牛肉、牛奶中可的松和氫化可的松含量分析

楊 奕，尹 杰，楊蘊(yùn)嘉，張 晶

（北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013）

激素類物質(zhì)是調(diào)節(jié)機(jī)體正常生長、發(fā)育、生殖等重要生命活動的關(guān)鍵生物活性成分。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，激素可分為肽類、氨基酸類、胺類和類固醇類。類固醇類激素又包括腎上腺皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇、醛固酮等）和性激素（雌激素、孕激素及雄激素等）。在動物食品安全領(lǐng)域，激素類藥物的殘留是消費(fèi)者最為關(guān)注的議題；另一方面，動物組織中會天然存在一些自身細(xì)胞合成和分泌、調(diào)節(jié)生理活動的內(nèi)源性激素物質(zhì)，如同屬于糖皮質(zhì)激素的氫化可的松和可的松[1-3]。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定可的松可以在馬、牛、豬、羊4 種動物的飼養(yǎng)過程中使用，氫化可的松可以在所有動物飼養(yǎng)中使用但僅限于外用，并且可的松和氫化可的松均不需要制定最大殘留限量[4]。然而，歐盟和加拿大規(guī)定牛奶和羊奶中氫化可的松的殘留限量為10 μg/kg[5-6]。在我國的進(jìn)出口食品國際貿(mào)易中，食品中農(nóng)獸藥法規(guī)限量的差異可能導(dǎo)致食品退運(yùn)等問題，給我國食品出口企業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7-9]。有研究表明，盡管皮質(zhì)醇激素在生物體的正常生理活動中起到重要的調(diào)節(jié)作用，但是長期大劑量地使用皮質(zhì)醇激素會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、高血壓、肥胖、急性心肌梗死、感染等不良反應(yīng)[10-12]。因此，開展可的松和氫化可的松在主要食品中的含量水平研究，獲得這2 種化合物在牛奶等動物性食品中的存在水平，不僅對于保護(hù)消費(fèi)者健康具有重要意義，同時(shí)也對我國農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易具有重要的價(jià)值[13-15]。

現(xiàn)有國內(nèi)外文獻(xiàn)中，有關(guān)激素類藥物的檢測技術(shù)報(bào)道較多[16-27]，部分文獻(xiàn)也涉及到可的松和氫化可的松，但是這些研究多集中于分析方法本身，樣本監(jiān)測相對較少。Ma Lili等[28]檢測發(fā)現(xiàn)牛奶中氫化可的松的含量水平在2 μg/kg以下；Chiesa等[29]分析了原料乳樣品中多種激素的含量，得到可的松和氫化可的松的平均值分別為1.06 μg/L和2.56 μg/L。但是，以上研究均存在樣本量少等問題，不足以獲得動物體內(nèi)內(nèi)源性激素含量水平的閾值[30]。此外，由于不同產(chǎn)地牛在養(yǎng)殖過程中投喂的飼料不同，且飼養(yǎng)習(xí)慣也有所差異，可能會導(dǎo)致牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松含量不同。因此，本研究擬通過大量樣本采集，分析市售牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平，初步獲得兩類產(chǎn)品中可的松和氫化可的松的含量范圍，對不同產(chǎn)地的牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松含量進(jìn)行分析，旨在為動物性食品的安全保障提供技術(shù)支持及數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

可的松、氫化可的松、同位素內(nèi)標(biāo)氫化可的松-D3德國Dr. Ehrenstoffer公司；甲酸、乙酸、乙酸鈉（均為分析純） 美國百靈威公司；甲醇、乙腈（均為色譜級）美國Fisher公司；β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液美國羅氏公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；石墨化碳黑固相萃取柱（ENVI-CarbTM） 安譜集團(tuán)有限公司；氨基固相萃取柱、Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

試樣中的目標(biāo)化合物檢測采用GB/T 21891—2008《動物源性食品中的激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，主要步驟如下：稱取樣品5 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中。準(zhǔn)確加入100 μg/L氫化可的松-D3溶液100 μL和10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，混勻后再加入100 μL葡萄糖酸苷肽酶/磺酸酯酶溶液于37 ℃水浴搖床中酶解過夜，取出后再加入25 mL甲醇，超聲提取30 min。提取液ENVI-Carb固相萃取柱和氨基柱凈化，洗脫液并在微弱的氮?dú)饬飨麓蹈?，? mL甲醇-水（50∶50，V/V）溶解殘?jiān)蠙C(jī)測定。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器方法參數(shù)均參考GB/T 21891—2008。

1.2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2.5、5、10、20、50 μg/L和100 μg/L，均含有氫化可的松-D3同位素內(nèi)標(biāo)各10 μg/L。經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以目標(biāo)化合物的定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，待測組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制內(nèi)標(biāo)工作曲線。

在均質(zhì)的空白樣品中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中可的松、氫化可的松的加標(biāo)量分別為0.1、1 μg/kg和5 μg/kg，內(nèi)標(biāo)氫化可的松-D3均為2 μg/kg。每個(gè)水平設(shè)6 個(gè)平行，計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.3 樣品收集

