠增強(qiáng)電極對(duì)NO-2的響應(yīng)信號(hào)。以Cu-MOFs/GCE為工作電極，通過(guò)DPV法對(duì)NO-2進(jìn)行測(cè)定，線性工作范圍為10～1 200 μmol/L，檢測(cè)限為1.57 μmol/L，且該修飾電極具有良好的選擇性和穩(wěn)定性。使用Cu-MOFs/GCE檢測(cè)肉制品中亞硝酸鹽，結(jié)果顯示該電極獲得的檢測(cè)結(jié)果與鹽酸萘乙二胺法的結(jié)果基本一致，相對(duì)誤差低于10%，證明該修飾電極可以用于肉制品中亞硝酸鹽的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了基于Cu-MOFs的電化學(xué)傳感器，建立了肉制品中亞硝酸鹽的快速檢測(cè)方法，為食品亞硝酸鹽檢測(cè)提供了新思路。