采用方便抽樣的方法，在我國不同區(qū)域的城市超市、農(nóng)貿(mào)市場等地采集市售牛肉、牛奶樣品。所有樣品采集后立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃冷凍保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)分析前所有計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)判斷是否符合正態(tài)分布。對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，以描述；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用最大值、平均值、中位數(shù)和95百分?jǐn)?shù)（P95）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。采用Spearman秩相關(guān)性分析法對樣品中可的松和氫化可的松含量相關(guān)性進(jìn)行分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

對檢測方法開展實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法確證。結(jié)果表明，可的松和氫化可的松均在0.5～100 μg/L內(nèi)呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)r2大于0.999 3。2 種目標(biāo)化合物的檢出限均為0.04 μg/kg，定量限均為0.1 μg/kg（表1）。3 個(gè)加標(biāo)水平下，可的松和氫化可的松的回收率在83.6%～113.5%之間，RSD為2.4%～10.5%，表明該方法具有良好的線性、準(zhǔn)確度和精密度。

表1 可的松和氫化可的松的線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Calibration equation, LOD and LOQ for corstione and cortisol

2.2 樣品收集

本研究從浙江、湖南、山東、黑龍江、云南、陜西、四川、北京、寧夏等省、市、自治區(qū)的超市、農(nóng)貿(mào)市場采集牛肉樣品188 件和牛奶樣品158 件，共計(jì)346 件樣品。如圖1所示，采樣地點(diǎn)涵蓋了我國東北、華北、華東、西北、西南以及華中地區(qū)6大地理區(qū)域，具有一定代表性。此外，對本研究采集的346 件樣品的產(chǎn)地進(jìn)行分析，牛肉和牛奶的產(chǎn)地除了采集地以外，還涉及河北、安徽等地。

圖1 牛肉和牛奶樣品采集地和產(chǎn)地分布圖Fig. 1 Regional distribution of of beef and milk samples collected in this study

2.3 可的松和氫化可的松含量水平分析

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測346 件牛肉和牛奶樣本中可的松和氫化可的松的含量，將所有檢測結(jié)果小于檢出限視為未檢出，發(fā)現(xiàn)牛肉和牛奶中可的松的檢出率分別為88.8%和86.1%，氫化可的松的檢出率分別為99.5%和100%。參照世界衛(wèi)生組織有關(guān)膳食中污染物含量的統(tǒng)計(jì)方法[31]，在數(shù)據(jù)分析中對測定結(jié)果小于定量限的樣本按照0.5 倍定量限（0.05 μg/kg）進(jìn)行賦值，對測定結(jié)果小于檢出限的樣本按照0.5 倍檢出限（0.02 μg/kg）進(jìn)行賦值。

利用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)（W檢驗(yàn)）方法對賦值后的牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。牛肉中可的松和氫化可的松，以及牛奶中可的松含量正態(tài)性檢驗(yàn)的P值均小于0.05，呈非正態(tài)分布；而牛奶中氫化可的松含量的正態(tài)性檢驗(yàn)的P值大于0.05，呈正態(tài)分布。因此，本研究對牛肉中可的松和氫化可的松，以及牛奶中可的松含量的統(tǒng)計(jì)描述采用最大值、平均值、中位數(shù)和P95；對牛奶中氫化可的松含量的統(tǒng)計(jì)描述除采用上述指標(biāo)外，還計(jì)算了標(biāo)準(zhǔn)差。

表2 牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松含量的Shapiro-Wilk檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Shapiro-Wilk test of cortisone and cortisol contents in beef and milk

如表3所示，在188 件牛肉樣品中可的松含量的最大值為12.71 μg/kg，最小值為0.02 μg/kg，其平均值和中位值分別為1.69 μg/kg和1.14 μg/kg，P95為5.15 μg/kg。牛肉中氫化可的松含量在0.02～74.88 μg/kg之間，其平均值和中位值分別為12.16 μg/kg和8.14 μg/kg，P95為34.18 μg/kg。牛奶中可的松最高含量為1.80 μg/kg，最低含量為0.02 μg/kg，其平均值和中位值均為0.23 μg/kg，P95為0.40 μg/kg。然而，對于牛奶中的氫化可的松而言，由于其濃度值符合正態(tài)分布，因此用均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。結(jié)果表明，牛奶中氫化可的松含量為（0.72±0.35） μg/kg，P95為1.31 μg/kg。

表3 牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平Table 3 Cortiaone and cortisol contents in beef and milk samples μg/kg

由于激素是生物體內(nèi)天然存在的物質(zhì)，具有多種生理功能與生長發(fā)育密切相關(guān)，因此肉和奶等動物性食品中通常會含有一定量的皮質(zhì)醇激素等內(nèi)源性激素[21-25]。Ma Lili等[28]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測牛奶中12 種皮質(zhì)醇激素，在10 份牛奶樣本中只檢測到了氫化可的松，其含量為0.69～1.82 μg/kg。在另一項(xiàng)研究中，Chiesa等[29]分析了50 份牛奶樣品種多種激素的含量，得到可的松和氫化可的松在牛奶中含量的平均值分別為1.06 μg/L和2.56 μg/L。Goyon等[32]監(jiān)測了來自荷蘭3 家農(nóng)場的多份牛奶樣品，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自荷蘭的牛奶中可的松和氫化可的松含量平均值分別為112 ng/kg和235 ng/kg。在本課題組前期的研究中，測定了牛肉、雞肉等可食用肌肉組織中可的松和氫化可的松含量為0.3～14.7 μg/kg[19]。通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究測得的牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量水平與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)。

2.4 不同產(chǎn)地牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松含量水平

本研究對不同產(chǎn)地的牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量水平進(jìn)行了比較。188 份牛肉樣品的產(chǎn)地來自于安徽、北京、河北、黑龍江、湖南、內(nèi)蒙古、寧夏、山東、陜西、上海、四川、云南和浙江13 個(gè)省市自治區(qū)，其中安徽、北京、上海、河北、陜西和浙江6 產(chǎn)地的樣本量均小于10，不再納入統(tǒng)計(jì)分析。同樣的，158 份牛奶樣品也來自安徽、北京、廣東等12 個(gè)省市自治區(qū)，其中安徽、廣東、江蘇、河北、內(nèi)蒙古、寧夏以及天津產(chǎn)地的樣本量均小于10，不再納入統(tǒng)計(jì)分析。從圖2可以看出，不同產(chǎn)地牛肉樣品中可的松含量的平均值在0.29～3.44 μg/kg之間，中位數(shù)在0.02～2.87 μg/kg之間，氫化可的松含量平均值在5.94～0.33 μg/kg之間，中位數(shù)為5.58～16.68 μg/kg。不同產(chǎn)地牛奶中可的松含量平均值在0.13～0.32 μg/kg之間，中位數(shù)為0.15～0.31 μg/kg；氫化可的松含量平均值在0.43～1.07 μg/kg之間，中位數(shù)為0.46～1.06 μg/kg。從圖2可以看出，不同產(chǎn)地的牛肉、牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平存在一定差異，提示地理環(huán)境因素可能會對肉牛和乳牛的激素分泌產(chǎn)生影響。但是由于本研究不同產(chǎn)地的樣本數(shù)量不完全一致，且未考慮品種、牛齡、采樣時(shí)間等因素的影響，因此目標(biāo)化合物濃度水平與樣品產(chǎn)地的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

圖2 不同產(chǎn)地牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量分布Fig. 2 Distribution of cortisone and cortisol in beef and milk from different regions

2.5 可的松和氫化可的松含量相關(guān)性分析

利用相關(guān)性檢驗(yàn)考察樣品中2 種目標(biāo)化合物含量的相關(guān)性，計(jì)算2 種化合物含量的比值。分析結(jié)果顯示，牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量均呈顯著正相關(guān)（圖3），相關(guān)系數(shù)分別為0.735（P＜0.001）和0.809（P＜0.001）。牛肉中氫化可的松與可的松的含量比值范圍為1.0～44.5，平均值為8.58，中位數(shù)為7.05。牛奶中氫化可的松與可的松含量比值的范圍為1.1～25.4，平均值為4.33，中位數(shù)為3.40。上述結(jié)果表明，2 種內(nèi)源性激素在肉牛和乳牛體內(nèi)可能具有相同的合成、分泌和代謝途徑。

圖3 牛肉（A）和牛奶（B）中可的松和氫化可的松相關(guān)性Fig. 3 Correlations between cortisone and cortisol contents in beef (A) and milk (B)

3 結(jié) 論

本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法分析采自我國9 個(gè)省、市、自治區(qū)的346 份牛肉和牛奶樣品中可的松和氫化可的松的含量水平。在牛肉和牛奶樣品中可的松和氫化可的松普遍檢出，檢出率均超過80%，可的松和氫化可的松的含量水平均小于100 μg/kg，且存在一定的地域差異。牛肉中可的松和氫化可的松，以及牛奶中可的松含量呈非正態(tài)分布，中位值分別為1.14、8.14 μg/kg和0.23 μg/kg。牛奶中的氫化可的松含量呈正態(tài)分布，其含量平均值為（0.72±0.35） μg/kg。以含量的P95評估牛肉可的松和氫化可的松含量范圍分別為小于5.15 μg/kg和34.18 μg/kg，牛奶可的松和氫化可的松含量范圍分別為小于0.40 μg/kg和1.31 μg/kg。此外，相關(guān)性檢驗(yàn)分析結(jié)果表明牛肉和牛奶2 類樣品中可的松和氫化可的松的含量均呈顯著正相關(guān)，為食品中激素殘留的科學(xué)監(jiān)管提供了新思路。